一种酿酒酵母y12及其在纯麦威士忌原酒酿造中的应用
阅读说明：本技术 一种酿酒酵母y12及其在纯麦威士忌原酒酿造中的应用 (Saccharomyces cerevisiae Y12 and application thereof in brewing of pure wheat whisky wine base ) 是由 宿智新 陈申习 杨强 林斌 唐洁 李锐 朱丽萍 于 2021-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酿酒酵母Y12及其在纯麦威士忌原酒酿造中的应用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y12保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2021年4月2日,保藏编号为CCTCC NO：M2021320。酿酒酵母Y12分离自劲牌有限公司白酒酒曲,与商业酵母相比,Y12表现出不逊色于商业酵母的发酵能力,酒体具有更低的杂醇油和总酯含量,尤其是杂醇油,含量为3.80g/L,分别比杂醇油含量最高和最低的商业酵母低约42.2％和11.2％。将该酵母应用于纯麦威士忌原酒酿造中,杂醇油含量仅3.17g/L,且酿造的纯麦威士忌原酒香气纯正,风格典型,具备良好的商业化应用潜力,可用于纯麦威士忌原酒的酿造。(The invention discloses saccharomyces cerevisiae Y12 and application thereof in brewing pure wheat whisky wine base. Saccharomyces cerevisiae Y12 is preserved in China center for type culture Collection with the preservation date of 2021, 4 months and 2 days, and the preservation number is CCTCC NO: m2021320. Saccharomyces cerevisiae Y12 was isolated from a white spirit koji from Tokyo limited and, compared to commercial yeasts, Y12 showed comparable fermentability to commercial yeasts, with a lower fusel oil and total ester content, especially fusel oil, of 3.80g/L, about 42.2% and 11.2% lower than the commercial yeasts with the highest and lowest fusel oil content, respectively. The yeast is applied to brewing of pure wheat whisky base wine, the fusel oil content is only 3.17g/L, and the brewed pure wheat whisky base wine has pure fragrance, typical style and good commercial application potential, and can be used for brewing of pure wheat whisky base wine.)
技术领域
本发明涉及一种微生物发酵领域，具体涉及一种酿酒酵母菌株及其在纯麦威士忌原酒酿造中的应用。
背景技术
威士忌是世界著名的优质蒸馏酒之一，是以谷物(包括大麦芽)为原料，经糖化、发酵、蒸馏、橡木桶熟成、勾兑而成的蒸馏酒，其中，只用大麦作原料酿制而成的蒸馏酒称为纯麦威士忌，一般不直接销售，而是作为勾兑混合威士忌酒时的原酒使用。
酵母作为威士忌生产的三要素之一，会给威士忌增添不同的风味。在威士忌原酒的发酵过程中，酿酒酵母起着决定性作用，它将底物中绝大部分糖转化为酒精和二氧化碳，并产生一些如酸、醛、酯和高级醇等副产物。这些物质都会直接影响威士忌原酒的品质和风味，决定了威士忌原酒的质量。因此，酵母是影响威士忌原酒品质和风味的关键因素之一。
目前，我国还没有知名的威士忌国产品牌，产品也没有形成鲜明独特的风格特征，酵母也基本都使用进口商业酵母。使用商业酵母不仅成本高，依赖于他人，还导致产品同质化。因此，使用具有自主知识产权的专用酿酒酵母，发挥其优良品质，凸显中国本土威士忌的风格特征，对促进我国威士忌产业的发展具有非常重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种自白酒酒曲中筛选的发酵性能好、产酒率高的酿酒酵母及其在纯麦芽威士忌原酒酿造中的应用，弥补我国市场上威士忌对应的本土酿酒酵母选择的不足。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，名称为Y12，属于酿酒酵母属(Saccharomyces)，分离自劲牌有限公司白酒酒曲，保藏于中国典型培养物保藏中心(以下简称酿酒酵母Y12)，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年4月2 日，保藏编号为CCTCC NO：M2021320。
本发明还提供了采用上述酿酒酵母发酵大麦芽原料，得到纯麦威士忌原酒的应用，包括以下步骤：
(1)麦芽粉碎
将大麦芽用高速粉碎机粉碎，控制谷壳：粗粒：细粉比例约为2:7:1；
(2)糖化
糖化水用乳酸调节pH后70℃预热按麦芽与水质量体积比为1:3.5加入到粉碎的大麦芽中，搅拌混匀后置于63-66℃恒温水浴60-90min，冷却后用无妨纱布压滤，向滤渣中加入1.2倍70℃糖化水，继续置于63-66℃恒温水浴 10-30min，冷却后用无妨纱布压滤，将两次过滤的滤汁混合匀得到糖化汁；
(3)酵母种子液制备
将酿酒酵母Y12菌株接种于10mL YPD液体培养基，30℃，150rpm培养24h后，按2％接种量接种于200mL麦芽汁培养基，30℃，150rpm培养 24h作为发酵种子液；
(4)发酵
取步骤(2)中的糖化汁于发酵桶中，将步骤(3)中培养好的种子液按 2％接种量接种于发酵桶，控制发酵温度在28-30℃，发酵2-3d。
(5)蒸馏
将步骤(4)中的发酵醪装入蒸馏器进行蒸馏，接取40％发酵醪体积的蒸馏液，转入蒸馏器进行复蒸，取10％发酵醪体积的蒸馏液即得到威士忌原酒。
本发明提供的酿酒酵母Y12可用于酿造纯麦芽威士忌原酒。利用酿酒酵母Y12酿造的威士忌原酒的优点在于：酿酒酵母Y12表现出不逊色于商业酵母的发酵能力，酒体具有更低的杂醇油和总酯含量，尤其是杂醇油，含量为 3.80g/L，分别比杂醇油含量最高和最低的商业酵母低约42.2％和11.2％。将该酵母应用于纯麦威士忌原酒酿造中，杂醇油含量仅3.17g/L，且酿造的纯麦威士忌原酒香气纯正，风格典型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是酵母菌株初筛二氧化碳失重情况；
图2是酿酒酵母Y12的菌落宏观形态；
图3是酿酒酵母Y12在不同乙醇浓度下的生长情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，名称为Y12，属于酵母属(Saccharomyces)，分离自劲牌有限公司白酒酒曲，保藏于中国典型培养物保藏中心(以下简称酿酒酵母Y12)，保藏日期为2021年4月2日，保藏编号为CCTCC NO：M2021320。
以下实施例中涉及的培养基配方如下：
(1)YPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基中加入琼脂20g/L。121℃灭菌20min。
(2)WL鉴别培养基：
储液A：称取磷酸二氢钾5.5g、氯化钾4.25g、氯化钙1.25g、硫酸镁 1.25g，溶解后定容至400mL；
储液B：称取氯化铁0.25g、硫酸锰0.25g，溶解后定容至100mL；
储液C：称取0.44g溴甲酚绿溶于10mL水和10mL酒精中；
酵母浸粉0.4％、蛋白胨0.5％、葡萄糖5％、琼脂2％，储液A40mL/1000 mL、储液B1mL/l000 mL，用稀HCl调节pH为6.5，121℃灭菌20min，加储液C1mL/1000mL，即得WL琼脂培养基。121℃灭菌20min。
(3)麦芽汁培养基：
每升糖化水加0.3mL乳酸调节pH，70℃预热后按麦芽与水质量体积比为 1:3.5加入到粉碎的大麦芽中，搅拌均匀后置于66℃恒温水浴90min，迅速冷却后采用无妨纱布压滤，向滤渣中加入1.2倍70℃糖化水，继续置于66℃恒温水浴10min，迅速冷却后采用无妨纱布压滤，将两次滤汁混合即为麦芽汁培养基。
实施例1酿酒酵母Y12的初步筛选及鉴定
(1)菌株的分离和筛选
称取酒曲1g，溶于盛有99mL无菌生理盐水，充分振荡摇匀后吸取1mL 依次稀释102-105倍，然后从各稀释梯度取100μL涂布于WL鉴别培养基， 30℃培养3-5d，待长出菌落，再用YPD固体培养基划线纯化，直至得到纯培养物。
(2)菌株的初筛
将步骤(1)中筛选得到的76株酵母菌株接种于50mL麦芽汁培养基，装上杜氏管，采用二氧化碳失重法检测菌株的发酵力。检测结果如图1，酿酒酵母Y12失重最高，为2.92g，初步判定菌株Y12为筛选的目的菌株。
(3)酿酒酵母Y12菌种分子鉴定及菌落形态
将筛选出的酿酒酵母Y12进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物扩增菌株的18sRNA，经凝胶电泳检测，PCR产物测序由北京华大基因生物技术有限公司完成。测序序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站进行Blast比对，确定菌种的属种，结果鉴定为酿酒酵母。测序结果参见后附的序列表。
采用WL鉴别培养基观察酿酒酵母Y12的菌落形态，如图2，其菌落圆形，呈乳白色，表面光滑有光泽，菌落凸起，直径约4mm。
表1酿酒酵母Y12的测序结果
实施例2酿酒酵母Y12和商业酿酒酵母小型酿酒比较试验
将酿酒酵母Y12和5株商业酵母接种于100mL麦芽汁培养基，30℃，150 rpm培养24h后作为种子液。按2％接种量将种子液接种于1L麦芽汁培养基，装上杜氏管，30℃静置发酵48h后，发酵醪经过二次蒸馏获得威士忌原酒酒样。通过气相色谱法(GC)对酒样中杂醇油(异丁醇、异戊醇)含量进行检测，根据GB/T 11857-2008对酒样的总酸、总酯及总醛含量进行测定，测定结果如表2所示，杂醇油、总酸、总酯及总醛含量结果均按100％乙醇浓度折算。
表2酵母菌株小型酿酒酒样指标比较
小型酿酒试验结果显示，酿酒酵母Y12的发酵性能稳定，各项指标也符合GB/T11857-2008对威士忌酒相关指标的要求。测试菌株Y12酒样乙醇含量达到了商业酵母的水平；总酸和总醛含量在商业酵母中偏高，较于商业酵母未显示出优势；杂醇油和总酯含量分别仅为3.80g/L和0.26g/L，低于所有对照商业酵母，尤其是杂醇油，分别比杂醇油含量最高和最低的商业酵母低约42.2％和11.2％。在小型酿酒试验中，酿酒酵母Y12表现出不逊色于商业酵母的发酵产酒能力，总酸和总醛含量达到商业酵母的水平，并且在杂醇油和总酯方面表现更优于商业酵母。
实施例3酵母菌株的耐乙醇测试
威士忌酵母一般为高产酒精酵母，发酵产酒率高，发酵醪中乙醇浓度较高。高浓度乙醇会影响酵母细胞生长代谢，能使酵母停滞生长甚至死亡，是制约酵母的重要胁迫因素。只有适应高乙醇浓度条件，发酵活动才能顺利进行。因此，对酿酒酵母Y12菌株进行了乙醇耐受性测试，具体如下：
挑取一环酵母菌体接种于5mL YPD液体培养基中，30℃，150rpm培养 24h后，按2％接种量接种至含不同浓度乙醇的YPD液体培养基中，培养基中乙醇浓度分别为：6％、8％、10％、12％、14％、16％(v/v)，30℃培养48 h，利用分光光度计在波长600nm处测定菌体浓度，测试结果见图3。
从图3可知，随着乙醇浓度的增加，各酵母的生长受到抑制，当乙醇浓度不高于10％时，乙醇对酵母生长抑制不明显，当乙醇浓度超过10％时，酵母生长受抑制明显，由此说明酿酒酵母Y12与各商业酵母一样，最大耐乙醇浓度均达到10％，而且受抑制程要弱于商业酵母。威士忌原酒发酵过程中发酵醪的乙醇浓度一般为6-10％，因此酿酒酵母Y12完全能够耐受发酵过程中乙醇含量的增加。
实施例4酿酒酵母Y12在酿造纯麦威士忌原酒中的应用
一种用上述酿酒酵母酿造纯麦威士忌原酒的方法，包括以下步骤：
(1)麦芽粉碎
将大麦芽用高速粉碎机粉碎，控制谷壳：粗粒：细粉比例为2:7:1；
(2)糖化
糖化水用乳酸调节pH后70℃预热按麦芽与水质量体积比为1:3.5加入到粉碎的大麦芽中，搅拌混匀后置于63-66℃恒温水浴60-90min，冷却后用无妨纱布压滤，向滤渣中加入1.2倍70℃糖化水，继续置于63-66℃恒温水浴 10-30min，冷却后用无妨纱布压滤，将两次过滤的滤汁混合匀得到糖化汁；
(3)酵母种子液制备
将Y12菌株接种于10mL YPD液体培养基，30℃，150rpm培养24h后，按2％接种量接种于200mL麦芽汁培养基，30℃，150rpm培养24h作为发酵种子液；
(4)发酵
取步骤(2)中的糖化汁于发酵桶中，将步骤(3)中培养好的种子液按 2％接种量接种于发酵桶，控制发酵温度在28-30℃，发酵2-3d。
(5)蒸馏
将步骤(4)中的发酵醪装入蒸馏器进行蒸馏，接取40％发酵醪体积的蒸馏液，转入蒸馏器进行复蒸，取10％发酵醪体积的蒸馏液即得到威士忌原酒。
酿酒酵母Y12使用上述方法酿造的纯麦威士忌原酒香气纯正，风格典型，杂醇油含量仅3.17g/L，具备良好的商业化应用潜力，可用于纯麦威士忌原酒的酿造。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
序列表
<110> 劲牌有限公司
<120> 一种酿酒酵母Y12及其在纯麦威士忌原酒酿造中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 806
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctttgaaaat ggggattttt tttgttttgg caagagcatg agagctttta ctgggcaaga 60
agacaagaga tggagagtcc agccgggcct gcgcttaagt gcgcggtctt gctaggcttg 120
taagtttctt tcttgctatt ccaaacggtg agagatttct gtgcttttgt tataggacaa 180
ttaaaaccgt ttcaatacaa cacactgtgg agttttcata tctttgcaac tttttctttg 240
ggcattcgag caatcggggc ccagaggtaa caaacacaaa caattttatt tattcattaa 300
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caacggatct cttggttctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat acgtaatgtg 420
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