本发明公开一种高效率生产12-酮基胆酸的方法,包括以下步骤,(1)种子培养;(2)扩大培养:将步骤(1)所得摇瓶种子接种到发酵罐的液体培养基中进行发酵罐发酵,此过程包括第一阶段和第二阶段,第一阶段进行增殖发酵;第一阶段完成后进行第二阶段发酵,流加诱导物质溶液,同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水,并设置通气比为0.8-1.2,保持溶氧为15-25%,温度为25℃;(3)催化转化。本发明步骤(2)中,添加了吡格列酮作为氧化酶活化激动剂,显著提高12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活水平,最高可达1500~1700U/mL,前体物质的投入量从20g/L直接提高到300g/L,大幅提高前体物质的投料量,提高了生产效率。