一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方及其测定方法
阅读说明：本技术 一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方及其测定方法 (Phytosterol formula for promoting rumen fermentation and determination method thereof ) 是由 成艳芬 吕东海 吴子辰 朱伟云 朱强 于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方及其测定方法,添加植物甾醇可以提高微生物发酵的产气量及挥发性脂肪酸产量,同时降低乳酸产量。植物甾醇的添加量比甾醇组分对瘤胃发酵影响更大。添加植物甾醇B2μg/瓶时对瘤胃发酵的促进作用最明显。(The invention discloses a phytosterol formula for promoting rumen fermentation and a determination method thereof. The addition amount of phytosterol has a greater effect on rumen fermentation than the sterol component. When the phytosterol B is added into 2 mu g/bottle, the promoting effect on rumen fermentation is most obvious.)
技术领域
本发明涉及植物甾醇领域，尤其涉及一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方及其测定方法。
背景技术
目前近些年随着社会逐渐稳定，人们生活水平进一步提高，养殖业的重心从动物生长性能，生产效益逐渐转为关注动物健康，饲料安全以及畜产品品质等方面。植物甾醇是一种新型功能性绿色饲料添加剂，属于植物性甾体化合物，具有植物活性成分。自然界中存在的植物甾醇分为游离型和酯化型，酯化型的植物甾醇更易溶于有机溶剂，其吸收利用率比游离型高约5倍，其功能作用也更加广泛。明珠等报道在大鼠饮食中加入一定量的植物甾醇可以有效降低血液中胆固醇含量，预防心脑血管疾病，保护肝脏和血管。近年来，人们又发现植物甾醇具有抗炎、抗癌、抗氧化的作用，并且具有很高的安全性。目前，植物甾醇的身影已经遍布食品、药品、化妆品等行业，也开始在农业上崭露头角。植物甾醇在水产、禽类、单胃动物上的研究发现，适宜的添加量可以降低体内胆固醇含量，改善动物体质，提高生产效率进而提高经济效益。谢心美等在奶牛中的研究也发现，在日粮中添加200mg/d植物甾醇可显著提高奶牛的泌乳量，缩短首次参配时间和空怀时间，改善奶牛体质。
植物甾醇包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等，其组分不同，各甾醇含量和比例也不同，从而难以判断不同组分植物甾醇对瘤胃发酵的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方及其测定方法，旨在解决现有技术中的植物甾醇包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等，其组分不同，各甾醇含量和比例也不同，从而难以判断不同组分植物甾醇对瘤胃发酵的影响的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用的一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，包括如下质量份的原料制成；91.14～99.18份总甾醇，其中：0～79.71份β-谷甾醇、 0～29.88份菜油甾醇、0.10～95.17份豆甾醇。
其中，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的发酵底物为全混合日粮600mg。
其中，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的原料添加量为每瓶含有2-12ug。
其中，总甾醇95.64份，其中：β-谷甾醇55.19份、菜油甾醇29.88份、豆甾醇10.08份。
其中，总甾醇91.14份，其中：β-谷甾醇44.71份、菜油甾醇27.23份、豆甾醇16.63份。
其中，总甾醇95.4份，其中：β-谷甾醇46.7份、菜油甾醇25.1份、豆甾醇22.8份。
其中，总甾醇98.54份，其中：β-谷甾醇0份、菜油甾醇0份、豆甾醇95.17 份。
其中，总甾醇99.18份，其中：β-谷甾醇79.71份、菜油甾醇7.44份、豆甾醇0.10份。
本发明采用如权利要求1所述的促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的测定方法，包括如下步骤：
将发酵瓶加热至39℃，将植物甾醇和全混合日粮置于发酵瓶内；
将气压转换器的传感器针头***发酵瓶内，读取气压数据；
记录流入注射器筒体内的气体体积，直至发酵瓶内恢复到大气环境压力；
丢弃注射器筒体内的气体，在相同时间间隔测定产气量，直至发酵终止。
本发明的一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方及其测定方法，添加植物甾醇可以提高微生物发酵的产气量及挥发性脂肪酸产量，同时降低乳酸产量。植物甾醇的添加量比甾醇组分对瘤胃发酵影响更大。添加植物甾醇B2μg/瓶时对瘤胃发酵的促进作用最明显。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的不同组分植物甾醇对乳酸浓度的对比图。
图2是本发明的组分为A的植物甾醇对瘤胃发酵产气量的对比图。
图3是本发明的组分为B的植物甾醇对瘤胃发酵产气量的对比图。
图4是本发明的组分为C的植物甾醇对瘤胃发酵产气量的对比图。
图5是本发明的组分为D的植物甾醇对瘤胃发酵产气量的对比图。
图6是本发明的组分为E的植物甾醇对瘤胃发酵产气量的对比图。
图7是本发明的促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的测定方法流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
第一实施例：
本发明提供了一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，包括如下质量份的原料制成；0～99.18份总甾醇，其中：91.14～99.18份β-谷甾醇、0～29.88份菜油甾醇、0.10～95.17份豆甾醇。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的发酵底物为全混合日粮 600mg。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的原料添加量为每瓶含有 2-12ug。
在本实施方式中，每个甾醇样品分3个梯度浓度进行瘤胃液体外发酵，3个浓度梯度分别为2μg，6μg，12μg/瓶，不添加植物甾醇作为试验对照组。发酵底物为600mg全混合日粮。
参照Theodorou等方法配置人工瘤胃培养液，将四层纱布过滤后的瘤胃液与人工瘤胃营养液以1:5体积比混合，总体积60ml分装于120ml发酵瓶内，39℃恒温培养24小时。分别于3，6，9，12，24h测定产气量。发酵结束时，立即测定发酵液pH值，取发酵液-20℃冷冻保存用于测定微生物蛋白、乳酸、氨氮、挥发性脂肪酸含量。发酵底物65℃烘干，称重用于计算底物干物质降解率。
第二实施例：
本发明提供了一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，包括如下质量份的原料制成；0～99.18份总甾醇，其中：0～79.71份β-谷甾醇、0～29.88份菜油甾醇、 0.10～95.17份豆甾醇。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的发酵底物为全混合日粮 600mg。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的原料添加量为每瓶含有 2-12ug。
进一步地，总甾醇95.64份，其中：β-谷甾醇55.19份、菜油甾醇29.88份、豆甾醇10.08份。
在本实施方式中，每个甾醇样品分3个梯度浓度进行瘤胃液体外发酵，3个浓度梯度分别为2μg，6μg，12μg/瓶，总甾醇95.64份，其中：β-谷甾醇55.19 份、菜油甾醇29.88份、豆甾醇10.08份作为试验组。发酵底物为600mg全混合日粮。
参照Theodorou等方法配置人工瘤胃培养液，将四层纱布过滤后的瘤胃液与人工瘤胃营养液以1:5体积比混合，总体积60ml分装于120ml发酵瓶内，39℃恒温培养24小时。分别于3，6，9，12，24h测定产气量。发酵结束时，立即测定发酵液pH值，取发酵液-20℃冷冻保存用于测定微生物蛋白、乳酸、氨氮、挥发性脂肪酸含量。发酵底物65℃烘干，称重用于计算底物干物质降解率。
第三实施例：
本发明提供了一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，包括如下质量份的原料制成；0～99.18份总甾醇，其中：0～79.71份β-谷甾醇、0～29.88份菜油甾醇、 0.10～95.17份豆甾醇。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的发酵底物为全混合日粮 600mg。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的原料添加量为每瓶含有 2-12ug。
进一步地，总甾醇91.14份，其中：β-谷甾醇44.71份、菜油甾醇27.23份、豆甾醇16.63份。
在本实施方式中，每个甾醇样品分3个梯度浓度进行瘤胃液体外发酵，3个浓度梯度分别为2μg，6μg，12μg/瓶，总甾醇91.14份，其中：β-谷甾醇44.71 份、菜油甾醇27.23份、豆甾醇16.63份作为试验组。发酵底物为600mg全混合日粮。
参照Theodorou等方法配置人工瘤胃培养液，将四层纱布过滤后的瘤胃液与人工瘤胃营养液以1:5体积比混合，总体积60ml分装于120ml发酵瓶内，39℃恒温培养24小时。分别于3，6，9，12，24h测定产气量。发酵结束时，立即测定发酵液pH值，取发酵液-20℃冷冻保存用于测定微生物蛋白、乳酸、氨氮、挥发性脂肪酸含量。发酵底物65℃烘干，称重用于计算底物干物质降解率。
第四实施例：
本发明提供了一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，包括如下质量份的原料制成；0～99.18份总甾醇，其中：0～79.71份β-谷甾醇、0～29.88份菜油甾醇、 0.10～95.17份豆甾醇。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的发酵底物为全混合日粮 600mg。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的原料添加量为每瓶含有 2-12ug。
进一步地，总甾醇95.4份，其中：β-谷甾醇46.7份、菜油甾醇25.1份、豆甾醇22.8份。
在本实施方式中，每个甾醇样品分3个梯度浓度进行瘤胃液体外发酵，3个浓度梯度分别为2μg，6μg，12μg/瓶，总甾醇95.4份，其中：β-谷甾醇46.7 份、菜油甾醇25.1份、豆甾醇22.8份作为试验组。发酵底物为600mg全混合日粮。
参照Theodorou等方法配置人工瘤胃培养液，将四层纱布过滤后的瘤胃液与人工瘤胃营养液以1:5体积比混合，总体积60ml分装于120ml发酵瓶内，39℃恒温培养24小时。分别于3，6，9，12，24h测定产气量。发酵结束时，立即测定发酵液pH值，取发酵液-20℃冷冻保存用于测定微生物蛋白、乳酸、氨氮、挥发性脂肪酸含量。发酵底物65℃烘干，称重用于计算底物干物质降解率。
第五实施例：
本发明提供了一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，包括如下质量份的原料制成；0～99.18份总甾醇，其中：0～79.71份β-谷甾醇、0～29.88份菜油甾醇、 0.10～95.17份豆甾醇。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的发酵底物为全混合日粮 600mg。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的原料添加量为每瓶含有 2-12ug。
进一步地，总甾醇98.54份，其中：β-谷甾醇0份、菜油甾醇0份、豆甾醇95.17份。
在本实施方式中，每个甾醇样品分3个梯度浓度进行瘤胃液体外发酵，3个浓度梯度分别为2μg，6μg，12μg/瓶，总甾醇95.4份，其中：总甾醇98.54 份，其中：β-谷甾醇0份、菜油甾醇0份、豆甾醇95.17份作为试验组。发酵底物为600mg全混合日粮。
参照Theodorou等方法配置人工瘤胃培养液，将四层纱布过滤后的瘤胃液与人工瘤胃营养液以1:5体积比混合，总体积60ml分装于120ml发酵瓶内，39℃恒温培养24小时。分别于3，6，9，12，24h测定产气量。发酵结束时，立即测定发酵液pH值，取发酵液-20℃冷冻保存用于测定微生物蛋白、乳酸、氨氮、挥发性脂肪酸含量。发酵底物65℃烘干，称重用于计算底物干物质降解率。
第六实施例：
本发明提供了一种促进瘤胃发酵的植物甾醇配方，包括如下质量份的原料制成；0～99.18份总甾醇，其中：0～79.71份β-谷甾醇、0～29.88份菜油甾醇、 0.10～95.17份豆甾醇。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的发酵底物为全混合日粮 600mg。
进一步地，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的原料添加量为每瓶含有 2-12ug。
进一步地，总甾醇99.18份，其中：β-谷甾醇79.71份、菜油甾醇7.44份、豆甾醇0.10份。
进一步地，请参阅图3，所述促进瘤胃发酵的植物甾醇配方的测定方法，包括如下步骤：
S901：将发酵瓶加热至39℃，将植物甾醇和全混合日粮置于发酵瓶内；
S902：将气压转换器的传感器针头***发酵瓶内，读取气压数据；
S903：记录流入注射器筒体内的气体体积，直至发酵瓶内恢复到大气环境压力；
S904：丢弃注射器筒体内的气体，在相同时间间隔测定产气量，直至发酵终止。
在本实施方式中，
具体实验步骤为：
1、产气量测定
在发酵开始之前，将发酵瓶加热至39℃培养温度，校正每个发酵瓶的顶部空间气压至大气环境气压。测定时将气压转换器的传感器针头***发酵瓶上方的橡胶塞，从气压转换器的显示装置上读取顶部空间的气压，记录流入注射器筒体内的气体体积来确定发酵产生的气体体积，直到顶部空间气体压力恢复到大气环境压力。测量气体体积后，将气压转换器的传感器针头从瓶盖中拔出，丢弃注射器筒体中的气体，并将瓶子放回培养箱，直到下一次读数，在相同时间间隔测定产气量直到发酵终止。测定气压所用的时间应相对较短，每瓶不超过10-15秒。由于在同一时间内只从培养箱中取出几瓶，因此假设在测量期间，发酵瓶顶空的气体温度保持不变。
2、底物干物质降解率
将发酵瓶内的物质固液分离并转移固体部分至已知重量的离心管中，同时洗涤发酵瓶中的残渣并将其与对应固体样品混合，在(65±2)℃烘箱内，在大气压下烘干，直至恒重。称重并根据差量法计算样品干物质降解率。
3、乳酸测定
采用对-羟基联苯比色法测定。标准乳酸溶液:乳酸钙1.730g，去离子水溶解，定容至1000mL，取1ml，定容100ml容量瓶中。20％硫酸铜溶液:20g硫酸铜，去离子水溶解，定容至100ml。对-羟基联苯试剂:1.5g对-羟基联苯，5％氢氧化钠溶液20ml，去离子水溶解，定容至100ml，棕色试剂瓶，冷藏保存，备用。5％氢氧化钠:5g氢氧化钠，去离子水溶解，定容至100ml。取发酵饲料浸提液1ml，20％硫酸铜溶液一滴，试管置于冰水中，摇动，缓慢加入6ml浓硫酸，混匀，沸水浴煮沸5min，冷却，对-羟基联苯试剂0.2ml，摇匀，30℃恒温水浴30min，振荡，摇匀，取出，冷却，波长560nm，比色，测定OD 值。
4、MCP浓度测定
一、仪器设备及试剂准备
1)试剂
考马斯亮蓝、0.25N NaOH、牛血清蛋白(BSA)、超纯水
2)仪器设备
5ml离心管、7ml离心管、4度离心机、涡旋仪、5ml，1ml，200ul移液枪、酶标仪、酶标板
二、试验前准备
1)、准备7ml离心管，每个样品准备1个。
2)、准备5ml离心管，每个样品准备1个。
3)、准备5ml(2个/样品)、1ml(3个/样品)、200ul(1个/样品)枪头。
三、样品MCP测定步骤
1)、样品解冻
2)、涡旋振荡1min，将微生物和食糜分离
3)、取1ml混合液，4℃离心1,000rpm，8min
4)、吸取上清液800ul于5ml离心管中，14000rpm，4℃离心20min
5)、弃上清，底物中加入3ml 0.25N NaOH混匀
6)、100℃水浴10min，4℃离心14000rpm,30min
7)、取上清500μL(是否稀释视样品浓度而定，如上清100μL+水400μ L)至7mL离心管中
8)、加入5ml考马斯亮蓝，摇晃混匀静置2min
9)、一个样品3个平行，吸取200μL量加入酶标板(波长595nm)，按酶标仪操作快速完成比色，记录吸光度。
四、标准曲线制作
1)、取出0.1mg/mL牛血清蛋白(BSA)，室温融化后，备用；
2)、取21个7mL离心管，3个一组，分别标记0ug,5.0ug,10.0ug,20.0ug, 40.0ug,50.0ug。
3)、按下表在各试管中加入各种试剂：
4)、加入考马斯亮蓝后，摇晃混匀，静置2min
5)、一个样品3个平行，吸取200μL于酶标版上(波长595nm)，按酶标仪操作快速完成比色，记录吸光度。
MCP浓度计算：用吸光值作自变量，标准溶液MCP含量作因变量，导出标准曲线公式。把测得的吸光值带入标曲并乘以稀释倍数即得到样品中MCP含量。
五、注意事项
1)、4度离心机，提前把温度调至4度，
2)、水浴锅提前开到100℃
六、附录三
I.试验试剂
A.0.25M NaOH溶液：10g氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至1000mL；
B.0.1mg/mL牛血清蛋白(BSA)；
C.考马斯亮蓝溶液(G250，95％乙醇，85％磷酸溶液，双蒸水)
II.考马斯亮蓝溶液配制(避光)
1)、100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL 95％乙醇(保证充分溶解)；
2)、然后加入100mL 85％磷酸溶液(w/v)，并用双蒸水定容至1L；
3)、过滤后使用，4℃避光保存，可保存1周。
氨氮浓度测定
一、工作原理
氨在盐酸溶液中被转化为NH4+离子，与两分子的苯酚作用形成靛酚有色复合物的显色反应(参加反应的苯酚可由亚硝基铁***和水杨酸钠作用生成)。强还原物质对显色反应有干扰作用，可被次氯酸钠氧化除去。
二、仪器设备及试剂准备
1)试剂(配置见附录一)
0.2M HCL 4.5ml、苯酚溶液2.5ml、次氯酸钠溶液2.0ml
2)仪器设备
5ml离心管、7ml离心管、4度离心机、水浴锅、5ml，1ml，200ul移液枪、涡旋仪、酶标仪、酶标板
三、试验前准备
1)、准备7ml离心管，每个样品准备1个。
2)、准备5ml离心管，每个样品准备1个。
3)、准备1ml(2个/样品)、200ul(1-2个/样品)枪头。
四、NH3-N实验操作
一)样品前处理
1)、0.5g瘤胃液样品/食糜/粪样加入4.5mL 0.2M HCl进行酸化。
2)、冷冻保存。
3)、解冻，在4℃条件下，15000rpm离心15分钟。
二)显色
1、取0.05ml样品(瘤胃液或发酵液取0.01mL)(标准)液于7ml离心中 (空白为0.1M盐酸溶液)
2)、边混合边加入2.5ml苯酚溶液；加入2.0ml次氯酸钠溶液后摇匀
3)、将试管置于95℃水浴5min；60℃水浴10min
4)、取出冷却后，一个样品3个平行，吸取200μL量加入酶标板(波长 630nm)
5)、按酶标仪操作快速完成比色，记录吸光度
三)标准曲线
1)、称取0.6607g硫酸铵(经100℃烘12h)溶于0.1M盐酸并定容至100 ml，得到100mM的标准氨溶液
2)、用0.1M盐酸进行稀释可分别得到1、2、4、6、8mM的标准氨溶液
3)、在630nm下比色可得到吸光度(Y)与氨浓度(X)的标准曲线
五、注意事项
1)、4度离心机，提前把温度调至4度，
2)、需要两个水浴锅，分别提前开到95℃和60℃
3)、显色的时候，尽量避光
六、附录一
溶液配制
苯酚溶液：将0.0125g亚硝基铁***溶于125ml蒸馏水中，然后加入33 ml苯酚(90％W/V)充分混匀，最后将溶液稀释到250ml，置于棕色瓶中保存备用。
次氯酸钠溶液：将1.25g NaOH溶于150ml蒸馏水中，再加入9.5g Na2HPO4 ·7H2O(12.65g Na2HPO4·12H2O)。冷却后加入12.5ml次氯酸钠溶液(5.25％)，将溶液定容到250ml。用快速滤纸过滤后放入棕色塑料瓶中保存。
盐酸配制
0.02mol/L HCL溶液：量取0.18毫升盐酸，缓慢注入100ml水。
0.1mol/L HCL溶液：量取0.9毫升盐酸，缓慢注入100ml水。
0.2mol/L HCL溶液：量取1.8毫升盐酸，缓慢注入100ml水。
0.5mol/L HCL溶液：量取4.5毫升盐酸，缓慢注入100ml水。
1.0mol/L HCL溶液：量取9毫升盐酸，缓慢注入100ml水。
挥发性脂肪酸浓度测定
一)、GC(Gas chromatograph)工作条件
仪器：GC-14B型气相色谱仪(日本岛津公司)
毛细柱：NUKOLTM Capillary Column(Supelco)；Column No.34292-07B
30m×0.32mm×0.25μm film thickness
气相色谱仪参数：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温130℃，汽化温度180℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度180℃，载气为氮气，压力为60KPa，氢气压力为50KPa，氧气压力50KPa，灵敏度(档)为101，衰减3.0。
二)、样品制备
1.试剂制备
(1)配制25％w/v的偏磷酸溶液，将25g偏磷酸溶在100mL双蒸水中
(2)巴豆酸的配制，在100ml的偏磷酸溶液中加入0.6464g的巴豆酸，定容到100mL。(可先用80ml双蒸水，加热溶解偏磷酸，然后定容至100ml)
(3)标准样品，准确称取色谱标准级乙酸0.9100g、丙酸0.3700g、丁酸 0.1765g、异丁酸0.1765g、戊酸和异戊酸分别为0.1985g，分别溶于双蒸水中，再各自定容至100mL。
2.样品制备
(1)发酵液取(或过滤瘤胃液)VFA测定1ml样品到离心管中，再加入0.2ml 的偏磷酸巴豆酸混合溶液，－20℃冰箱保存过夜，解冻后12000rpm离心5min，取上清液保存，测定前再12000rpm离心5min(或少许通过0.22μm针式滤器，滤液直接进样用1.0微升微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.2－1.0μL。
(2)食糜及粪样VFA测定取1g置于离心管中，加入5－10倍的双蒸水，混合均匀。取1mL上清夜，加偏磷酸巴豆酸0.2mL/mL。其它步骤同上。
(3).保留时间的确定
与样品处理相同，在1ml标准样品中加入0.2mL偏磷酸与巴豆酸的混合样，上样测出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的保留时间。
(4).有机酸浓度的计算
通过标准样品和内标巴豆酸各自的(或浓度)和峰面积可以计算出乙酸、丙酸及丁酸等有机酸的相对校正因子，然后根据乙酸、丙酸及丁酸的重量(或浓度)与其峰面积成正比计算出各个样品中的乙酸、丙酸及丁酸浓度。
挥发酸标样的质量和换算的浓度
(5).有机酸重现率
将某有机酸(如乙酸)连续上样几次，测定其峰面积值，利用某酸峰面积值和内标峰面积值计算其重现率。
乙酸重现率变异系数：1.2872±0.06404
丙酸重现率变异系数：0.5104±0.01961
丁酸重现率变异系数：0.3422±0.01037
异丁酸重现率变异系数：0.4668±0.01447
戊酸重现率变异系数：0.1431±0.01754
异戊酸重现率变异系数：0.1671±0.03496
标样的分子量和出峰时间
沸点
分子量
出峰时间
巴豆酸
86.09
1.95min
乙酸
118℃
60.05
0.87min
丙酸
141℃
74.08
1.0min
丁酸
163.5℃
88.11
1.2min
异丁酸
154.5℃
88.11
1.06min
戊酸
102.14
1.68min
异戊酸
102.14
1.38min
气相色谱的气体工作条件(VFA测定)
钢瓶减压阀压力
气象色谱压力表
氢气
0.14MPa
50KPa
空气(AIR1)
0.4MPa
50KPa
氮气(ARRIER2)
0.4MPa
60KPa
PRIMARYCARRIER(P)
300KPa
试验所用5种植物甾醇配方，总植物甾醇含量均>90％，其配方组成如表1，分别标记为甾醇A-E。
表1不同配方植物甾醇产品成分表
每个甾醇样品分3个梯度浓度进行瘤胃液体外发酵。3个浓度梯度分别为2 μg，6μg，12μg/瓶，总甾醇99.18份，其中：β-谷甾醇79.71份、菜油甾醇7.44份、豆甾醇0.10份作为试验组。发酵底物为600mg全混合日粮。
参照Theodorou等方法配置人工瘤胃培养液，将四层纱布过滤后的瘤胃液与人工瘤胃营养液以1:5体积比混合，总体积60ml分装于120ml发酵瓶内，39℃恒温培养24小时。分别于3，6，9，12，24h测定产气量。发酵结束时，立即测定发酵液pH值，取发酵液-20℃冷冻保存用于测定微生物蛋白、乳酸、氨氮、挥发性脂肪酸含量。发酵底物65℃烘干，称重用于计算底物干物质降解率。
指标测定：
参照Menke和Steingass(1988)等方法测定产气量，底物干物质降解率的测定参照《饲料分析及饲料质量检测技术》的方法，将发酵瓶内物质固液分离的同时洗涤发酵瓶中的残渣并将其与对应样品混合后在65℃烘干48h，称重并根据差量法计算样品干物质降解率。体外发酵结束后培养液乳酸浓度的测定参照 Barker和Summerson方法，MCP浓度的测定参照Makkar等的方法，NH3-N浓度的测定采用Broderick等的苯酚-次氯酸钠比色法，挥发性脂肪酸测定方法参考秦为琳的方法。
实验结果与分析：
1、不同组分植物甾醇对底物消失率的影响
从图1可知，发酵结束时，添加植物甾醇的试验组乳酸浓度与对照组相比均有所降低，浓度对乳酸浓度影响显著(P<0.05)；添加植物甾醇为2μg时，乳酸浓度显著低于6μg以及12μg(P<0.05)。甾醇组分和浓度对发酵液乳酸浓度交互作用不显著(P>0.05)。
2、不同组分植物甾醇对发酵产气量的影响
不同组分植物甾醇对瘤胃体外发酵产气量的影响见图2至图6。随着发酵时间延长，累积产气量呈逐渐上升的趋势。甾醇浓度对各时间点产气量的影响显著(P<0.05)，其中2μg总产气量最高，12μg最低，组分和浓度对体外发酵总产气量有显著的交互作用(P<0.05)。各时间点各组产气量均高于对照组， 24h发酵终止时，B-2组产气量最高，达到了57.33mL，对照组最低，为38.07mL。
3、不同组分植物甾醇对发酵液pH值、氨态氮、微生物蛋白以及干物质降解率的影响
表2反映了添加植物甾醇对瘤胃体外发酵各项指标的影响，由表可知试验组发酵液pH均比对照组低，且各组的pH均保持在正常范围内。甾醇浓度对pH 变化影响显著(P<0.05)，对照组最高，12μg最低。甾醇组分和浓度对发酵液 pH没有显著交互作用(P>0.05)。甾醇种类对发酵液氨氮浓度有显著影(P<0.05)， D组浓度最高，A组其次，B组最低且显著低于这两组(P<0.05)。甾醇组分和浓度对发酵液氨氮浓度没有显著交互作用(P>0.05)。发酵24h时，甾醇浓度对发酵液MCP浓度影响显著(P<0.05)；添加植物甾醇为6μg和12μg时，MCP浓度显著高于2μg(P<0.05)。甾醇组分和浓度对发酵液MCP浓度有显著的交互作用(P<0.05)。通过DMD对比，可以看出，甾醇组分对发酵液DMD有显著影响(P<0.05)，A组最高，其次是B组。甾醇浓度对发酵液DMD影响显著 (P<0.05)。甾醇组分和浓度对发酵液DMD有显著的交互作用(P<0.05)。
表2植物甾醇对瘤胃发酵参数的影响
4、不同组分植物甾醇对微生物代谢产物的影响
不同组分植物甾醇对瘤胃体外发酵VFA浓度的影响见表3。甾醇浓度对总挥发性脂肪酸(VFA)、乙酸、丁酸以及乙丙比影响显著(P<0.05)，其中2μg 组TVFA和丁酸显著高于其它浓度以及对照组(P<0.05)，乙丙比三个浓度均显著高于对照组(P<0.05)。甾醇组分也可以显著影响乙丙比(P<0.05)，最高的是D组，显著高于最低组B组(P<0.05)。组分和浓度只对乙丙比有显著的交互作用(P<0.05)。
表3植物甾醇对瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸的影响
5、结论
添加植物甾醇可以提高微生物发酵的产气量及挥发性脂肪酸产量，同时降低乳酸产量。植物甾醇的添加量比甾醇组分对瘤胃发酵影响更大。添加植物甾醇B2μg/瓶时对瘤胃发酵的促进作用最明显。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。