一种高效率生产12-酮基胆酸的方法
阅读说明：本技术 一种高效率生产12-酮基胆酸的方法 (Method for efficiently producing 12-ketocholic acid ) 是由 程玲利 王婷婷 张翔 彭捷 黄清东 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种高效率生产12-酮基胆酸的方法,包括以下步骤,(1)种子培养；(2)扩大培养：将步骤(1)所得摇瓶种子接种到发酵罐的液体培养基中进行发酵罐发酵,此过程包括第一阶段和第二阶段,第一阶段进行增殖发酵；第一阶段完成后进行第二阶段发酵,流加诱导物质溶液,同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水,并设置通气比为0.8-1.2,保持溶氧为15-25%,温度为25℃；(3)催化转化。本发明步骤(2)中,添加了吡格列酮作为氧化酶活化激动剂,显著提高12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活水平,最高可达1500～1700U/mL,前体物质的投入量从20g/L直接提高到300g/L,大幅提高前体物质的投料量,提高了生产效率。(The invention discloses a method for efficiently producing 12-ketocholic acid, which comprises the following steps of (1) seed culture; (2) and (3) amplification culture: inoculating the shake flask seeds obtained in the step (1) into a liquid culture medium of a fermentation tank for fermentation in the fermentation tank, wherein the process comprises a first stage and a second stage, and the first stage is used for propagation fermentation; after the first stage is finished, performing second stage fermentation, feeding an inducing substance solution, and feeding a pioglitazone methanol solution and ammonia water at the same time, wherein the aeration ratio is set to be 0.8-1.2, the dissolved oxygen is kept at 15-25%, and the temperature is 25 ℃; (3) and (4) performing catalytic conversion. In the step (2), pioglitazone is added as an oxidase activation agonist, so that the enzyme activity level of 12 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase is remarkably improved to 1500-1700U/mL at most, the input amount of the precursor is directly increased to 300g/L from 20g/L, the feeding amount of the precursor is greatly increased, and the production efficiency is improved.)
技术领域
本发明属于生物与医药
技术领域
，具体涉及一种高效率生产12-酮基胆酸的方法。背景技术
申请号为202010458182.2的发明专利申请，公开了一种12-酮基胆酸的制备方法，具体包括如下步骤：（1）将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种按体积分数为2-6％的接种量接种到含LB液体培养基的生物培养容器中培养；（2）培养液溶解氧值低于60％时，流加诱导物质溶液；（3）诱导物质溶液流加完毕，培养菌菌体密度OD 600达到15且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量达到12U/mL时，流加前体物质，同时流加辅助物质，共计流加6h；（4）前体物质和辅助物质流加完毕后2h，检测胆酸浓度，浓度为0.3％时，结束培养。该发明方法在说明书第[0033]记载通过保证12α-羟基类固醇脱氢酶的动态稳定，来提高前体物质的投料量，从而提高12-酮基胆酸的生产效率，然而在生产过程中发现，虽然该方法能保证12α-羟基类固醇脱氢酶的动态稳定，但是总体酶活水平较低，因此该发明前体物质的投料量虽然有所增加，但是由于酶活水平的限制，生产效率依然较低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种12-酮基胆酸制备方法，本发明通过在诱导增殖培养过程中，流加吡格列酮甲醇溶液，提高酶活水平，从而大幅提高前体物质的加入量，提高了生产效率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高效率生产12-酮基胆酸制备方法，包括以下步骤：
（1）种子培养：将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种接种到摇瓶的液体培养基摇瓶中，保持温度37℃，40-60RH％，220rpm的摇床中培养8-12h，得到摇瓶种子；
（2）扩大培养：将步骤（1）所得摇瓶种子接种到发酵罐的液体培养基中进行发酵罐发酵，此过程包括第一阶段和第二阶段，第一阶段进行增殖发酵，设置通气比0.8，保持第一阶段的发酵液溶氧大于50%，且保持发酵温度为37℃，增殖发酵时间为四个小时内；第一阶段完成后进行第二阶段发酵，流加诱导物质溶液，同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水，并设置通气比为0.8-1.2，保持溶氧为15-25%，温度为25℃，所述诱导物质溶液中，按质量百分比包含乳酸0.1％、乳糖5％、甘油2％和消泡剂0.05％，以及0.01mmol/L的IPTG；
（3）催化转化：当培养菌菌体密度OD600大于25且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活大于25U/mL时，向发酵液中流加辅助物质溶液，一段时间后开始流加前体物质溶液，设置通气比为0.8-1.2，保持溶氧为30-50%，且保持发酵温度为25℃，pH8.2-8.5；所述前体物质溶液为40%胆酸和等胆酸摩尔当量的氢氧化钠，余量为水；所述辅助物质溶液包括浓度为0.01倍胆酸摩尔当量的核黄素和pH11的氢氧化钠溶液，余量为水；前体物质溶液和辅助物质溶液流加完毕1h后，开始间隙检测胆酸浓度，当胆酸浓度为小于等于0.3％时，结束培养。
上述方案中，步骤（2）中先进行第一阶段的增殖发酵，得到大量的12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌，再进行第二阶段的诱导增殖培养，得到12α-羟基类固醇脱氢酶，在第二阶段中，在流加诱导物质溶液的同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水，本发明中，通常情况下作为抗糖尿病药物的吡格列酮作为氧化酶活化激动剂；在第一阶段中，本发明缩短第一阶段的发酵时间，即缩短增殖发酵时间，将此阶段控制在四个小时内，因为在生产过程中发现，第一阶段的发酵时间超过四小时的情况下，在第二阶段得到的发酵液中，酶活水平低于第一阶段的发酵时间在四个小时以内，猜测可能的原因是，第一阶段的时间过长，此过程累积的发酵副产物过多，影响了吡格列酮的激活效果，因此在本发明中，结合物料添加以及发酵工艺之间的协同影响，确定第一阶段发酵时间在四个小时以内，最优为三到四个小时之间；第二阶段中流加的氨水补充氮源，流加吡格列酮甲醇溶液既补充了碳源，保证发酵过程中的碳源充足，且添加了吡格列酮作为氧化酶活化激动剂，即吡格列酮为12α-羟基类固醇脱氢酶的活化激动剂，显著提高12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活水平，最高可达1500~1700U/mL，由于酶活大大提高，因此在进行催化转化时，可以加入更多的前体物质，同时催化转化更多的前体物质，提高生产效率。
进一步的，所述诱导物质溶液中添加质量百分比浓度为2%的磷酸氢二钠。诱导增殖过程中不断有12α-羟基类固醇脱氢酶生成，但是由于12α-羟基类固醇脱氢酶不稳定，容易失活，在未添加磷酸氢二钠时，由于大量的12α-羟基类固醇脱氢酶在生成，此时宏观表现为酶活水平在一定时间内不断升高，由于未达到加入前体物质的水平，因此还不能加入前体物质进行催化转化，因此失活的12α-羟基类固醇脱氢酶则被浪费掉。为了降低12α-羟基类固醇脱氢酶的失活速率，在诱导物质溶液中添加了磷酸氢二钠，磷酸氢二钠混合在体系中，对12α-羟基类固醇脱氢酶作用，提高酶活稳定性，缩短了12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活大于25U/mL的时间。对12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活稳定性进行简单检测发现，未加磷酸氢二钠的12α-羟基类固醇脱氢酶需在2~8℃冷藏保存，且4~6h后不可避免的失活80%以上，而添加磷酸氢二钠的12α-羟基类固醇脱氢酶可在室温下保存14~16h，且酶活性保持在95%以上。这里提供了一种思路，即当需将12α-羟基类固醇脱氢酶进行保存时，可在其中加入磷酸氢二钠，从而延长保存时间。
进一步的，所述的液体培养基的制备方法为，将玉米浆干粉、酵母提取物、氯化钠和水配置成溶液，其中玉米浆干粉的浓度为10g/L，酵母提取物的浓度为5g/L，NaCl的浓度10g/L，首先，配置浓度为1g/L的碳酸氢钾溶液，取500mL的碳酸氢钾溶液加热到40-45℃后，将玉米浆干粉加入到加热后的碳酸氢钾溶液中，搅拌溶解，冷却至室温，然后加入酵母提取物和氯化钠，并水定容至1000mL，得到液体培养基。玉米浆干粉是一种以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成的营养物质，作为主要的氮源，常规方法利用玉米浆干粉配置液体培养基，市面多家玉米浆干粉号称能够完全溶解，但是在使用过程中发现并不能完全溶解，且不同厂家之间也存在较大差异，如果将液体培养基进行过滤，则丧失部分营养，而如果直接使用这种沉淀液体培养基，那么得到的摇瓶种子中不免混有沉淀杂质，在扩大培养时，将混有沉淀杂质的摇瓶种子接种到发酵罐培养基时，导致接种浓度偏低，且每一批生产随着玉米浆干粉的溶解情况不同，则各批次之间的接种浓度存在偏差，另外，如果液体培养基中存在沉淀杂质，则进行催化转化的指标“菌体密度OD600大于25”的真实OD600值则可能不足25，因此，玉米浆干粉不能完全溶于水中会造成多方面不稳定因素，最终导致工艺不稳定。为了解决这一问题，上述技术方案中，首先将玉米浆干粉溶于加热后的碳酸氢钾溶液中，碳酸氢钾溶液属弱碱性，且将其加热至40-45℃，在该条件下，玉米浆干粉有效溶解，避免了液体培养基对发酵过程造成的影响，稳定了工艺；且由于培养基中加入了碳酸氢钾，为大肠杆菌提供了钾离子，在诱导增殖培养过程中，钾离子对大肠杆菌合成的与乳糖代谢的酶有激活作用，提高了诱导物质溶液中的乳糖的利用率，且相比于碳酸氢钠，催化转化时间更短。
进一步的，所述氨水的质量百分比浓度为1%，所述吡格列酮甲醇溶液的浓度为0.3g/L。
进一步的，步骤（2）中，诱导物质溶液的流加时间为3-6h，吡格列酮甲醇溶液的流加时间为3h；诱导物质溶液的流加流量为20ml/(L*h)，吡格列酮甲醇溶液的流加流量为0.1ml/(L*h)；氨水的流加流量为5ml/(L*h)。
进一步的，步骤（3）中，辅助物质溶液的流加时间为3h，前体物质溶液流加时间为1h，前体物质溶液的流加流量为750ml/(L*h)，辅助物质溶液的流加流量为0.2ml/(L*h)。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）添加了吡格列酮作为氧化酶活化激动剂，即吡格列酮为12α-羟基类固醇脱氢酶的活化激动剂，显著提高12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活水平，最高可达1500~1700U/mL，前体物质的投入量从20g/L直接提高到300g/L（此处300g/L的体积为原发酵液体积，并非加入包含前体物质溶剂的总体积），大幅提高前体物质的投料量，提高了生产效率；
（2）本发明第一阶段的发酵时间限制在四小时内，一方面避免第一阶段时间过长而积累过多的发酵副产物影响吡格列酮的激活效果，另一方面一定程度缩短了增殖发酵时间，缩短了工艺周期，提高了生产效率；
（3）诱导物质溶液中添加质量百分比浓度为2%的磷酸氢二钠降低12α-羟基类固醇脱氢酶的失活速率，使得12α-羟基类固醇脱氢酶在常温下便能保存，且保存时间更长；
（4）本发明的液体培养基无沉淀，避免了液体培养基对发酵过程造成的影响；且液体培养基中的碳酸氢钾对与乳糖代谢的酶有激活作用，提高了诱导物质溶液中的乳糖的利用率。
附图说明
图1为生产系统；
图中：1-发酵罐，2-搅拌杆，3-排气管，4-平衡管，5-加料管，6-加料量杯，7-流量调节器，8-补气装置，9-进料管，10-空气管，11-液体无菌过滤器。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前体下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明使用下述生产系统：
如图1所示，该生产系统包括发酵罐1，发酵罐1内部设有搅拌杆2，发酵罐1顶部设有排气管3，排气管3顶端为排气口，排气口处设有排气阀门，排气管3中部与平衡管4连通，平衡管4的另一端与加料量杯6顶部连通，加料量杯6顶部设有加料管5，加料管5上设有液体无菌过滤器11，加料量杯6的出口端设有进料管9，该进料管9上设有流量调节器7，进料管9另一端与空气管10连通，空气管10一端与补气装置8相连，空气管10的另一端伸入发酵罐1内部底部。
该生产系统的工作过程：发酵液在发酵罐1中进行发酵，搅拌杆2对其进行搅拌；流加液体物料通过液体无菌过滤器11进入加料量杯6，加料量杯6与发酵罐1通过平衡管4保持压力平衡，流量调节器7调节流量，液体物料进入空气管10，部分溶剂挥发，物料和气体一起进入发酵罐1，与发酵罐1中的发酵液最大限度混合，同时，当排气管3的排气阀门关闭时，发酵罐1中挥发出的溶剂经平衡管4、加料量杯7、进料管9、空气管10，又回到发酵罐1中，即挥发的有机原料转化为气态补入，提高了有机原料的利用率。
本发明所用12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌的菌种与背景技术中的现有技术发明专利202010458182.2中的一样，来源于市购。
实施例1
制备液体培养基：将玉米浆干粉、酵母提取物、氯化钠和水配置成溶液，其中玉米浆干粉的浓度为10g/L，酵母提取物的浓度为5g/L，NaCl的浓度10g/L；具体制备为，首先，配置浓度为1g/L的碳酸氢钾溶液，取500mL的碳酸氢钾溶液加热到40-45℃后，将玉米浆干粉加入到加热后的碳酸氢钾溶液中，搅拌溶解，冷却至室温，然后加入酵母提取物和氯化钠，并水定容至1000mL，得到液体培养基。
实施例2
（1）种子培养：将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种接种到摇瓶的液体培养基摇瓶中，保持温度37℃，40-60RH％，220rpm的摇床中培养8h，得到摇瓶种子；
（2）扩大培养：将步骤（1）所得摇瓶种子接种到发酵罐的液体培养基中进行发酵罐发酵，此过程包括第一阶段和第二阶段，第一阶段进行增殖发酵，设置通气比0.8，保持第一阶段的发酵液溶氧大于50%，且保持发酵温度为37℃，增殖发酵时间为四个小时；第一阶段完成后进行第二阶段发酵，流加诱导物质溶液，同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水，并设置通气比为1.2，保持溶氧为15-25%，温度为25℃，所述诱导物质溶液中，按质量百分比包含乳酸0.1％、乳糖5％、甘油2％和消泡剂0.05％，以及0.01mmol/L的IPTG；所述氨水的质量百分比浓度为1%，所述吡格列酮甲醇溶液的浓度为0.3g/L；诱导物质溶液的流加时间为3-6h，吡格列酮甲醇溶液的流加时间为3h；诱导物质溶液的流加流量为20ml/(L*h)，吡格列酮甲醇溶液的流加流量为0.1ml/(L*h)；氨水的流加流量为5ml/(L*h)；
（3）催化转化：当培养菌菌体密度OD600大于25且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活大于25U/mL时，向1L发酵液中流加辅助物质溶液，20-30 min后开始流加前体物质溶液；
设置通气比为1.2，保持溶氧为30-50%，且保持发酵温度为25℃，pH8.2-8.5；前体物质溶液和辅助物质溶液均流加完毕1h后，开始间隙检测胆酸浓度，每二十分钟检测一次，当胆酸浓度为小于等于0.3％时，结束培养；所述前体物质溶液为40%胆酸和等胆酸摩尔当量的氢氧化钠，余量为水；所述辅助物质溶液包括浓度为0.01倍胆酸摩尔当量的核黄素和pH11的氢氧化钠溶液，余量为水；辅助物质溶液的流加时间为3h，前体物质溶液的流加时间为1h；前体物质溶液的流加流量为750ml/(L*h)，辅助物质溶液的流加流量为0.2ml/(L*h)。
本实施例中，使用的液体培养基为实施例1所制备的液体培养基。
另外，在培养菌菌体密度OD600大于25且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活大于25U/mL时，取出20mL12α-羟基类固醇脱氢酶，对其进行过陶瓷膜过滤粗提纯，将粗提纯后的酶液进行2~8℃冷藏密闭保存，四小时后酶失活50%以上，六小时后，酶失活80%以上。
本实施例中，1L发酵液中，前体物质的加入量为300g，而背景技术中所提到的现有技术的前体物质的投入量为20g。
实施例3
本实施例与实施例2的不同之处在于，本实施例在实施例2的基础上，在诱导物质溶液中添加质量百分比浓度为2%的磷酸氢二钠。
在进行步骤（3）催化转化时，开始流加前体物质溶液和辅助物质溶液的时间比实施例2约提前半个小时。
另外，将在培养菌菌体密度OD600大于25且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活大于25U/mL时，取出两份20mL12α-羟基类固醇脱氢酶，分别对其进行过陶瓷膜过滤粗提纯，将粗提纯后的酶液进行2~8℃冷藏密闭保存，一份保存六小时，一份保存十六小时，经检测保存六小时的酶液酶活性保持在98%以上，保存十六小时的酶液酶活性保持在80%以上。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于，本对比例在步骤（2）第二阶段发酵时，并未流加吡格列酮甲醇溶液。
在检测胆酸浓度过程中发现，当实施例2的胆酸浓度小于0.3%时，本对比例的胆酸浓度为9.3%，且本对比例的胆酸浓度小于0.3%时，比实施例2多花260分钟。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于，本对比例使用的液体培养基的制备方法为，将玉米浆干粉、酵母提取物、氯化钠和水配置成溶液，其中玉米浆干粉的浓度为10g/L，酵母提取物的浓度为5g/L，NaCl的浓度10g/L，将玉米浆干粉、酵母提取物和NaCl加入到900mL水中，充分溶解，然后定容至1000mL，然后过滤，得到液体培养基。
由于诱导物质溶液加入体系后，诱导物质溶液被稀释，乳糖的质量百分比下降，因此在对比实施例2和对比例2的乳糖利用率时，检测实施例2和对比例2流加前体物质前的体系的乳糖浓度，检测方法为现有的高效液相色谱检测法，并用相对值表示实施例2和对比例2之间的差异，检测结果实施例2的乳糖浓度相对于对比例2低23%。
对比例3
本对比例与实施例2的区别在于，本对比例的液体培养基的制备方法为：将玉米浆干粉、酵母提取物、氯化钠和水配置成溶液，其中玉米浆干粉的浓度为10g/L，酵母提取物的浓度为5g/L，NaCl的浓度10g/L；具体制备为，首先，配置浓度为1g/L的碳酸氢钠溶液，取500mL的碳酸氢钠溶液加热到40-45℃后，将玉米浆干粉加入到加热后的碳酸氢钠溶液中，搅拌溶解，冷却至室温，然后加入酵母提取物和氯化钠，并水定容至1000mL，得到液体培养基。
检测实施例2、对比例2和对比例3流加前体物质前的体系的乳糖浓度，检测方法为现有的高效液相色谱检测法，并用相对值表示实施例2、对比例2和对比例3之间的差异，检测结果实施例2的乳糖浓度相对于对比例2低23%，对比例3的乳糖浓度相对于对比例2低1%。
记录实施例2、对比例2和对比例3胆酸浓度小于0.3%的时间，其中实施例2的时间最短，对比例2和对比例3时间相当。
结合实施例2、对比例2和对比例3可知，乳糖的利用率更大程度是受钾离子影响，而非液体培养基的弱碱性；由于实施例2比对比例2和对比例3到达胆酸浓度小于0.3%的时间短，猜测可能的原因为碳酸氢钾在提高了乳酸利用率的同时，引起了其他作用，结合吡格列酮，提高了为12α-羟基类固醇脱氢酶的催化效果。
对比例4
（1）种子培养：将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种接种到摇瓶的液体培养基摇瓶中，保持温度37℃，40-60RH％，220rpm的摇床中培养8h，得到摇瓶种子；
（2）扩大培养：将步骤（1）所得摇瓶种子分成A组和B组，将A组和B组摇瓶种子分别接种到不同的发酵罐中的液体培养基进行发酵，A组第一阶段发酵六小时，B组第一阶段发酵四小时，其他条件相同：设置通气比0.8，保持第一阶段的发酵液溶氧大于50%，且保持发酵温度为37℃；第二阶段条件相同：第二阶段发酵10小时，流加诱导物质溶液，同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水，并设置通气比为1.2，保持溶氧为15-25%，温度为25℃，所述诱导物质溶液中，按质量百分比包含乳酸0.1％、乳糖5％、甘油2％和消泡剂0.05％，以及0.01mmol/L的IPTG；所述氨水的质量百分比浓度为1%，所述吡格列酮甲醇溶液的浓度为0.3g/L；（3）检测酶活：发酵完成后，分别取A组和B组的体系液体检测其酶活。
检测结果，A组的酶活为1521 U/mL，B组的酶活为1683 U/mL。