本发明涉及一种多亚基酶的表达优化及利用木质素单体生物合成高附加值化合物的方法,通过Golden gate克隆的方法,构建了pE1K-GcoAB-M3的RBS文库,通过研究库的生长速率,转化速率和酶的表达比例,粗酶液的酶活等筛选到文库G/C的RBS文库,菌株生长速率高,酶活也高。之后,将该RBS文库用于酶促反应途径构建,催化木质素单体化合物愈创木酚(guaiacol)以及连苯三酚(pyrogallol)生产高附加值的化合物如邻苯二酚、儿茶酚-O-硫酸盐、红倍酚。本发明利用构建的生物催化剂,通过生物转化实现了木质素来源的芳香化合物(愈创木酚和3-甲氧基邻苯二酚)的高效利用,首次构建了儿茶酚-O-硫酸盐和红倍酚的生物合成途径。