本发明公开了一种纳米微球七聚体及其制备方法、应用,制备方法包括以下步骤:包括以下步骤:S1、将孔洞模板依次进行超声清洗和等离子体亲水处理,使模板表面具有亲水性;S2、将孔洞模板至于培养皿底部,依次加入纳米微球溶液和环己烷,再向水相中加入四甲基氯化铵溶液,有机相中加入十二烷硫醇,进行纳米微球的自组装过程;S3、静置蒸发,待液面没过孔洞模板,将孔洞模板垂直捞出,烘干后得到纳米微球薄膜;S4、移除孔洞模板上洞外的纳米微球,获纳米微球七聚体。通过本发明所述制备方法制备的纳米金七聚体能够产生Fano共振,获的金纳米颗粒相对致密,不仅能够用于SERS检测,且作为SERS基底对拉曼信号的增强效果比较好,进一步降低目标物的检测限。