基于时空聚焦的均匀全息双光子显微系统
阅读说明：本技术 基于时空聚焦的均匀全息双光子显微系统 (Uniform holographic two-photon microscope system based on space-time focusing ) 是由 斯科 龚薇 王一帆 郑瑶 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于时空聚焦的均匀全息双光子显微系统。激光器输出线偏振飞秒激光,经半波片和偏振光分束器调节功率和偏振方向达到最大调制效率,再经过正交柱透镜后斜入射到反射式液晶空间光调制器上,正交柱透镜组紧邻液晶空间光调制器平行放置,相位调制后光束经过一组由第二消色差透镜和第三消色差透镜构成的中继4F透镜进入时空聚焦模块,时空聚焦模块输出色散补偿后的激光经过二向色镜反射,再由物镜聚焦至实验样本上。本发明加载至液晶空间光调制器的全息相位图中相位奇点基本消除,最终获得无散斑噪声的高轴向分辨率的均匀全息光束,具有适用范围广泛、兼容性强、激发效率高等优点。(The invention discloses a space-time focusing-based uniform holographic two-photon microscope system. The laser outputs line polarized femtosecond laser, the power and the polarization direction of the laser are adjusted by a half-wave plate and a polarization beam splitter to achieve the maximum modulation efficiency, the laser passes through an orthogonal column lens and then is obliquely incident on a reflective liquid crystal spatial light modulator, an orthogonal column lens group is arranged close to the liquid crystal spatial light modulator in parallel, the light beam after phase modulation enters a space-time focusing module through a group of relay 4F lenses formed by a second achromatic lens and a third achromatic lens, and the laser after dispersion compensation output by the space-time focusing module is reflected by a dichroic mirror and then focused on an experimental sample by an objective lens. The method basically eliminates the phase singularity in the holographic phase diagram loaded to the liquid crystal spatial light modulator, finally obtains the uniform holographic beam with high axial resolution and no speckle noise, and has the advantages of wide application range, strong compatibility, high excitation efficiency and the like.)
技术领域
本发明涉及光学全息领域的一种显微光学系统，具体涉及基于时空聚焦的均匀全息双光子显微系统。
背景技术
全息双光子显微系统广泛用于显微成像、光遗传和光刻领域等。全息双光子系统用于显微成像能够提升图像信噪比，用于光遗传可以精准定位靶细胞位置并提高激发效率，用于光刻加工可以提高加工精度并加快加工速度。通过计算机生成的全息相位图可以控制光场的强度分布，全息相位图可以改变每个像素处的相位而不会对振幅产生影响。实际应用中，单色光照射空间光调制器或其他类似光学器件实现相位调制，该光束中继到聚焦物镜，在物镜的焦平面处会产生所需任意形状的强度分布。然而全息光束整形的主要问题是在整形后的全息光束中存在严重的散斑噪声，这严重降低了光束质量。
目前抑制或消除全息光束的散斑噪声的方法主要有四种：一是降低光源相干性，这种方法光路复杂，牺牲时间分辨率获取均匀全息光束；二是光路改进，对GS算法产生的CGH在频域上低通滤波，滤除高频的散斑噪声获取均匀全息光束，该方案在光路中增设滤波器，调节难度增大，全息光束的原有的高频信息丢失；三是优化数值重建的算法，增加信号区与噪声区，牺牲衍射效率去除全息光束的散斑噪声；四是通过迭代获取最佳的初始相位，降低时间分辨率获取无散斑的均匀全息光束。以上四种方法无法兼顾高时间分辨率、高衍射效率和系统兼容性。
传统全息相位图计算方法原理限制，计算机生成的全息相位图中存在相位奇点，全息光束中散斑噪声严重。
发明内容
本发明提出了基于时空聚焦的均匀全息双光子显微系统，能够在保证时间分辨率和系统兼容性的基础上，消除全息光束散斑噪声，获得均匀全息光束。而且本方法具有适用范围广泛、兼容性强、激发效率高等优点。
本发明采用的技术方案如下：
本发明包括飞秒激光器、半波片、偏振分束镜、聚焦镜、针孔、第一消色差透镜、正交柱透镜、液晶空间光调制器、第二消色差透镜、第一反射镜、第三消色差透镜、第二反射镜、第四消色差透镜、反射式闪耀光栅、第三反射镜、第五消色差透镜、二向色镜、物镜、滤光片、管透镜和相机；
飞秒激光器发出飞秒激光束，飞秒激光束经过半波片后入射到偏振分束镜发生反射，偏振分束镜的反射光束依次经聚焦镜、针孔、第一消色差透镜后再透过正交柱透镜入射到反射式液晶空间光调制器发生相位调制，正交柱透镜布置在液晶空间光调制器前方，液晶空间光调制器的反射调制光束再经正交柱透镜透射后依次经第二消色差透镜、第一反射镜发生反射，第一反射镜的反射光束再经第三消色差透镜、第二反射镜发生反射，第二反射镜的反射光束经第四消色差透镜、反射式闪耀光栅发生反射，反射式闪耀光栅的反射光束再经第三反射镜反射、第五消色差透镜透射后入射到二向色镜发生反射，二向色镜的反射光束经物镜后产生全息光束照射到实验样本，实验样本被全息光束激发的荧光经物镜逆反回到二向色镜发生透射，二向色镜的透射光束依次经滤光片、管透镜后入射到相机。
所述的针孔和第一消色差透镜构成第一组4F透镜组，第二消色差透镜和第三消色差透镜构成第二组4F透镜组，第四消色差透镜和第五消色差透镜构成第三组4F透镜组。
所述的正交柱透镜为长焦，长焦是指500mm以上。
所述的正交柱透镜分为两个柱透镜的正交组合并紧邻液晶空间光调制器平行放置。
所述的反射式闪耀光栅反射出0级光束和1级光束，在0级光束出射端布置光挡，在1级光束出射端布置第三反射镜。
所述的液晶空间光调制器的液晶平面和物镜的后瞳面沿光路的光轴共轭。
所述飞秒激光器发出的飞秒激光呈高斯分布而形成高斯光。
飞秒激光经液晶空间光调制器得到高斯分布的平行光，然后以°的入射角斜入射至液晶空间光调制器。
所述的液晶空间光调制器加载全息相位图，飞秒激光经过液晶空间光调制器时被相位调制，在实验样本上形成全息光束。
所述的全息相位图按照以下方式处理获得：
S1、根据目标全息光束和液晶空间光调制器高斯光的半径按照以下公式处理获得液晶空间光调制器的环形初相位系数c：
c＝(rout-1/πrin)/(rin/π)
其中，rin表示液晶空间光调制器输入高斯光的半径，rout表示目标全息光束的外接圆半径；
所述的目标全息光束为期望在实验样本上呈现出的图案对应的光束分布图。由此环形初始相位的环形初相位系数c由输入高斯光的尺寸和目标全息光束大小决定。
S2、根据环形初相位系数c再按照以下公式处理获得液晶空间光调制器液晶平面上每个像素的环形初始相位
其中，表示环形初始相位，x、y分别表示位于液晶空间光调制器液晶表面上的像素在沿两个相互垂直方向上的坐标位置，exp()表示指数函数，i表示虚数；
本发明的初始相位除环形相位项外还包含线性初始相位和锥形初始相位。线性初始相位决定目标全息全息光束的位置，锥形初始相位用于目标全息光束的中间孔洞生成。
S3、按照以下公式处理获得液晶空间光调制器液晶平面上每个像素的线性初始相位
式中，kx和ky分别为液晶空间光调制器液晶表面上x、y轴方向上的空间频率，Δx和Δy为目标全息相位图的质心距离中心的偏移量，θ为目标全息相位图的质心和中心之间连线与x轴方向之间的夹角；所述的质心是有图像中每个像素的灰度值的加权平均位置。
S4、按照以下公式处理获得液晶空间光调制器液晶平面上每个像素的锥形初始相位
其中，r为目标全息光束所呈现出的图案的中间孔洞的半径；
S5、综合环形初始相位线性初始相位和锥形初始相位相加获得最终的初始相位
最后将初始相位输入到傅里叶迭代算法输出全息相位，由各个像素的全息相位组成了全息相位图。
本发明激光器输出线偏振的飞秒激光，首先经过半波片和偏振光分束器调节功率，再经过一个半波片调整线偏振光的偏振方向，以达到液晶空间光调制器最大调制效率。该线偏振飞秒激光经过液晶空间光调制器后输出高斯分布的高M2因子的平行光，再经过一组正交的柱透镜后，斜入射到反射式液晶空间光调制器上，要求入射角度小于10°。正交柱透镜组紧邻液晶空间光调制器平行放置，作用在于抑制像面上由液晶空间光调制器造成的零级衍射光，且能够保证像面上的一级衍射光效率最强。
在液晶空间光调制器上加载对应的全息相位图对入射激光进行相位调制后，液晶空间光调制器出射的光束经过一组由第二消色差透镜和第三消色差透镜构成的中继4F透镜进入时空聚焦模块，时空聚焦模块输出色散补偿后的激光经过二向色镜反射，再由物镜聚焦至实验样本上。
本发明的有益效果是：
本发明在计算全息相位图时，初始相位设定为按照一定规律分布的环形相位，该相位分布形式在傅里叶迭代过程中可以保留，则最终加载至液晶空间光调制器的全息相位图中相位奇点基本消除，全息光束中散斑噪声被完全消除。
本发明在全息双光子显微系统中增加时空聚焦模块，使激光能量在焦点域轴向上更加集中，获得无散斑噪声的高轴向分辨率的均匀全息光束。这种均匀全息光束的生成方法具有适用范围广泛、兼容性强、激发效率高等优点。
本发明能够将全息光束的散斑噪声消除。用于验证系统有效性的双光子荧光全息相位图像与目标全息相位图像的均方根误差在0.2左右(传统的傅里叶迭代算法的均方根误差在0.35左右)，因此激光的能量更加集中于重构全息相位图所在的位置，从而系统中的衍射效率能够大幅提升。实验结果验证，衍射效率能够提升一倍以上。
附图说明
为了更加详细而具体地解释本发明，结合以下附图进行描述。附图展示了验证本发明方法的系统图，列出了元件并作相应解释；
图1是本发明的系统示意图。
图2是本发明的计算得到的重构全息相位图。使用边长为12.5um的正五边形作为目标图形，(I)和(II)分别为传统方法和本发明计算方法得到的全息相位图。
图3是本发明的消除散斑噪声的归一化重构全息双光子荧光图像。使用荧光显微镜载玻片作为荧光样本，(I)为未消除散斑噪声的重构全息双光子荧光图像，(II)为本发明系统下消除散斑噪声的重构全息双光子荧光图像。图中白色曲线为延图中白色虚线的归一化光强曲线。比例尺：15um。
图中：飞秒激光器1，半波片2，偏振分束镜3，聚焦镜4，针孔5，第一消色差透镜6，一组长焦的正交柱透镜7，液晶空间光调制器8，第二消色差透镜9、第一反射镜10，第三消色差透镜11，第二反射镜12，第四消色差透镜13，反射式闪耀光栅14、光挡15，第三反射镜16，第五消色差透镜17，二向色镜18，物镜19，实验样本20，滤光片21，管透镜22，相机23。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施对本发明作进一步说明。
如图1所示，系统包括飞秒激光器1、半波片2、偏振分束镜3、聚焦镜4、针孔5、第一消色差透镜6、正交柱透镜7、液晶空间光调制器8、第二消色差透镜9、第一反射镜10、第三消色差透镜11、第二反射镜12、第四消色差透镜13、反射式闪耀光栅14、第三反射镜16、第五消色差透镜17、二向色镜18、物镜19、滤光片21、管透镜22和相机23。
飞秒激光器1发出飞秒激光束，飞秒激光束经过半波片2后入射到偏振分束镜3发生反射，偏振分束镜3的反射光束依次经聚焦镜4、针孔5、第一消色差透镜6后再透过正交柱透镜7入射到反射式液晶空间光调制器8发生相位调制，正交柱透镜7紧邻布置在液晶空间光调制器8前方，液晶空间光调制器8的反射调制光束再经正交柱透镜7透射后依次经第二消色差透镜9、第一反射镜10发生反射，第一反射镜10的反射光束再经第三消色差透镜11、第二反射镜12发生反射，第二反射镜12的反射光束经第四消色差透镜13、反射式闪耀光栅14发生反射，反射式闪耀光栅14的反射光束再经第三反射镜16反射、第五消色差透镜17透射后入射到二向色镜18发生反射，二向色镜18的反射光束经物镜19后产生全息光束照射到实验样本20，实验样本20被全息光束激发的荧光经物镜19逆反回到二向色镜18发生透射，二向色镜18的透射光束依次经滤光片21、管透镜22后入射到相机23。
偏振分束镜3、聚焦镜4、针孔5、第一消色差透镜6、液晶空间光调制器8沿同一直线的光轴布置；实验样本20、物镜19、二向色镜18、滤光片21、管透镜22和相机23沿同一直线的光轴布置。
针孔5和第一消色差透镜6构成第一组4F透镜组，第二消色差透镜9和第三消色差透镜11构成第二组4F透镜组，第四消色差透镜13和第五消色差透镜17构成第三组4F透镜组。
正交柱透镜7为长焦，长焦是指500mm以上，具体实施可选f＝1000mm。
二向色镜18为短通二向色镜。
正交柱透镜7分为两个柱透镜的正交组合并紧邻液晶空间光调制器平行放置。在液晶空间光调制器8上加载该两个柱透镜的正交组合的共轭相位，抑制物镜后像面上的零级衍射光(由液晶空间光调制器引起)。
反射式闪耀光栅14反射出0级光束和1级光束，在0级光束出射端布置光挡15，在1级光束出射端布置第三反射镜16。
液晶空间光调制器8的液晶平面和物镜19的后瞳面沿光路的光轴严格共轭，即液晶空间光调制8的液晶平面沿光轴的共轭位置位于物镜19焦面。
飞秒激光器1发出的飞秒激光呈高斯分布而形成高斯光。
飞秒激光经液晶空间光调制器8得到高斯分布的平行光，然后以10°的入射角斜入射至液晶空间光调制器8。
主要由第四消色差透镜13、反射式闪耀光栅14、第三反射镜16、第五消色差透镜17构成了时空聚焦模块，两个消色差透镜13、17间的焦点重合，且反射式闪耀光栅14位于该焦点处。这样时空聚焦模块包括由两个消色差透镜13、17组成的4F透镜组和位于两个消色差透镜13、17间焦点处的一个反射式闪耀光栅14组成。形成的时空聚焦模块提高全息双光子显微系统的轴向分辨率。
液晶空间光调制器8作为计算机生成的全息相位图器件，加载全息相位图，飞秒激光经过液晶空间光调制器8时被相位调制，在实验样本20上形成全息光束。
本发明中，全息相位图按照以下方式处理获得：
S1、根据目标全息光束和液晶空间光调制器(8)高斯光的半径按照以下公式处理获得液晶空间光调制器(8)的环形初相位系数c：
c＝(rout-1/πrin)/(rin/π)
其中，rin表示液晶空间光调制器(8)输入高斯光的半径，rout表示目标全息光束的外接圆半径；
S2、根据环形初相位系数c再按照以下公式处理获得液晶空间光调制器(8)液晶平面上每个像素的环形初始相位
其中，表示环形初始相位，x、y分别表示位于液晶空间光调制器(8)液晶表面上的像素在沿两个相互垂直方向上的坐标位置，exp()表示指数函数，i表示虚数；
S3、按照以下公式处理获得液晶空间光调制器(8)液晶平面上每个像素的线性初始相位
式中，kx和ky分别为液晶空间光调制器(8)液晶表面上x、y轴方向上的空间频率，Δx和Δy为目标全息相位图的质心距离中心的偏移量，θ为目标全息相位图的质心和中心之间连线与x轴方向之间的夹角；
S4、按照以下公式处理获得液晶空间光调制器(8)液晶平面上每个像素的锥形初始相位
其中，r为目标全息光束所呈现出的图案的中间孔洞的半径；
若图案具有中间孔洞，则r不为零，r为中间孔洞的外径；若图案不具有中间孔洞，则r为零。
S5、综合环形初始相位线性初始相位和锥形初始相位相加获得最终的初始相位
最后将初始相位输入到傅里叶迭代算法输出全息相位，由各个像素的全息相位组成了能消除散斑噪声的全息相位图，如图2(II)所示。
传统方法处理获得的全息相位图如图2(I)所示，本发明处理获得的全息相位图如图2(II)所示。对比图2(I)和图2(II)可见，传统方法处理获得的全息相位图相位随机变化，相邻像素存在相位突变，这些突变的相位形成相位奇点，造成全息光束中的散斑噪声。
本发明在全息相位图计算的傅里叶迭代算法中，将初始相位设定为按照特定规律分布的环形相位，因环形相位形式在傅里叶迭代过程中被保留，最终计算机生成的全息相位图中不存在相位奇点，全息光束中散斑噪声消除。与现有方法相比，本发明方法获得的全息光束的均方根误差降低～40％，衍射效率提升～100％。
具体实施为了表征该系统的聚焦全息光束的优异参数，以荧光成像为例进行说明。将荧光样本作为实验样本置于物镜焦面上，激发的荧光经过滤光片滤除杂散光，由管透镜收集聚焦，最终由相机呈现双光子荧光成像结果。
分别如图3(I)和图3(II)所示，图像底部的曲线显示出沿白色虚线分布归一化荧光强度曲线。图3中可见本发明方法获得的全息光束激发的荧光图像强度没有剧烈变化，整体图像强度更为均匀。计算两幅图像信噪比，(I)图为4.91，(II)图为10.45。双光子荧光图像的信噪比与全息光束衍射效率为正比关系，因此本发明方法获得的全息光束的衍射效率能够提升一倍以上。比例尺：15um。
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