本发明公开了一种斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法,属于生物实验技术领域。包括孔板本体,孔板本体上设有凹槽,凹槽内均固设有用于固定斑马鱼的固定槽,凹槽的上表面高于固定槽的上表面,孔板本体和固定槽均为透明材质。本发明的固定方法为,在固定槽中加入鱼麻醉剂和黏着剂,用吸管吸取出生3～5天的斑马鱼幼鱼,蛋白酶去卵膜,预麻醉后放入固定槽中,用尖头镊将斑马鱼幼鱼拨至两眼重合的侧卧位。本发明的固定装置可快速整体移动样品进行观测,实现高通量快速检测,兼容性好,还可用于宽场成像,能将斑马鱼幼鱼摆放的方向一致,在观察时便于寻找斑马鱼,夹持的精准度高,不会损伤幼鱼鱼体,检测准确,适用于固定所有出生3～5天的斑马鱼幼鱼。