阅读说明：本技术 与油脂代谢调控相关的大豆转录因子GmMYB395及其编码基因与应用 (Soybean transcription factor GmMYB395 related to lipid metabolism regulation and control as well as coding gene and application thereof ) 是由 张劲松 陈受宜 白文婉 张万科 马彪 林晴 何锶洁 于 2019-04-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种与油脂代谢调控相关的大豆转录因子GmMYB395及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质,命名为GmMYB395蛋白,又称为与油脂代谢调控相关的转录因子GmMYB395,是序列表中序列1所示的蛋白质。编码GmMYB395蛋白的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法,包括如下步骤：将GmMYB395基因导入受体植物中,得到油脂含量高于所述受体植物的转基因植物。本发明对提高和改良作物油脂成份、特别是对于提高大豆等油料植物籽粒中油脂成份,培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。(The invention discloses a soybean transcription factor GmMYB395 related to oil metabolism regulation and application thereof as well as a coding gene and application thereof. The protein provided by the invention is named as GmMYB395 protein, is also named as a transcription factor GmMYB395 related to oil metabolism regulation, and is a protein shown in a sequence 1 in a sequence table. The gene coding the GmMYB395 protein also belongs to the protection scope of the invention. The invention also provides a method for cultivating the transgenic plant, which comprises the following steps: and (3) introducing the GmMYB395 gene into a receptor plant to obtain a transgenic plant with the oil content higher than that of the receptor plant. The invention has important theoretical and practical significance for improving the oil and fat components of crops, particularly for improving the oil and fat components in oil plant seeds such as soybeans and the like and cultivating high-oil varieties.)

与油脂代谢调控相关的大豆转录因子GmMYB395及其编码基因 与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与油脂代谢调控相关的大豆转录因子GmMYB395及其编码基因与应用。

背景技术

人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位(世界上主要的产油作物见表1)。

表1

种类	生产量(百万吨)	占总产量百分比	相对顺序
				大豆(Soybean)	15.50	29.1	1
棕榈(Palm)	8.52	16.0	2
				油菜籽(Rapeseed)	7.03	13.2	3
向日葵(Sunflower)	7.00	13.1	4
				棉花籽(Cottonseed)	3.31	6.2	5
椰子(Coconut)	2.71	5.1	6
				花生(Peanut)	2.69	5.0	7
橄榄(Olive)	1.63	3.1	8

脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对它的阻断会导致细胞的死亡，因而至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。

植物同其它真核生物在参与脂肪酸合成途径的酶上有很大差异。从乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成的。植物中，参与脂肪酸合成的酶以可溶的形式存在于质体的胞质中。

大多数植物中，油脂都以三酰甘油(Triacylglycerols，TAG)的形式储藏，它的含量是一个非常重要的农艺性状，TAG的生物合成称之为Kennedy途径，如同真核生物中合成膜甘油酯的途径，脂肪酸去除CoA后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物PA。PA去磷酸化产生DAG。在TAG合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的DAG 3’-OH位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催化的，此反应被认为是TAG生物合成中唯一的限速步骤。人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。然而，植物中，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍然知之甚少。

发明内容

本发明的目的是提供一种与油脂代谢调控相关的大豆转录因子GmMYB395及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，获自大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)，命名为GmMYB395蛋白，又称为与油脂代谢调控相关的转录因子GmMYB395，是如下(a)或(b)：

(a)序列表中序列1所示的蛋白质；

(b)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物油脂含量相关的由其衍生的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基是指10个以下氨基酸残基。

编码GmMYB395蛋白的基因也属于本发明的保护范围。编码GmMYB395蛋白的基因命名为GmMYB395基因。

所述基因是如下(1)或(2)或(3)：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码植物油脂含量相关蛋白的DNA分子；

(3)来源于大豆且与(1)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物油脂含量相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗。所述严格条件还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗。所述严格条件还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗。所述严格条件还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。所述严格条件还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。所述严格条件也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

含有GmMYB395基因的重组载体、表达盒或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有GmMYB395基因的重组表达载体。使用GmMYB395基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用GmMYB395基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。

所述重组表达载体是将GmMYB395基因***表达载体中得到的表达GmMYB395蛋白的重组表达载体。所述表达载体具体可为载体pGWB412。

扩增GmMYB395基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对具体可为序列表的序列3所示引物和序列表的序列4所示引物组成的引物对。

本发明还保护GmMYB395蛋白在调控植物油脂含量中的应用。所述调控为正向调控。所述调控植物油脂含量为提高植物油脂含量。

本发明还保护GmMYB395基因或含有GmMYB395基因的重组载体的应用；所述应用为培育油脂含量增高的转基因植物。所述应用为培育种子油脂含量增高的转基因植物。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将GmMYB395基因导入受体植物中，得到油脂含量高于所述受体植物的转基因植物。所述“油脂含量高于所述受体植物”为种子油脂含量高于所述受体植物。GmMYB395基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中GmMYB395蛋白的含量和/或活性，从而使其油脂含量增高。所述油脂含量增高为种子油脂含量增高。

以上任一所述植物油脂含量具体可为植物种子的油脂含量。

以上任一所述油脂含量为总油脂含量。

以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为豆科植物，更具体可为大豆属植物。所述双子叶植物具体可为十字花科物，更具体可为拟南芥属植物，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明的发明人在对大豆种子发育过程中转录组的分析中获得了一个在种子油脂积累中高表达的转录因子GmMYB395，属于MYB类转录因子。进一步的功能鉴定表明其调控大豆种子油脂含量的积累。本发明对提高和改良作物油脂成份、特别是对于提高大豆等油料植物籽粒中油脂成份，培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1为载体

8/GW/TOPO的图谱。

图2为实施例1中GmMYB395基因的相对表达水平的结果。

图3为实施例2中GmMYB395基因的相对表达水平的结果。

图4为实施例2中种子总油脂含量的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大豆黑农44(HN44)：由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员；专利号为：CNA20020216.2；审定号为：黑审豆2002003；记载于如下文献：满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；2006年获自黑龙江农业科学院大豆研究所。

农杆菌GV3101，记载于如下文献：Lee CW等，Agrobacterium tumefacienspromotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsisthaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62。

哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)：Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。

GmMYB395-up(序列表的序列3)：5’-ATGGGAAGGAGTCCTTGCTGTA-3’；

GmMYB395-dp(序列表的序列4)：5’-CTACAGATACTGAATGTACTTC-3’。

实施例1、大豆与油脂代谢调控相关的转录因子GmMYB395编码基因的cDNA克隆和植物表达载体的构建

在进行大豆种子发育过程中脂肪酸积累代谢的分析时，发现一个MYB转录因子家族中的某个基因有较高的表达。对该基因与油脂合成调控的相关性进行研究。

提取大豆黑农44幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用GmMYB395-up和GmMYB395-dp组成的引物对进行PCR扩增，得到约1.2kb的PCR扩增产物。经过测序，该PCR扩增产物为1188bp，如序列表中序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GmMYB395蛋白，将其编码基因命名为GmMYB395基因。

将序列表的序列2所示的DNA分子***载体8/GW/TOPO(载体8/GW/TOPO为现有的克隆载体，提供3′-T突出端，可以直接连接外源DNA分子；载体

8/GW/TOPO的图谱见图1)，得到重组质粒甲。重组质粒甲与载体pGWB412(载体pGWB412为现有的表达载体；载体pGWB412中具有如下Gateway cassette：P35S-FLAG-attR1-Cm^r-ccdB-attR2-T_NOS)进行LR重组，得到重组质粒乙。经测序，重组质粒乙的骨架为载体pGWB412，通过LR重组***了序列表的序列2所示的DNA分子。重组质粒乙又称为重组质粒pGWB412-GmMYB395。

GmMYB395基因在大豆不同器官的表达分析：取大豆黑农44不同器官(根、苗、叶、荚和种子)的总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA，采用GmMYB395-up和GmMYB395-dp组成的引物对进行Real Time-PCR检测，大豆Tublin基因为内标(用于检测内标的引物：Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT；Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’)。GmMYB395基因的相对表达水平见图2。GmMYB395基因在根、苗、叶、荚和种子中均有表达，在叶中表达量最高。

实施例2、转GmMYB395基因拟南芥的获得和鉴定

一、转GmMYB395基因拟南芥的获得

1、将重组质粒pGWB412-GmMYB395导入农杆菌GV3101,得到重组农杆菌。

2、取步骤1得到的重组农杆菌，采用抽真空法对哥伦比亚生态型拟南芥进行遗传转化，然后收获再生植株的种子。

3、将步骤2得到的种子播于含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上，将可以正常生长的4-6叶植株转移到蛭石继续培养，即为T₁代单株。

4、T₁代单株分别收获自交种子。

5、将步骤4得到的种子播于含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上，观察植株是否发生抗性性状的分离，将可以正常生长的4-6叶植株转移到蛭石继续培养，即为T₂代单株。

6、T₂代单株分别收获自交种子。

7、将步骤6得到的种子播于含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上，观察植株是否发生抗性性状的分离，将可以正常生长的4-6叶植株转移到蛭石继续培养，即为T₃代单株。

在T₃代，获得遗传稳定的转GmMYB395基因纯合株系。

二、GmMYB395基因表达水平鉴定

取步骤一得到的各个转GmMYB395基因纯合株系的T₃代植株，提取总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA，采用GmMYB395-up和GmMYB395-dp组成的引物对进行Real Time-PCR检测，将拟南芥AtActin2基因作为内标(用于检测内标的引物：Primer-TF：5’-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC；Primer-TR：5’-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3’)。

部分转GmMYB395基因纯合株系的GmMYB395基因的相对表达水平见图3。哥伦比亚生态型拟南芥(即图3中的对照)中未检测到GmMYB395基因表达。OE1株系、OE9株系、OE12株系、OE16株系、OE20株系和OE25株系中GmMYB395基因的相对表达水平依次为0.028±0.001、0.029±0.001、0.128±0.01、0.018±0.001、0.019±0.005和0.019±0.004。

三、转空载体株系的获得

用载体pGWB412代替重组质粒pGWB412-GmMYB395，按照步骤一进行操作，得到转空载体株系。

四、转GmMYB395基因拟南芥的表型分析

供试植株：哥伦比亚生态型拟南芥植株、转空载体株系的T₃代植株、OE1株系的T₃代植株、OE9株系的T₃代植株、OE12株系的T₃代植株、OE16株系的T₃代植株、OE20株系的T₃代植株和OE25株系的T₃代植株。进行三次重复试验，每次重复试验中每个株系设置30株植株作为生物学重复。

在平行条件下培养供试植株，成熟期收获种子。

检测种子的总油脂含量。具体方法(参考文献：Shen,B.,et al.,The homeoboxgene GLABRA2 affects seed oil content in Arabidopsis,Plant Mol.Biol.,60,377-387,2006)：彻底干燥待测种子，然后研磨成粉末，取10mg粉末加入螺口的2ml离心管中(每份样品平行称取四份)，加入10μl脂肪酸溶液(溶剂为乙酸乙酯，17:0脂肪酸的浓度为10mg/ml；17:0脂肪酸作为内标)，加入1ml 2.5％硫酸溶液(溶剂为甲醇)，85℃水浴中保温1小时(期间晃动数次)，然后自然冷却，收集上清液；取500μl上清液到新管中，加入600μl 0.9g/100ml NaCl水溶液、300μl正己烷，震荡混匀几分钟，然后4000rpm离心10分钟，收集上清液；将上清液转移到新管中，在通风橱中放置使正己烷挥发完全，然后加入50μl乙酸乙酯以溶解甲酯化的脂肪酸，然后用气相色谱质谱联用仪测(Perkin-Elmer Turbomass)各个脂肪酸组分，各个组分的丰度与内标的丰度进行比较，然后根据内标的含量计算各个组分的含量。

种子总油脂含量(即总油脂占种子干重的质量百分比)的结果见图4。图4中，*表示显著高于哥伦比亚生态型拟南芥，**表示与哥伦比亚生态型拟南芥相比具有极显著差异。哥伦比亚生态型拟南芥(即图4中的对照)的种子总油脂量含量约为32.7％±1.1％。OE1株系、OE9株系、OE12株系、OE16株系、OE20株系和OE25株系的种子总油脂含量依次为37.2％±3.2％、38.0％±2.0％、35.1％±2.7％、34.6％±1.8％、36.1％±1.9％和34.9％±1.6％。统计表明，6个过表达GmMYB395基因的转基因株系的种子总油脂含量均显著高于哥伦比亚生态型拟南芥。转空载体株系的种子总油脂量含量与哥伦比亚生态型拟南芥无显著差异。

上述实验表明，大豆MYB类转录因子GmMYB395对种子中油脂的合成呈正调控作用，过表达GmMYB395基因可提高转基因植株种子中总油脂的含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 与油脂代谢调控相关的大豆转录因子GmMYB395及其编码基因与应用

<130> GNCYX190922

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> Glycine max (L.) Merrill

<400> 1

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Ser His Glu Glu Leu Arg Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Val Gln Glu Asp Gln Lys Leu Ile Ala Tyr Ile Gln Lys His

20 25 30

Gly Thr Gly Ser Trp Arg Thr Leu Pro Gln Lys Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Phe Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Lys Leu Ser Gln Glu Glu Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu Gln Ala Val Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ser Ile Ala Lys His Leu

85 90 95

Pro Lys Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser Tyr Leu

100 105 110

Arg Lys Gln Phe Glu Lys Asn Ala Gly Asp Ser Ser Ser Pro Lys Pro

115 120 125

Ile Ser Ser Asp Ser Ser Pro Glu Ser Lys Ser Asn Asp Met Cys Met

130 135 140

Val Pro Leu Glu Lys Thr Asp Cys His Glu Pro Asn Thr Asn Gln Ser

145 150 155 160

His Gln His Lys Leu Ser Lys Ser Thr Ser Ser Ser Thr His Leu Leu

165 170 175

Asn Lys Val Ala Ser Lys Ile Leu Ala Ser Gly Tyr Leu Glu Ala Ile

180 185 190

Lys Ser Cys Gln Pro Val Val Ala Gly Asn Ser Lys Ser Glu Gly Val

195 200 205

Val Lys Ser Gly Ile Gly Pro Gln Lys Asp Asn Ile Arg Asp Pro Leu

210 215 220

Val Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ser His Ser Val Thr Ser Ala Lys Leu

225 230 235 240

Leu Asn Lys Met Ala Thr Ser Leu Pro His Lys Val Tyr Gly Leu Glu

245 250 255

Ala Val Lys Ala Val Phe Ser Lys Leu Met Glu Ser Ser Glu Lys Gly

260 265 270

Gly Ile Ala Thr Ser Asp Gly Ser Ser Phe Val Gly Ser Asp Gln Val

275 280 285

Gly Ser Cys Leu Asn Ala Leu Ser Pro Phe Glu Asp Gly Pro His Ile

290 295 300

Ser Lys Ile Ile Asp Ser Pro Ser Ser Pro Thr Leu Met Phe Asn Gln

305 310 315 320

Val Thr Thr Pro Ser Cys Phe Ser Glu Asp Asn Glu Asp Asn Trp Gln

325 330 335

Cys Val Ser Ser Asn Tyr Val Ser Phe Arg Asn Cys Ala Ala Ser Gly

340 345 350

Gly Gly Gly Asp Cys Ser Val Ser Glu Ile Asn Leu Gly Glu Ser Ser

355 360 365

Ser Ser Thr Ser Cys Phe Leu Phe Glu Asn Ala Asp Leu Gly Thr Cys

370 375 380

Asp Asp Glu Ile Arg Lys Tyr Ile Gln Tyr Leu

385 390 395

<210> 2

<211> 1188

<212> DNA

<213> Glycine max (L.) Merrill

<400> 2

atgggaagga gtccttgctg tagtcatgag gaattgagga aaggggcatg gacggttcaa 60

gaagatcaga aactcattgc ttacattcag aaacatggca caggaagctg gcgtaccttg 120

ccacaaaaag caggtcttca aagatgtggc aagagttgca ggctgagatg gtttaactac 180

cttagacctg acattaagag aggaaaatta agccaagaag aagagcagac aattataaaa 240

cttcaggcgg ttcttggcaa caggtggtca agtattgcaa agcacttacc aaagcgaact 300

gataacgaaa tcaagaacta ttggaactca tatctgagaa agcagtttga aaagaatgcc 360

ggggattcct caagtccaaa accaattagt tctgacagtt ccccagaatc aaaatccaat 420

gacatgtgca tggttccatt agagaaaact gattgccatg aaccaaacac caaccagtct 480

catcagcaca aattatcaaa gtcaacctca tcttcaactc atctactcaa caaagttgct 540

agtaaaattc tggcatcagg gtaccttgaa gcaatcaaat catgccaacc tgttgttgct 600

gggaacagca aaagtgaagg cgtagttaaa agtggaattg ggccacaaaa ggacaatatt 660

agagaccccc ttgtgcctaa tttgacctca ccaagtcatt cagtaacttc tgctaagtta 720

ctgaacaaga tggctacttc actccctcat aaagtttatg gccttgaagc tgtaaaagct 780

gtattctcaa aactgatgga aagcagtgaa aaaggtggca ttgctactag tgatggtagt 840

agctttgttg gcagtgatca agttggaagt tgtttaaatg ctttaagccc ttttgaggat 900

ggaccacaca tatcaaaaat aattgactcc ccttctagtc ctacactaat gttcaaccaa 960

gtgaccacac cctcatgctt ttcagaagat aatgaagata actggcaatg tgtttcatct 1020

aactatgttt ccttcagaaa ttgtgctgca agtggtggtg gtggtgactg cagtgtctct 1080

gagatcaact tgggtgagtc ttctagttcc acatcatgct tcctgtttga gaatgctgac 1140

ctgggaacat gtgatgatga gataaggaag tacattcagt atctgtag 1188

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgggaagga gtccttgctg ta 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ctacagatac tgaatgtact tc 22