本发明提供一种3-甾酮-Δ～(1)-脱氢酶及其编码基因和应用,提供了含有其基因的表达载体和含有该表达载体的基因工程重组菌株。本发明提供的3-甾酮-Δ～(1)-脱氢酶为一种新的3-甾酮-Δ～(1)-脱氢酶,该酶具有宽广的底物谱,对大多数3-酮基甾体化合物具有高的活性。本发明提供的重组菌株可用于转化3-酮基甾体化合物,以高底物投料浓度,获得高收率的目标产物,无副产物,转化率不低于94％,而且转化时间短,所用生物催化剂用量少,制备方法简单方便、条件温和、环境友好,具有很好的产业化前景。

本发明涉及一种经基因修饰的细菌及其工业应用,特别是在类固醇的1,2-脱氢中。

本发明设计羟基类固醇脱氢酶,具体涉及7β羟基类固醇脱氢酶突变体。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,是将野生型7β羟基类固醇脱氢酶的第181位缬氨酸、189位苏氨酸、207位的缬氨酸分别替换为半胱氨酸、缬氨酸、半胱氨酸。突变体的酶活是野生型的2.59倍,热稳定性是野生型的5倍,且酶催化的转化率能够达到99.9％,作为酶法制备熊去氧胆酸的关键酶,表现了极具工业化应用价值的特性。

本发明公开一种高效率生产12-酮基胆酸的方法,包括以下步骤,(1)种子培养；(2)扩大培养：将步骤(1)所得摇瓶种子接种到发酵罐的液体培养基中进行发酵罐发酵,此过程包括第一阶段和第二阶段,第一阶段进行增殖发酵；第一阶段完成后进行第二阶段发酵,流加诱导物质溶液,同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水,并设置通气比为0.8-1.2,保持溶氧为15-25%,温度为25℃；(3)催化转化。本发明步骤(2)中,添加了吡格列酮作为氧化酶活化激动剂,显著提高12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活水平,最高可达1500～1700U/mL,前体物质的投入量从20g/L直接提高到300g/L,大幅提高前体物质的投料量,提高了生产效率。