阅读说明：本技术 一种斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法 (Zebra fish juvenile fish fixing device and fixing method thereof ) 是由 卢曼慧 柴艳兵 张耀广 李兴佳 李宏 杨晓燕 于 2021-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法,属于生物实验技术领域。包括孔板本体,孔板本体上设有凹槽,凹槽内均固设有用于固定斑马鱼的固定槽,凹槽的上表面高于固定槽的上表面,孔板本体和固定槽均为透明材质。本发明的固定方法为,在固定槽中加入鱼麻醉剂和黏着剂,用吸管吸取出生3～5天的斑马鱼幼鱼,蛋白酶去卵膜,预麻醉后放入固定槽中,用尖头镊将斑马鱼幼鱼拨至两眼重合的侧卧位。本发明的固定装置可快速整体移动样品进行观测,实现高通量快速检测,兼容性好,还可用于宽场成像,能将斑马鱼幼鱼摆放的方向一致,在观察时便于寻找斑马鱼,夹持的精准度高,不会损伤幼鱼鱼体,检测准确,适用于固定所有出生3～5天的斑马鱼幼鱼。(The invention discloses a zebra fish juvenile fish fixing device and a zebra fish juvenile fish fixing method, and belongs to the technical field of biological experiments. Including the orifice plate body, be equipped with the recess on the orifice plate body, all set firmly the fixed slot that is used for fixed zebra fish in the recess, the upper surface of recess is higher than the upper surface of fixed slot, and orifice plate body and fixed slot are transparent material. The fixing method comprises the steps of adding a fish anesthetic and an adhesive into a fixing groove, sucking the zebra fish juvenile fish born for 3-5 days by using a suction pipe, removing an egg membrane by using protease, placing the zebra fish juvenile fish into the fixing groove after pre-anesthesia, and pulling the zebra fish juvenile fish to a lateral position with two superposed eyes by using pointed forceps. The fixing device provided by the invention can be used for quickly moving the sample as a whole to observe, realizing high-flux quick detection, has good compatibility, can also be used for wide-field imaging, can be used for keeping the zebra fish juvenile fish in the same direction, is convenient to find the zebra fish during observation, has high clamping accuracy, can not damage the juvenile fish body, is accurate in detection, and is suitable for fixing all zebra fish juvenile fishes born for 3-5 days.)

一种斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法

技术领域

本发明属于生物实验

技术领域

，涉及一种斑马鱼幼鱼固定装置，还涉及一种斑马鱼幼鱼固定方法。

背景技术

斑马鱼作为一种小型脊椎类模式生物，基因与人类基因组的同源性高达87％，具有独特的生物特点和遗传学优势，并且具有饲养简单、繁殖周期短、胚胎透明、产卵量大且易收集等优点，在许多领域都得到了广泛的应用。

由于斑马鱼幼鱼整体透明，许多研究直接利用斑马鱼幼鱼进行活体观察。在实验过程中，实验人员一般采用麻醉剂将斑马鱼幼鱼麻醉，然后用吸管将其转移至甲基纤维素溶液中，再用针或镊子将斑马鱼幼鱼体位摆至两眼重合，最后进行观察拍摄。以上方法固定斑马鱼幼鱼的缺点是：1、由于斑马鱼幼鱼体型较小，一般只有2-3mm左右，且斑马鱼幼鱼游动速度较快，即使在阻力较大的甲基纤维素中也会游动，进而导致鱼体位置需要反复摆放，在此过程中不仅增大了实验人员的工作量，也可能造成幼鱼鱼体损伤，难以判别畸形结构是否为化合物导致，影响结果准确性；2、每组实验斑马鱼幼鱼数量较大，在实验过程中固定鱼体耗时耗力。

因此，亟需设计一种简单快速的斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法，提高实验效率，保证实验准确性。

发明内容

为解决现有技术中存在的以上不足，本发明旨在提供一种斑马鱼幼鱼固定装置，以达到可快速整体移动样品进行观测，高通量快速检测的目的；

本发明还要提供一种斑马鱼幼鱼固定方法，以达到固定过程中不会损伤幼鱼、提高检测准确性、快速固定斑马鱼幼鱼的目的。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种斑马鱼幼鱼固定装置，包括孔板本体，所述孔板本体上设有多个凹槽，每个凹槽内均固设有用于固定斑马鱼的固定槽，所述凹槽的上表面高于固定槽的上表面，所述孔板本体和固定槽均为透明材质。

作为对本发明的限定：所述凹槽设有八组，每组十二个，所述凹槽为圆柱形，其直径为6.5～7.0mm，深度为5.5mm，横向孔距和纵向孔距均为8.9～9.1mm。

作为对本发明的进一步限定：所述固定槽的两端为半圆形，且与凹槽的内壁相切，所述固定槽的两个侧板相互平行，所述固定槽的宽度为6.3～6.7mm，深度为4.8～5.2mm，所述固定槽底板的厚度为0.45～0.55mm。

作为对本发明的另一种限定：所述孔板本体的材质为透明亚克力或透明硅胶。

一种斑马鱼幼鱼固定方法，固定斑马鱼幼鱼时，按照以下方法顺序进行：

步骤一：选择出生3～5天的斑马鱼幼鱼，加入蛋白酶，去除未孵化出膜的斑马鱼幼鱼的卵膜；

步骤二：用吸管吸取斑马鱼幼鱼，并排出吸管内多余的水分，在吸管中放入鱼麻醉剂，预麻醉10～20s；

步骤三：取权利要求1～4所述的斑马鱼幼鱼固定装置，在固定槽中加入鱼麻醉剂和黏着剂，然后放入预麻醉后的斑马鱼幼鱼；

步骤四：用尖头镊将斑马鱼幼鱼拨至两眼重合的侧卧位，待黏着剂凝固即可进行后续观察。

作为对本发明黏着剂的限定：所述黏着剂的制备方法包括：以质量份数计，将0.2～0.3份的琼脂加入到100份的鱼麻醉剂溶液中，加热到90～100℃，形成浓度为0.2％～0.3％的溶液；在固定槽中放入斑马鱼幼鱼时，使鱼麻醉剂和琼脂的温度保持在28～32℃之间。

作为对本发明黏着剂另一种限定：以质量份数计，将0.2～0.3份的琼脂糖加入到100份的鱼麻醉剂溶液中，加热到90～100℃，形成浓度为0.2％～0.3％的溶液；将斑马鱼幼鱼放置在固定槽时，使鱼麻醉剂和琼脂糖的温度保持在28～32℃之间。

作为对本发明黏着剂第三种限定：所述黏着剂的制备方法包括：以质量份数计，将2～3份的甲基纤维素加入到100份的鱼麻醉剂溶液中，形成浓度为2％～3％的溶液。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果在于：

(1)本发明的固定装置能快速定向放置斑马鱼幼鱼，孔板本体上设有多个固定槽，从而可以采用多人合作的方式进行斑马鱼幼鱼的固定，因为多个固定槽均设置在孔板本体上，可快速整体移动样品进行观测，可实现高通量快速检测，兼容性好，还可用于宽场成像，配合绝大多数设备使用，通用性强，固定槽的上表面低于凹槽的上表面，当固定槽中的黏着剂溢出时，能将其收纳在凹槽中，防止黏着剂撒在孔板本体的表面，透明材质便于观察；

(2)本发明的凹槽的直径和孔距设置成规定的尺寸，方便与观察仪器适配，使观察仪器能一次性完全将九十六个孔卡住，提高观察效率，固定槽为细长的形状，在固定斑马鱼幼鱼时，按照要求顺着固定槽的长度方向固定，保证斑马鱼幼鱼固定的方向一致，方便观察，可在观察及拍摄过程节省寻找斑马鱼的时间；

(3)本发明斑马鱼放置方向为两眼重合的侧卧位，通过黏着剂凝固及鱼麻醉剂麻醉，实现长时间斑马鱼体内器官发育情况的静态观测以及心跳的动态观测，由于幼鱼被麻醉，因此，在固定时，夹持的精准度高，不会损伤幼鱼鱼体，增加了检测的准确性。

综上所述，本发明的固定装置可快速整体移动样品进行观测，实现高通量快速检测，兼容性好，还可用于宽场成像，固定斑马鱼幼鱼时，能将斑马鱼幼鱼摆放的方向一致，在观察时便于寻找斑马鱼，斑马鱼幼鱼能被完全固定，使夹持的精准度高，不会损伤幼鱼鱼体，检测准确，适用于固定所有出生3～5天的斑马鱼幼鱼。

附图说明

下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。

图1为本发明实施例1的俯视结构示意图；

图2为图1A-A剖面结构示意图；

图3为图1B-B剖面结构示意图。

图中：1-孔板本体，2-凹槽，3-固定槽，4-侧板，5-底板。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明。应当理解，此处所描述的一种斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法为优选实施例，仅用于说明和解释本发明，并不构成对本发明的限制。

实施例1一种斑马鱼幼鱼固定装置

本实施例如图1-图3所示，一种斑马鱼幼鱼固定装置，包括孔板本体1，所述孔板本体1上设有多个凹槽2，所述孔板本体1为透明的亚克力材质，也可以是透明的硅胶材质，所述孔板本体1为长方体，其厚度为9.0mm，所述凹槽2为向内凹陷的圆柱形，所述凹槽2的直径为6.5mm，向内凹陷的深度为5.5mm。所述孔板本体1上的凹槽2设有八组，每组十二个，即长度方向十二个，宽度方向八排，共九十六个。相邻两个凹槽2之间的孔距为9.0mm，即横向相邻之间的凹槽2孔间距为9.0mm，纵向相邻之间的凹槽2孔间距为9.0mm。

每个凹槽2内均固设有用于固定斑马鱼的固定槽3，所述凹槽2的上表面高于固定槽3的上表面，即整个固定槽3的都设于凹槽2的内部不外露。所述固定槽3的两端为半圆形，且与凹槽2的内壁相切，即固定槽3两端的半圆形外壁与凹槽2的内壁相切，通过粘合，固定在凹槽2内，所述固定槽3的两个侧板4相互平行，所述固定槽3两个平行的两个侧板4之间的距离为6.5mm，即宽度为6.5mm，其深度为5.0mm，所述固定槽3底板5的厚度为0.48mm。所述固定槽3的材质为透明的亚克力，也可以是透明的硅胶。

实施例2一种斑马鱼幼鱼固定装置

本实施例与实施例2的结构相同，不同的是各部分设置的尺寸参数，具体尺寸见表1：

表1各部分的尺寸参数表

实施例5一种斑马鱼幼鱼固定方法

一种斑马鱼幼鱼固定方法，准备实施例1-4中任意一种斑马鱼幼鱼固定装置，本实施例利用的是实施例1的斑马鱼幼鱼固定装置，固定斑马鱼幼鱼时，选择出生3～5天的斑马鱼幼鱼，加入蛋白酶，去除未孵化出膜的斑马鱼幼鱼的卵膜，观察斑马鱼幼鱼，待斑马鱼幼鱼未孵化出膜的斑马鱼幼鱼均孵化出膜后，用吸管吸取斑马鱼幼鱼，并排出吸管内多余的水分，在吸管中放入鱼麻醉剂，预麻醉14s。

在固定槽3中加入鱼麻醉剂和黏着剂，然后放入预麻醉后的斑马鱼幼鱼，用尖头镊将斑马鱼幼鱼拨至两眼重合的侧卧位，待黏着剂凝固即可进行后续观察。

所述黏着剂的制备方法为：将2g的琼脂加入到1000g的鱼麻醉剂溶液中，因为琼脂正常状态下为固态，所以需要加热到90℃，成为液态后与鱼麻醉剂进行混配，形成浓度为0.2％的溶液，在固定槽3中放入斑马鱼幼鱼时，使鱼麻醉剂和琼脂的温度保持在30℃之间，既不会对斑马鱼幼鱼造成伤害，琼脂的状态也能起到阻力的作用，便于固定斑马鱼幼鱼。

实施例6一种斑马鱼幼鱼固定方法

本实施例与实施例5的固定方法相同，不同的斑马鱼幼鱼在吸管中预麻醉的时间和黏着剂的制备方法，本实施例斑马鱼幼鱼在吸管中预麻醉的时间为15s，本实施例的黏着剂采用琼脂糖，其制备方法为：将2.5g的琼脂糖加入到1000g的鱼麻醉剂溶液中，因为琼脂糖正常状态下为固态，所以需要加热到97℃，成为液态后与鱼麻醉剂进行混配，形成浓度为0.25％的溶液，在固定槽3中放入斑马鱼幼鱼时，使鱼麻醉剂和琼脂糖的温度保持在31℃之间，既不会对斑马鱼幼鱼造成伤害，琼脂的状态也能起到阻力的作用，便于固定斑马鱼幼鱼。

实施例7一种斑马鱼幼鱼固定方法

本实施例与实施例5的固定方法相同，不同的斑马鱼幼鱼在吸管中预麻醉的时间和黏着剂的制备方法，本实施例斑马鱼幼鱼在吸管中预麻醉的时间为16s，本实施例的黏着剂采用甲基纤维素，其制备方法为：将20g的甲基纤维素加入到1000g的鱼麻醉剂溶液中，形成浓度为2％的溶液。

实施例8-15一种斑马鱼幼鱼固定方法

实施例与实施例5的固定方法相同，不同的是各项参数的设定，具体见表2：

表2

实施例16验证利用实施例5的固定方法斑马鱼幼鱼的损伤情况

随机选取192条出生3～5天的斑马鱼幼鱼，其中96条斑马鱼幼鱼放置在实施例1所述的斑马鱼幼鱼固定装置中，每个固定槽3中放一条，然后利用实施例5的固定方法固定斑马鱼幼鱼；剩下的96条斑马鱼幼鱼放置在普通的固定装置中，利用普通的固定方法固定斑马鱼幼鱼，在固定过程中，记录工作人员在固定斑马鱼幼鱼时，对其的损伤情况，经过统计后，记录在表2中：

表2固定斑马鱼幼鱼时的损伤情况

类别	损伤的斑马鱼幼鱼数量(只)	损伤率(％)
			利用实施例5的固定方法固定斑马鱼幼鱼	2	0.02
利用普通的固定方法固定斑马鱼幼鱼	11	0.11

由表2可知，利用本申请固定的斑马鱼幼鱼，损伤率小，后续的检测也会更加精确。