多亚基酶的表达优化用于木质素单体合成高附加值化合物
阅读说明：本技术 多亚基酶的表达优化用于木质素单体合成高附加值化合物 (Expression optimization of multi-subunit enzyme for synthesizing high value-added compound by using lignin monomer ) 是由 肖毅 于 2021-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种多亚基酶的表达优化及利用木质素单体生物合成高附加值化合物的方法,通过Golden gate克隆的方法,构建了pE1K-GcoAB-M3的RBS文库,通过研究库的生长速率,转化速率和酶的表达比例,粗酶液的酶活等筛选到文库G/C的RBS文库,菌株生长速率高,酶活也高。之后,将该RBS文库用于酶促反应途径构建,催化木质素单体化合物愈创木酚(guaiacol)以及连苯三酚(pyrogallol)生产高附加值的化合物如邻苯二酚、儿茶酚-O-硫酸盐、红倍酚。本发明利用构建的生物催化剂,通过生物转化实现了木质素来源的芳香化合物(愈创木酚和3-甲氧基邻苯二酚)的高效利用,首次构建了儿茶酚-O-硫酸盐和红倍酚的生物合成途径。(The invention relates to a method for expression optimization of multi-subunit enzyme and biosynthesis of a high value-added compound by utilizing a lignin monomer, wherein an RBS library of pE 1K-GcobA-M3 is constructed by a Golden gate cloning method, the RBS library of the library G/C is screened by researching the growth rate, the conversion rate, the expression ratio of the enzyme, the enzyme activity of crude enzyme liquid and the like of the library, the growth rate of a strain is high, and the enzyme activity is also high. Thereafter, the RBS library was used for enzymatic reaction pathway construction, catalyzing monolignol compounds guaiacol (guaiacol) and pyrogallol (pyrogallol) to produce high value-added compounds such as catechol, catechol-O-sulfate, and erythrophenol. The invention utilizes the constructed biocatalyst to realize the high-efficiency utilization of aromatic compounds (guaiacol and 3-methoxy catechol) from lignin through biotransformation, and constructs the biosynthesis route of catechol-O-sulfate and rhodophenol for the first time.)
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，涉及多亚基酶的表达优化用于木质素单体合成高附加值化合物。背景技术
鉴于石油、天然气等不可再生资源逐渐减少，因此可再生资源如木质素的开发与综合利用受到广泛关注。木质素是天然高分子化合物，广泛存在于高等植物细胞中，是自然界含量第二的生物质。木质素是由苯丙烷单元通过C-O-C和C-C键相连接，经过酶的催化脱氢聚合及自由基聚合反应而形成的天然芳香聚合物。先有观点认为，木质素结构单元主要包括：对羟苯基丙烷(p-Hydroxyphenyl propane/H)、愈创木基丙烷(Guaiacyl/G)和紫丁香基丙烷(Syringyl/S)。木质素通过热化学转化和生物转化后形成多样的芳香族化合物，且多数化合物还有甲基，需要经过微生物脱甲基后，形成邻苯二酚、原儿茶酸、3,4,5-三羟基苯甲酸等中间代谢物，才能进一步进入中心炭代谢和下游的高附加值产物生成，因此，对木质素来源的单体化合物进行脱甲基是木质素利用的重要环节。
已有不少研究通过改造微生物，建立细胞工厂，用于木质素的高效利用和高附加值化合物的生物炼制，如医药，生物燃料，食品和化工领域等。对微生物的遗传改造已经较为常见，但是在遗传改造过程中，由于对内源基因的改造和外源基因的插入会带来代谢流不平衡，生长迟缓，目标化合物的产量低。为解决代谢通量的不平衡，加快菌株优化和改善各种高价值生物基化学品的生产，多元模块代谢工程(multivariate modular metabolicengineering)，模块共培养工程(modular coculture engineering)以及时空和整合基因组等技术已经被广泛使用。以上技术，关注一条或多条代谢途径，聚焦于多种酶的表达调控，而对单一功能的多亚基酶少有关注。
该P450蛋白是一种多功能的酶，能催化多种木质素来源的单体化合物。O-脱甲基，由CYP255A家族的细胞色素P450蛋白(GcoA)和一个三域结构域组成还原酶(GcoB)组成。通过优化多组分O-脱甲基的酶双亚基GcoA和GcoB，研究其在细胞内的表达比例和酶活，以及生长速率等，为芳香族化合物的利用提供基础。
邻苯二酚(Catchol,1,2-benzenediol,以下简称CAT)又名儿茶酚,是一种可溶于水、乙醇、乙醚、苯、甲苯、氯仿,易溶于吡啶、碱性水溶液的白色晶状化合物。是一种重要的化工中间体,主要用于生产抗氧化剂、鞣剂、香料等。例如农药生产方面,用于合成乙霉威、残杀威、呋喃丹等；在医药合成方面,用它制备异丙苯肾上腺素和黄连素等。目前，邻苯二酚的工业化生产主要是化学合成法，以苯酚为原料，以强酸或双氧水等为催化剂，但存在反应条件苛刻、转化率低、副产物多且成分复杂、产物分离工艺复杂、环境污染严重等因素。
据文献(Production of Catechol from Benzoate by the Wild StrainRalstonia Species Ba-0323and Characterization of Its Catechol 1,2-Dioxygenase,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2014，65:9,1957-1964)报道，Ralstonia sp.Ba-0323可以转化苯甲酸钠，生成1.9mg/ml的邻苯二酚。
儿茶酚-O-硫酸盐是一种芳基硫酸盐，它是两个羟基之一被磺基取代的儿茶酚。它是芳基硫酸盐和酚类的成员。儿茶酚-O-硫酸盐可以通过以下方式促进心脏保护改善心肌细胞的搏动和Ca2+信号对β-肾上腺素能受体持续刺激的反应。
有关儿茶酚-O-硫酸盐的生物合成鲜有报道，仅有报道ASTB-OM2(芳基磺基转移酶B)酶催化儿茶酚，生成儿茶酚-O-硫酸盐(Loop engineering of aryl sulfotransferaseB for improving catalytic performance in regioselective sulfation，Catal.Sci.Technol.,2020,10,2369)。
红倍酚(Purpurogallin)是一种从坚果和橡树皮中提取的天然酚，具有强的黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)抑制活性，其IC为0.2μM。红倍酚具有抗氧化、抗癌和抗炎特性。黄嘌呤氧化酶是人类嘌呤分解代谢的终末酶，催化次黄嘌呤和黄嘌呤的氧化反应。这些反应生成尿酸和活性氧如超氧阴离子和过氧化氢。众所周知，痛风的发病是由于血尿酸的过度积累所致：这种过度积累被认为与饮食习惯有关，因此，尽管痛风是一种经典的疾病，但目前也被公认为是一种与生活方式有关的疾病，最近这种疾病的患者越来越多。心血管疾病是另一种与生活方式有关的疾病，众所周知与超氧阴离子、过氧化氢、一氧化氮及其代谢产物(羟自由基、过氧亚硝酸盐等)引起的氧化应激有关。因此，抑制黄嘌呤氧化酶的过度工作对预防此类生活方式相关疾病十分重要。红倍酚通过抑制LPS刺激的BV2小胶质细胞中IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达，抑制促炎细胞因子的产生。红倍酚通过抑制LPS刺激的BV2小胶质细胞磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和丝裂原活化蛋白激酶信号通路发挥抗炎作用。红倍酚通过直接靶向丝裂原活化蛋白激酶1/2(MEK1/2)信号通路抑制食管鳞状细胞癌。因此，红倍酚的合成具有重要意义。已有报的的红倍酚的合成则聚焦于化学法。
Francesco Ferlin等报道(Heterogeneous Manganese-Catalyzed Oxidase C-H/C-OCyclization to Access Pharmaceutically Active Compounds，ChemCatChem 2020,12,449–454)，以H2O2和O2和1mmol连苯三酚为反应试剂，以Mn8KO16为催化剂，可以生成0.94mmol的红倍酚。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，为了研究多亚基酶进行表达优化，提供了一种多亚基酶的表达优化用于木质素单体合成高附加值化合物的方法。
本发明通过Golden gate克隆的方法，构建了pE1K-GcoAB-M3的RBS文库，通过研究库的生长速率，转化速率和酶的表达比例，粗酶液的酶活等筛选到文库G/C的RBS文库，菌株生长速率高，酶活也高。之后，将该RBS文库用于酶促反应途径构建，催化木质素单体化合物愈创木酚(guaiacol)以及连苯三酚(pyrogallol)生产高附加值的化合物如邻苯二酚、儿茶酚-O-硫酸盐、红倍酚。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种多亚基酶的表达优化用于木质素单体合成高附加值化合物的方法，以木质素单体化合物为起始原料，通过生物催化剂合成高附加值化合物；
所述催化剂通过如下方法中的一种制得：
方法一：通过Golden gate的方法构建包含GcoA和GcoB的多亚基酶GcoAB的RBS文库，并转化到E.coli.其中，经筛选获得生物催化剂；
方法二、通过在E.coli中过表达方法一中筛选所得生物催化剂对应的基因GcoAB(RBS：G/C)和芳基磺基转移酶突变体ASTB-OM2(Q191Y/Y218W/L225V)获得生物催化剂；
方法三、通过在E.coli中过表达漆酶GoL3获得生物催化剂。
优选地，方法一制得的催化剂为E.coli(GcoAB；RBS:G/C)。
优选地，方法二制得的催化剂为E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)。
优选地，方法三制得的催化剂为E.coli(GoL3)。
优选地，所述E.coli(GcoAB；RBS:G/C)的获得方法为：通过Golden gate的方法构建包含GcoA和GcoB的多亚基酶GcoAB的RBS文库，GcoA和GcoB先转化到BL21中，形成pE1k-GcoAB-M3(RBS：N/N)，再通过测序获得了GcoAB的RBS library。其中，经筛选获得生物催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)。筛选所得GcoAB；RBS:G/C的基因序列为SEQ ID NO.1。
基因GcoA和GcoB来源于Amycolatopsis sp ATCC 39116，且基因GcoA和GcoB进行了密码子优化。筛选为通过比较GcoAB的RBS library的蛋白表达情况，指数期生长速率，转化愈创木酚速率和粗酶液酶活(图1，图2)，筛选到最好的生物催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)，该催化剂生长快，蛋白GcoA和GcoB表达量合适，转化速率快，粗酶液酶活高。
优选地，所述ASTB-OM2(Q191Y/Y218W/L225V)为来源于Desulfitobacteriumhafniens的芳基磺基转移酶的突变体。ASTB-OM2(Q191Y/Y218W/L225V)，是指跟野生型ASTB相比，ASTB-OM2的第191位的氨基酸由Glutamine(Q)突变为Tyrosine(Y)，第218位的氨基酸Tyrosine(Y)突变为Tryptophan(W)，第225位的Leucine(L)突变为Valine(V)。pB1c-ASTB-OM2的基因序列SEQ ID NO.2。
优选地，所述漆酶GoL3来源于Gramella forsetii KT0803。pB1c-GoL3的基因序列SEQ ID NO.3。
优选地，GcoA的RBS核心区序列为AGGGGG,GcoB的RBS核心区序列为AGGCGG。
优选地，所述E.coli(GoL3)的获得方法：合成质粒pB1c-GoL3,随后通过化学转化法在E.coli BL21中实现。
生物催化剂采用电转法制得，取2μL质粒，与100μL电转感受态BL21混合，转移到电击杯，1700V进行脉冲，立即添加900μL LB培养基，并转移到EP管中，之后于37℃180rpm/min培养1h后，取200μL菌液涂布于含有相应抗性的LB固体平板，37℃过夜培养，挑单克隆于含相应抗生素的LB试管中，37℃220rpm/min培养，即得到相应的生物催化剂。
优选地，所述木质素单体化合物包括愈创木酚或3-甲氧基邻苯二酚。
优选地，所述高附加值化合物包括邻苯二酚、儿茶酚-O-硫酸盐及红倍酚中的至少一种。
优选地，所述生物催化剂为E.coli(GcoAB；RBS:G/C)时，以愈创木酚为起始原料合成邻苯二酚。
优选地，所述生物催化剂为E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)时，以愈创木酚为起始原料，合成儿茶酚-O-硫酸盐。
优选地，所述生物催化剂为E.coli(GoL3)时，以3-甲氧基邻苯二酚为起始原料合成红倍酚。
优选地，所述生物催化剂为E.coli(GoL3)和E.coli(GcoAB；RBS:G/C)联用时，以3-甲氧基邻苯二酚为起始原料合成红倍酚。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明通过分子克隆手段，构建GcoAB文库，优化双组分GcoA和GcoB的表达，得到转化速率高、生长速率快、酶活好的RBS组合，获得了最适的生物催化剂，可以快速催化愈创木酚和3-甲氧基邻苯二酚的脱甲基反应。
(2)本发明利用构建的生物催化剂，通过生物转化实现了木质素来源的芳香化合物(愈创木酚和3-甲氧基邻苯二酚)的高效利用，首次构建了儿茶酚-O-硫酸盐和红倍酚的生物合成途径。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为GcoAB的核糖体文库(RBS library)示意图、生长速率和蛋白比例；其中a为GcoAB的核糖体文库(RBS library)pE1k-GcoAB-M3示意图；b为GcoA和GcoB催化愈创木酚形成邻苯二酚示意图；c为GcoAB的核糖体文库(RBS library)中，GcoA和GcoB的蛋白表达的SDS-PAGE图；d为GcoAB的核糖体文库(RBS library)中，GcoA和GcoB蛋白表达的摩尔比；e为GcoAB的核糖体文库(RBS library)在指数期生长速率的热力图，左侧是指未添加愈创木酚情况下，右侧为添加愈创木酚；
图2为GcoAB的核糖体文库(RBS library)的转化速率和邻苯二酚合成；
其中a为GcoAB的核糖体文库(RBS library)的愈创木酚转化速率；b为GcoAB的核糖体文库(RBS library)粗酶液的酶活；c为催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)转化愈创木酚生成邻苯二酚；
图3为多次添加催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)和愈创木酚生产邻苯二酚；
图4为儿茶酚-O-硫酸盐合成结果图及质谱图：a为E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)催化愈创木酚生成儿茶酚-O-硫酸盐示意图；b为E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)催化愈创木酚生成儿茶酚-O-硫酸盐；c产物和儿茶酚-O-硫酸盐标品质谱图；
图5为具有转化连苯三酚生成红倍酚的生物催化剂筛选和最适pH优化；其中a为比较3种生物催化剂是否具有生产红倍酚的活力；b为生物催化剂E.coli(GoL3)催化连苯三酚生成红倍酚的转化率；
图6为红倍酚合成示意图、结果图及质谱图；其中a为红倍酚生成示意图，生物催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)和E.coli(GoL3)催化3-甲氧基邻苯二酚生成红倍酚；b为生物催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)催化3-甲氧基邻苯二酚生成连苯三酚；c为红倍酚生产；d样品和红倍酚标品质谱图；
图7为总图,显示了生物催化剂用于生产邻苯二酚，儿茶酚-O-硫酸盐和红倍酚。a为GcoA和GcoB催化愈创木酚形成邻苯二酚示意图；b为E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)催化愈创木酚生成儿茶酚-O-硫酸盐；c为红倍酚生成示意图，生物催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)和E.coli(GoL3)催化3-甲氧基邻苯二酚生成红倍酚。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
以下实施例的方法包括：
步骤一，构建多亚基酶GcoAB的核糖体文库(RBS library)，获得转化效率高、生长速率快、酶活高的E.coli(GcoAB；RBS:G/C)生物催化剂，以愈创木酚为底物生产邻苯二酚；
步骤二，改造大肠杆菌获得高效的生物催化剂E.coli(GcoAB-ASTB-OM2),以愈创木酚为起始原料，添加对硝基苯硫酸盐作为磺基供体，成功合成了儿茶酚-O-硫酸盐；
步骤三，从多种漆酶筛选，改造大肠杆菌首次获得的生物催化剂E.coli(GoL3)并联合E.coli(GcoAB；RBS:G/C)催化剂，以3-甲氧基邻苯二酚为原料，成功合成了红倍酚；
所述的获得方法
步骤一中，所述生物催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)的构建通过Golden gate克隆的方法，构建GcoA和GcoB的核糖体文库(RBS library)，筛选获得最优的RBS组合，用于催化愈创木酚生产邻苯二酚；
步骤二中，所述生物催化剂E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)的构建，通过在E.coli中过表达GcoAB(RBS：G/C)和来源于Desulfitobacterium hafniens的芳基磺基转移酶突变体ASTB-OM2(Q191Y/Y218W/L225V)实现，用于催化愈创木酚合成儿茶酚-O-硫酸盐；
步骤三中，所述生物催化剂E.coli(GoL3)、E.coli(Spr-CotA)和E.coli(Bsu-CotA)等通过在E.coli中过表达来源于Gramella forsetii KT0803的漆酶GoL3，来源于Streptomyces pristinaespiralis ATCC25486的漆酶Spr-CotA，来源于Bacillussubtilis的漆酶Bsu-CotA实现。之后通过筛选，获得具有漆酶活力的生物催化剂，进一步导入GcoAB(RBS:G/C)用于红倍酚的合成。
实施例1
(1)E.coli(GcoAB；RBS:G/C)生物催化剂的获取及邻苯二酚的生产(构建示意图如图1、图2所示)。
采用Golden gate克隆的方法，构建GcoA和GcoB的核糖体文库(RBS library)，转化导入BL21中，筛选获得E.coli(GcoAB；RBS:G/C)生物催化剂。具体方构建法如下：
从公司合成密码子优化的GcoA和GcoB,通过Golden gate方法，连接到pE1k-RFP，并转化到BL21中，形成pE1k-GcoAB-M3(RBS：N/N)，其中pE1k-RFP基因序列为SEQ ID NO.6，N代表简并碱基A,T,C,G。通过测序获得pE1k-GcoAB-M3(RBS：N/N)的所有RBS组合，简称为GcoAB的RBS library,比较所有RBS转化效率、生长速率、酶活的，获得最优的E.coli(pE1k-GcoAB-M3；RBS:G/C)生物催化剂，通过比较GcoAB的RBS library的蛋白表达情况，指数期生长速率，转化愈创木酚速率和粗酶液酶活(图1，图2)，筛选到最好的生物催化剂E.coli(GcoAB；RBS:G/C)，该催化剂生长快，蛋白GcoA和GcoB表达量合适，转化速率快，粗酶液酶活高。该催化剂可以通过一次添加底物或多次添加底物愈创木酚，生产邻苯二酚。
(2)生物转化合成邻苯二酚(合成示意图如图2、图3所示)
将筛选到的生物催化剂E.coli(pE1k-GcoAB-M3,RBS:G/C)接种到3ml LB中进行活化，37℃，12-16h后，按比例1:100将活化后的生物催化剂转接到100mL LB中，待OD600达到0.6时，加入终浓度0.2mM IPTG诱导剂和辅因子100mg/L 5氨基乙酰丙酸和200mg/L柠檬酸铵铁(III)，37℃下诱导4h后，8000rpm/min离心3min，收集菌体，重悬浮于M9Y培养基中至OD600＝40.0，添加终浓度愈创木酚10mM，10g/L葡萄糖，37℃转化1h，可以获得8.41mM邻苯二酚，转化率为84.1％。或将离心收集的菌体重悬浮至OD＝10.0，多次添加菌体和3mM的愈创木酚生产18.0mM邻苯二酚,转化率62.96％。
实施例2
(1)构建生物催化剂合成儿茶酚-O-硫酸盐
由金唯智合成质粒pB1c-ASTB-OM2,并与实施例1筛选得到的pE1k-GcoAB-M3(RBS:G/C)共同转化BL21，得到生物催化剂E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)。
(2)生物转化合成儿茶酚-O-硫酸盐(合成示意图如图4所示)
将生物催化剂E.coli(GcoAB-ASTB-OM2)接种到3ml LB中进行活化，37℃，12-16h后，按比例1:100将活化后的生物催化剂转接到100mL LB中，待OD600达到0.6时，加入终浓度0.2mM IPTG诱导剂和辅因子100mg/L 5-氨基乙酰丙酸(GcoA)和200mg/L柠檬酸铵铁(III)，25℃下诱导4h后，8000rpm/min离心3min，收集菌体，重悬浮于M9Y培养基中至OD＝40.0，添加终浓度愈创木酚10mM，10mM对硝基苯硫酸盐,10g/L葡萄糖，25℃转化24h，可以获得2.21mM儿茶酚-O-硫酸盐，转化率为22.1％。
实施例3
(1)构建生物催化剂合成红倍酚(合成示意图如图5所示)
合成质粒pB1c-GoL3,pB1c-Spr-CotA,pB1c-Bsu-CotA并转化BL21，获得生物催化剂E.coli(GoL3)、E.coli(Spr-CotA)和E.coli(Bsu-CotA)。pB1c-Spr-CotA基因序列为SEQID NO.4。pB1c-Bsu-CotA的基因序列为SEQ ID NO.5。将生物催化剂E.coli(GoL3)、E.coli(Spr-CotA)和E.coli(Bsu-CotA)分别接种到3ml LB中进行活化，37℃，12-16h后，按比例2:100将活化后的生物催化剂转接到100mL LB5中，待OD600达到0.5时，加入终浓度1mM IPTG诱导剂和0.25mM CuCl2,，25℃100rpm/min下诱导4h后,转速调为0，诱导20h，收集菌体，重悬浮于M9Y培养基中至OD＝40.0，添加终浓度连苯三酚2.5mM，37℃转化0.5h，仅有E.coli(GoL3)具有催化连苯三酚生成红倍酚的活力，转化率为10.6％。
(2)生物转化合成红倍酚(合成示意图如图6、7所示)
将生物催化剂E.coli(GoL3)接种到3ml LB中进行活化，37℃，12-16h后，按比例2:100将活化后的生物催化剂转接到100mL LB5中，待OD600达到0.5时，加入终浓度1mM IPTG诱导剂和0.25mM Cucl2,25℃100rpm/min下诱导4h后,转速调为0，诱导20h，8000rpm/min离心3min，收集菌体，重悬浮于M9Y培养基中至OD＝40.0。
将筛选到的生物催化剂E.coli(GcoAB,RBS:G/C)接种到3ml LB中进行活化，37℃，12-16h后，按比例1:100将活化后的生物催化剂转接到100mL LB中，待OD600达到0.6时，加入终浓度0.2mM IPTG诱导剂和辅因子100mg/L 5-氨基乙酰丙酸(GcoA)和200mg/L柠檬酸铵铁(III)，37℃下诱导4h后，8000rpm/min离心3min，收集菌体，重悬浮于M9Y培养基中至OD＝40.0，10g/L葡萄糖，添加终浓度5mM 3-甲氧基邻苯二酚，37℃转化1.5h，之后添加上述所得体积OD＝40.0的生物催化剂E.coli(GoL3)离心后的菌体，转化率为100％，最高可成产0.35mM红倍酚，产率为14％。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 多亚基酶的表达优化用于木质素单体合成高附加值化合物
<130> KAG47745
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5805
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacgtcgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa 60
gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat 120
gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg 180
aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg 240
gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc 300
ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc 360
agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac 420
aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat 480
gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac 540
cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag 600
catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc 660
tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg 720
atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg 780
ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc 840
gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga 900
tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat 960
tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg 1020
gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc 1080
aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 1140
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agcgcgaatt 1200
gatctggttt gacagcttat catcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca 1260
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gcagttccag tacggttcca aagcttacgt taaacacccg gctgacatcc cggactacct 1740
gaaactgtcc ttcccggaag gtttcaaatg ggaacgtgtt atgaacttcg aagacggtgg 1800
tgttgttacc gttacccagg actcctccct gcaagacggt gagttcatct acaaagttaa 1860
actgcgtggt accaacttcc cgtccgacgg tccggttatg cagaaaaaaa ccatgggttg 1920
ggaagcttcc accgaacgta tgtacccgga agacggtgct ctgaaaggtg aaatcaaaat 1980
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aattcc 4206