一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物及其制备方法和应用 (Aflatoxin molecularly imprinted polymer and preparation method and application thereof ) 是由 潘浣钰 黄寿辉 闵曼 孙蕙 何建雄 李丰 郝燕娟 陈晓强 赖飞龙 毓志超 于 2021-07-14 设计创作，主要内容包括：一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物及其制备方法和应用。本发明公开了一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法,包括以下：步骤1,将苏木精作为模板分子与功能单体、乙腈混合,超声处理,加入交联剂和引发剂,得到第一混合物,模板分子：功能单体：交联剂的摩尔质量为1:6～8:30,对第一混合物进行氮气吹扫,进行聚合反应,离心分离得到产物；步骤2,用甲醇洗涤产物,除去未反应的功能单体,用洗涤剂除去苏木精,得到黄曲霉毒素分子印迹聚合物。本发明的制备方法得到的分子印迹聚合物具有易制备、性质稳定、成本低、效率高和对黄曲霉毒素特异性识别能力的优点,有利于推广应用于对中药、食品中黄曲霉毒素含量的检测,提高对中药、食品的食用安全保障。(An aflatoxin molecularly imprinted polymer and a preparation method and application thereof. The invention discloses a preparation method of an aflatoxin molecularly imprinted polymer, which comprises the following steps: step 1, taking hematoxylin as a template molecule, mixing the hematoxylin with a functional monomer and acetonitrile, carrying out ultrasonic treatment, and adding a cross-linking agent and an initiator to obtain a first mixture, wherein the template molecule: functional monomer: the molar mass of the cross-linking agent is 1: 6-8: 30, nitrogen purging is carried out on the first mixture, polymerization reaction is carried out, and centrifugal separation is carried out to obtain a product; and 2, washing the product with methanol to remove unreacted functional monomers, and removing hematoxylin with a detergent to obtain the aflatoxin molecularly imprinted polymer. The molecularly imprinted polymer obtained by the preparation method has the advantages of easiness in preparation, stable property, low cost, high efficiency and capability of specifically identifying aflatoxin, is favorable for popularization and application in detection of aflatoxin content in traditional Chinese medicines and foods, and improves edible safety guarantee of the traditional Chinese medicines and the foods.)
技术领域
本发明涉及高分子材料技术领域，特别是涉及一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的一类化学结构相似的二呋喃香豆素代谢产物。在发霉的农作物如玉米、花生、小麦、大米、大豆都有这种物质。目前已经分离出30多种黄曲霉毒素，其中B1、B2、 G1、G2及两种代谢产物M1和M2比较常见。其中黄曲霉毒素B1于1993 年被国际癌症研究机构(IARC)列为第一类致癌物质。其诱导肝细胞癌的毒性是氰化钾的10倍，是二甲基亚硝胺的75倍。通过对各种食品和动物饲料的污染，黄曲霉毒素可能会给人类带来严重的健康问题。因此黄曲霉毒素对食品的污染问题日益受到人们的关注。
如何从复杂的食品样品中快速、准确、有效的分离黄曲霉毒素已成为食品安全检测的重要问题。针对黄曲霉毒素的检测有几种广泛使用的方法，包括薄层色谱法(TLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱、高效液相色谱-质谱法(LC-MS)、电化学传感器。但往往在检测前需要富集目标物质，同时要排除杂质的干扰，防止杂质存在对检测的灵敏度造成影响。最常用的方法是对样本采用免疫亲和柱预处理，这一过程包括药物提取、离心、过滤和免疫亲和柱层析法。过程操作复杂，且免疫亲和柱不稳定，价格相对昂贵，且吸附性能易受有机溶剂、pH值和温度的影响，基本是一次性使用，极大地限制了对黄曲霉毒素检测的普及。
分子印迹技术为黄曲霉毒素的快速提取和检测提供了新的途径，通过该技术制备的分子印迹聚合物(MIP)，因制备简单，且耐高温、酸碱并可重复使用，从而大大降低了使用成本。将其运用于固相萃取柱中则可取代免疫亲和柱，也可作为识别原件用于可在线检测、重复使用的生物传感器。由于黄曲霉毒素毒性大，且价格昂贵，本身用作模板分子会导致实验成本高，并给操作人员带来潜在的危险，所以在实际制备中通需要使用与其结构类似物作为虚拟模板来合成印迹聚合物，以达到降低对实验人员的伤害，同时也避免了模板分子的渗漏。现有技术常用的黄曲霉毒素的虚拟模板为5，7-二甲氧基香豆素，但是以5，7-二甲氧基香豆素作为虚拟模板制备得到的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素的吸附效率较低。因此需要开发廉价的虚拟模板分子替代毒性大、昂贵的黄曲霉毒素，并制备得到对黄曲霉毒素吸附效果较好地分子印迹化合物，应用于对食品中黄曲霉毒素进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物及其制备方法和应用。
根据本发明的一个方面，提供了一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将苏木精作为模板分子与功能单体、乙腈混合，超声处理，加入交联剂和引发剂，得到第一混合物，其中模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1:6～8:30，对第一混合物进行氮气吹扫，在一定温度下进行聚合反应，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用甲醇洗涤产物，除去未反应的功能单体，然后用洗涤剂除去苏木精，得到黄曲霉毒素分子印迹聚合物，洗涤剂为甲醇与乙酸的混合溶液。
本发明的有益效果：本发明以苏木精作为模板分子，采用本体聚合法，将苏木精与功能单体两者充分混合发挥作用，再加入交联剂和引发剂引发聚合，最后去除未反应单体和苏木精，制备得到分子印迹聚合物，制备过程中苏木精与功能单体、交联剂的摩尔比直接影响到分子印迹聚合物对黄曲霉毒素的特异性及吸附能力，本发明中以苏木精与功能单体、交联剂的摩尔比为 1：6～8：30的比例制备得到的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1具有较好地特异性吸附效果，因此本发明的用苏木精替代黄曲霉毒素B1作为模板分子制备的黄曲霉毒素分子印迹聚合物及其制备方法，解决了黄曲霉毒素作为模板分子价格昂贵、毒性大、实验成本高、对操作人员不安全、易造成模板分子渗漏、除去困难等问题，制备得到的分子印迹聚合物具有易制备、性质稳定、成本低、效率高和对黄曲霉毒素特异性识别能力的优点，有利于推广应用于对中药、食品中黄曲霉毒素含量的检测，提高对中药、食品的食用安全保障。
在一些实施方式中，一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将苏木精作为模板分子与功能单体、30-50ml乙腈混合，超声处理10-20min，加入交联剂和引发剂，得到第一混合物，其中模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1：8：30，对第一混合物进行氮气吹扫 10-20min，在一定温度下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物，功能单体为甲基丙烯酸或丙烯酰胺中的一种，引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异戊腈中的一种；
步骤2，用20-40ml甲醇洗涤产物，除去未反应的功能单体，然后用洗涤剂除去苏木精，得到黄曲霉毒素分子印迹聚合物，洗涤剂为甲醇与乙酸的混合溶液。本制备方法中，苏木精与功能单体、交联剂的摩尔比优选为1： 8：30，在此比例条件下，制备得到的分子印迹聚合物，对黄曲霉毒素B1 的特异性吸附效果最好，吸附量最高。
在一些实施方式中，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为乙二醇二甲醇丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。甲基丙烯酸的分子内除具有一个碳碳双键外，还具有一个羧基，可以和模板分子苏木精的羟基发生氢键作用；乙二醇二甲醇丙烯酸酯的分子内具有两个乙烯基团，在聚合反应中可以形成三维网状结构，从而使聚合物在去除模板分子后形成的空腔形状固定，实现对黄曲霉毒素的特异性吸附。
在一些实施方式中，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。该洗涤剂可以很好地除去产物中的模板分子苏木精。
在一些实施方式中，制备得到的黄曲霉毒素分子印迹聚合物用于对中药、食品中的黄曲霉毒素含量进行测定。制备得到的黄曲霉毒素分子印迹聚合物对黄曲霉毒素具有较高的特异性吸附效果，可以将其应用于对中药、食品中的黄曲霉毒素含量进行测定，提高对中药、食品的食用安全保障。
在一些实施方式中，中药包括药材及中药制剂。黄曲霉毒素分子印迹聚合物可以对药材及中药制剂中的黄曲霉毒素含量进行测定。
在一些实施方式中，利用黄曲霉毒素分子印迹聚合物测定中药、食品中的黄曲霉毒素含量的检测方法，包括以下：
步骤a，分子印迹-固相萃取柱制备：
取洁净空的SPE小柱，底部放入聚四氟乙烯垫片，加入黄曲霉毒素分子印迹聚合物作为填料，使其在柱内均匀分布，在填料顶部再压入聚四氟乙烯垫片，用来固定填料，得到分子印迹-固相萃取柱；
步骤b，待测样液制备：
将待测样品粉碎、过筛，取待测样品粉末15g，置于均质瓶中，加入第一提取剂75ml，超声振荡提取30分钟，使用定性滤纸过滤，收集滤液，量取滤液15ml，置于50ml容量瓶中，加入2.5mL水，再加入体积分数60％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，得到样品提取液，所述样品提取液中甲醇与水的体积比为3:2，所述第一提取剂是体积分数70％的甲醇水溶液；
将分子印迹-固相萃取柱连接到固相萃取装置，向柱内加入活化剂，浸泡冲洗小柱，活化填料；填料活化后，取一定量样品提取液使其以1.0ml/min 的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱剂分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30秒，收集洗脱液，得到待测样液；
步骤c，对照品梯度待测溶液制备：
量取1.0μg/ml黄曲霉毒素B1标准品溶液适量，用70％甲醇溶液稀释，得到含黄曲霉毒素B1浓度为0.12～10.0ng/ml的对照品梯度溶液；
分别取各浓度的对照品梯度溶液3.0ml，以1.0ml/min的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱液分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30 秒，收集洗脱液，得到对照品梯度待测溶液；
步骤d，进行高效液相色谱-串联质谱法检测：
吸取上述对照品梯度待测溶液各5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以黄曲霉毒素B1含量浓度为横坐标，绘制标准曲线；另吸取上述待测样液5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算得到样品提取液中相当于黄曲霉毒素B1的浓度，然后计算得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。步骤b中将黄曲霉毒素分子印迹聚合物作为固相萃取柱填料使用，利用分子印迹聚合物对黄曲霉毒素的特异性吸附作用，吸附萃取待测样品中含有的黄曲霉毒素，对待测样品中含有的黄曲霉毒素进行有效提取，保证了检测结果的准确性，并且具有制备简单、耐高温、耐酸碱、可重复使用，大大降低了成本，取代免疫亲和柱的优点，同时解决了现有检测方法中操作过程复杂、免疫亲和柱不稳定、价格昂贵、吸附性能受有机溶剂、pH值和温度影响等问题。
在一些实施方式中，步骤d中液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相：A相：10mmol/L醋酸铵溶液；B相：甲醇，柱温：25℃，流速：0.3ml/min，梯度洗脱，梯度洗脱方式如表1所示：
表1
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～4.5 65→15 35→85 4.5～6 15→0 85→100 6～6.5 0→65 100→35 6.5～10 65 35
在一些实施方式中，步骤d中质谱检测条件为：电喷雾离子源，采集模式为正离子模式，目标物相应的保留时间、监测离子对及电压参数如表2 所示：
表2
在一些实施方式中，步骤b中活化剂为甲醇，洗脱剂为甲醇，步骤c 中对照品梯度浓度溶液中黄曲霉毒素B1的浓度依次为：0.12ng/ml、 0.25ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml。
附图说明
图1为本发明的一种实施方式的一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法的以苏木精为模板分子的黄曲霉毒素分子印迹聚合物的红外谱图。
图2为本发明的一种实施方式的一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法的空白分子印迹聚合物的红外谱图。
图3为本发明的一种实施方式的以模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1:8:15、1:8:20、1:8:30制备得到的以苏木精为模板分子的系列分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附量柱状图。
图4为本发明的一种实施方式的以模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1:6:30、1:8:30、1:10:30、1:12:30制备得到的以苏木精为模板分子的系列分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附量柱状图。
图5为本发明的一种实施方式的在以甲醇与水体积比为3：2的吸附溶剂条件下不同黄曲霉毒素分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的热力学实验图。
图6为本发明的一种实施方式的利用黄曲霉毒素分子印迹聚合物测定中药、食品中的黄曲霉毒素含量的检测方法的黄曲霉毒素B1的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例中黄曲霉毒素B1标准品选择青岛普瑞邦生物工程有限公司供应的黄曲霉毒素B1标准品，醋酸铵选择安耐吉化学有限公司供应的分析纯醋酸铵，甲醇选择安耐吉化学有限公司供应的分析纯甲醇，乙酸安耐吉化学有限公司供应的分析纯乙酸，甲基丙烯酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的化学纯甲基丙烯酸，乙二醇二甲醇丙烯酸酯选择上海阿拉丁生化科技股份有限公司供应的乙二醇二甲醇丙烯酸酯，偶氮二异丁腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯偶氮二异丁腈，偶氮二异戊腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的98％的偶氮二异戊腈，丙烯酰胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的化学纯丙烯酰胺，乙腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的化学纯乙腈；
5，7-二甲氧基香豆素由3，5-二甲氧基苯酚与丙炔酸乙酯在四氟硼酸银的催化下经环化反应制备得到，反应式如下：
以下实施例2-8均采用本实施例1中的试剂。
实施例2
本发明的一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下：
步骤1，将0.2mmol苏木精作为模板分子与1.6mmol甲基丙烯酸、40ml 乙腈混合，超声处理15min，然后加入6mmol乙二醇二甲醇丙烯酸酯和 0.072mmol偶氮二异丁腈，得到第一混合物，其中苏木精：甲基丙烯酸：乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比为1：8：30，对第一混合物进行氮气吹扫 15min，在65℃温度条件下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用30ml甲醇洗涤产物，除去未反应的甲基丙烯酸，然后用洗涤剂除去苏木精，得到黄曲霉毒素分子印迹聚合物，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。对制备得到黄曲霉毒素分子印迹聚合物进行傅里叶变换红外光谱仪分析，得到该黄曲霉毒素分子印迹聚合物的红外谱图，见说明书附图1。通过比较说明书附图1与附图2，可以直接看出，该以苏木精为模板分子制备得到的黄曲霉毒素分子印迹聚合物在2900-3000之间出现明显振动峰，在1700-1800之间出现强信号峰，表明有苏木精与甲基丙烯酸以氢键作用聚合后，将苏木精洗脱后使得聚合物产生孔洞，裸露在外面的官能团个数增加，使羰基和烷烃的吸收振动峰增强。
步骤1和步骤2的反应过程如下：
本实施例的制备方法以苏木精作为模板分子，采用本体聚合法，将苏木精与功能单体甲基丙烯酸两者充分混合发挥作用，再加入交联剂乙二醇二甲醇丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈引发聚合反应，最后去除未反应的功能单体甲基丙烯酸和苏木精，制备得到分子印迹聚合物，制备过程中苏木精与甲基丙烯酸、乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比直接影响到分子印迹聚合物对黄曲霉毒素的特异性及吸附能力，本实施例中以苏木精与功能单体、交联剂的摩尔比为1：8：30的比例制备得到的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1具有较好地特异性吸附效果。聚合反应中甲基丙烯酸的分子内除具有一个碳碳双键外，还具有一个羧基，可以和模板分子苏木精的羟基发生反应形成氢键；乙二醇二甲基丙烯酸酯的分子内具有两个乙烯基团，在聚合反应中可以形成三维网状结构，从而使聚合物在去除苏木精后形成的空腔形状稳定，便于对黄曲霉毒素进行吸附。
实施例3
本发明的一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下：
步骤1，将0.2mmol苏木精作为模板分子与1.2mmol甲基丙烯酸、30ml 乙腈混合，超声处理10min，然后加入6mmol乙二醇二甲醇丙烯酸酯和 0.072mmol偶氮二异丁腈，得到第一混合物，其中苏木精：甲基丙烯酸：乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比为1：6：30，对第一混合物进行氮气吹扫 10min，在65℃温度条件下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用20ml甲醇洗涤产物，除去未反应的甲基丙烯酸，然后用洗涤剂除去苏木精，得到黄曲霉毒素分子印迹聚合物，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。
实施例4
本发明的一种黄曲霉毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下：
步骤1，将0.2mmol苏木精作为模板分子与1.4mmol甲基丙烯酸、50ml 乙腈混合，超声处理20min，然后加入6mmol乙二醇二甲醇丙烯酸酯和 0.072mmol偶氮二异丁腈，得到第一混合物，其中苏木精：甲基丙烯酸：乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比为1：7：30，对第一混合物进行氮气吹扫 20min，在65℃温度条件下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用40ml甲醇洗涤产物，除去未反应的甲基丙烯酸，然后用洗涤剂除去苏木精，得到黄曲霉毒素分子印迹聚合物，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。
实施例5
模板分子、功能单体与交联剂的不同摩尔比例对黄曲霉毒素分子印记迹聚合物的吸附性能的影响：
本实施例中以苏木精作为模板分子，以模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1:6:30、1:8:30、1:10:30、1:12:30、1:8:15、1:8:20，采用实施例2 中的制备方法合成，制备得到一系列以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物。
利用甲醇将黄曲霉毒素B1标准品配置成浓度梯度为100、75、50、25、 12.5ppm的标样溶液，通过高效液相色谱仪-荧光检测仪绘制黄曲霉毒素B1 标准浓度曲线，得到标准曲线y＝0.016462x+2.23839，R2＝0.989571。
使用甲醇与水的体积比为3：2的混合溶液作为吸附溶液，配制浓度为 50ppm的黄曲霉毒素B1溶液，向50ppm黄曲霉毒素B1溶液中分别对应加入10mg的一系列以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物，吸附1小时后，用高效液相色谱仪-荧光检测仪测定吸附后黄曲霉毒素B1溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，根据吸附前后浓度的变化，计算得到该一系列以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附量Q，具体吸附量件下表 3及说明书附图3、附图4，计算公式如下：
Q＝(C1-C2)V/M
Q：吸附量，ug/mg
C1：吸附前浓度，ug/mL
C2：吸附后浓度，ug/mL
M：聚合物质量，mg
表3一系列以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1 的吸附量
由上表3、说明书附图3和附图4，可以直接得出，以模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比1:6～8:30，制备得到的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素 B1的吸附量较高，优于其他摩尔比例制备得到的分子印迹聚合物，因此本发明的制备方法，优选的模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1:6～8:30，最优选的摩尔比为1:8:30。
实施例6
不同模板分子的黄曲霉毒素分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附条件试验：
本实施例中以5，7-二甲氧基香豆素、苏木精分别作为模板分子，以不加入模板分子为空白对照，采用实施例2中的制备方法合成，制备得到以5， 7-二甲氧基香豆素为模板分子的分子印迹聚合物7、以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物8、空白分子印迹聚合物。对制备得到的空白分子印迹聚合物进行傅里叶变换红外光谱仪分析，得到该空白分子印迹聚合物的红外谱图，见说明书附图2。
利用甲醇将黄曲霉毒素B1配置成浓度梯度为100、75、50、25、12.5ppm 的标样溶液，通过高效液相色谱仪-荧光检测仪绘制黄曲霉毒素B1标准浓度曲线，得到标准曲线y＝0.016462x+2.23839，R2＝0.989571。
使用甲醇作为吸附溶液1、甲醇与水的体积比为3：2的混合溶液作为吸附溶液2，分别配制浓度为20ppm的黄曲霉毒素B1溶液，向20ppm黄曲霉毒素B1溶液中对应加入10mg分子印迹聚合物7、分子印迹聚合物8和空白分子印迹聚合物，吸附1小时后，用高效液相色谱仪-荧光检测仪检测吸附后的黄曲霉毒素B1溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，并参照实施例5中的吸附量计算公式，根据吸附前后浓度的变化，计算得到分子印迹聚合物7、分子印迹聚合物8和空白分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附量，结果见下表4。
表4不同模板分子制备的分子印迹聚合物在不同吸附溶剂条件下对黄曲霉毒素B1的吸附量
从表4可以直接得出，对于同样的分子印迹聚合物，吸附溶剂的配比会影响分子印迹聚合物对黄曲霉毒素的吸附效果。在吸附溶液2(甲醇：水的体积比＝3:2)的吸附条件下，以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物8对于 20ppm的黄曲霉毒素B1溶液中的黄曲霉毒素B1的吸附量为0.577μg/mg，高于在吸附溶液1条件下的吸附量，以5，7-二甲氧基香豆素为模板分子的分子印迹聚合物7和空白分子印迹聚合物在吸附溶液1下的吸附量也均小于吸附溶液2条件下的吸附量，因此，本发明的应用中采用甲醇与水的体积比为3:2作为吸附溶剂，以提高以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素的吸附效果，保证后续检测的准确性。在同样吸附溶液2的条件下，分子印迹聚合物8的吸附量比分子印迹聚合物7的吸附量提高了28.79％，比空白分子印迹聚合物的吸附量提高了20.71％。
实施例7
不同模板分子的黄曲霉毒素分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附性能实验：
本实施例以实施例6中制备得到的三种不同的黄曲霉毒素分子印迹聚合物为实验对象，即以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物8、空白分子印迹聚合物。分别配制两组浓度梯度为3、5、10、20、30、50、70、90ppm 的黄曲霉毒素梯度溶液，向两组黄曲霉毒素梯度溶液中对应加入10mg分子印迹聚合物8和空白分子印迹聚合物，吸附1小时后，用高效液相色谱仪- 荧光检测仪测定吸附后两组黄曲霉毒素梯度溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，并参照实施例5中的吸附量计算公式，根据吸附前后浓度的变化，计算得到分子印迹聚合物8和空白分子印迹聚合物对黄曲霉毒素梯度溶液中黄曲霉毒素B1的吸附量，见下表5及说明书附图5，计算公式如下：
表5不同模板分子制备的分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附性能
根据表5和说明书附图5可以得出，在相同的吸附溶液条件下，以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物8对于5ppm-90ppm的黄曲霉毒素梯度溶液中的黄曲霉毒素B1的吸附量，高于空白分子印迹聚合物的吸附量，说明以苏木精为模板分子的分子印迹聚合物8对黄曲霉毒素B1的吸附性能，高于空白分子印迹聚合物对黄曲霉毒素B1的吸附性能，其中在50ppm-70ppm的黄曲霉毒素溶液中，分子印迹聚合物8对黄曲霉毒素B1的吸附量达到较高水平，与空白分子印迹聚合物的吸附量相比，分别提高了10.59％、8.75％、 27.79％。
实施例8
利用实施例2中制备得到的以苏木精为模板分子的黄曲霉毒素分子印迹聚合物测定中药、食品中的黄曲霉毒素含量的检测方法，包括以下：
步骤a，分子印迹-固相萃取柱制备：
取洁净空的SPE小柱，底部放入聚四氟乙烯垫片，加入0.1g黄曲霉毒素分子印迹聚合物作为填料，使其在柱内均匀分布，在填料顶部再压入聚四氟乙烯垫片，用来固定填料，得到分子印迹-固相萃取柱；
步骤b，待测样液制备：
取中药药材、中药制剂或食品中的一种作为待测样品，将待测样品粉碎、过二号筛，称取待测样品粉末15g，置于均质瓶中，加入第一提取剂75ml，超声振荡提取30分钟，使用定性滤纸过滤，收集滤液，量取滤液15ml，置于50ml容量瓶中，加入2.5mL水，再加入体积分数60％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，得到样品提取液，样品提取液中甲醇与水的体积比为3:2，第一提取剂是体积分数70％的甲醇水溶液；
该步骤中使用体积分数为70％的甲醇水溶液作为第一提取剂，对从待测样品粉末中提取黄曲霉毒素效果较好，向滤液中加入一定量的水和体积分数60％甲醇水溶液，将样品提取液中甲醇与水的体积比调整为3:2，为后续操作中分子印迹聚合物吸附样品提取液中的黄曲霉毒素提供最佳的吸附条件，便于分子印迹聚合物吸附样品提取液中的黄曲霉毒素；
将分子印迹-固相萃取柱连接到固相萃取装置，向柱内加入3.0ml甲醇，浸泡冲洗小柱，活化填料；填料活化后，取3.0ml样品提取液使其以1.0ml/min 的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml甲醇分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30秒，收集洗脱液，得到待测样液；
步骤c，对照品梯度待测溶液制备：
量取1.0μg/ml黄曲霉毒素B1标准品溶液适量，用70％甲醇溶液稀释，得到含黄曲霉毒素B1浓度为0.12ng/ml、0.25ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、 5.0ng/ml、10.0ng/ml的对照品梯度溶液；
分别取各浓度的对照品梯度溶液3.0ml，以1.0ml/min的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱液分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30 秒，收集洗脱液，得到对照品梯度待测溶液；
步骤d，进行高效液相色谱-串联质谱法检测：
液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相：A相：10mmol/L醋酸铵溶液；B相：甲醇，柱温：25℃，流速： 0.3ml/min，梯度洗脱，梯度洗脱方式如表6所示：
表6
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～4.5 65→15 35→85 4.5～6 15→0 85→100 6～6.5 0→65 100→35 6.5～10 65 35
质谱检测条件为：电喷雾离子源，采集模式为正离子模式，目标物相应的保留时间、监测离子对及电压参数如表7所示：
表7
吸取上述对照品梯度待测溶液各5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以黄曲霉毒素B1含量浓度为横坐标，绘制标准曲线见说明书附图6，得到标准曲线方程为：
y＝10814.336790x-183.813198，R2＝0.9983；另吸取上述待测样液5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算得到样品提取液中相当于黄曲霉毒素B1的浓度，然后计算得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。
本实施例的检测方法对中药、食品中黄曲霉毒素的检出限为0.25g/kg，对中药、食品中黄曲霉毒素含量的检测准确性高，对黄曲霉毒素进行特异性吸附，对待测样品中的黄曲霉毒素进行有效提取，保证了检测结果的准确性，并且具有制备简单、耐高温、耐酸碱、可重复使用，大大降低了成本，取代免疫亲和柱的优点，同时解决了现有检测方法中操作过程复杂、免疫亲和柱不稳定、价格昂贵、吸附性能受有机溶剂、pH值和温度影响等问题。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。