阅读说明：本技术 沙棘提取物和多步萃取的提取方法及其用途 (Sea-buckthorn extract and multi-step extraction method and application thereof ) 是由 王洪伦 苏晨玉 胡娜 董琦 于 2020-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了沙棘提取物和多步萃取的提取方法及其用途,将沙棘与乙醇混合超声提取后,移除乙醇得预提取物,用水和石油醚对预提取物进行萃取,再将石油醚萃取后剩余的部位用乙酸乙酯萃取；再将乙酸乙酯萃取后剩余的部位用正丁醇萃取,剩余部分为水部位,本发明通过不同的溶剂萃取得到的沙棘提取物均对α-葡萄糖苷酶的活性具有很好的抑制作用,实现了沙棘有效物质的充分提取和利用,抑制能力优于现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖,可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂以及预防和/或治疗以α-葡萄糖苷酶为靶点的疾病的产品,安全高效。(The invention discloses a sea-buckthorn extract and a multi-step extraction method and application thereof, wherein sea-buckthorn and ethanol are mixed and ultrasonically extracted, the ethanol is removed to obtain a pre-extract, the pre-extract is extracted by water and petroleum ether, and the rest part after the petroleum ether extraction is extracted by ethyl acetate; the method has the advantages that the sea buckthorn extracts obtained by extracting different solvents have good inhibition effect on the activity of alpha-glucosidase, the full extraction and utilization of active substances of sea buckthorn are realized, the inhibition capability is superior to that of the existing alpha-glucosidase inhibitor acarbose, and the sea buckthorn extracts can be used for preparing alpha-glucosidase inhibitors and products for preventing and/or treating diseases with alpha-glucosidase as a target point, and are safe and efficient.)

沙棘提取物和多步萃取的提取方法及其用途

技术领域

本发明涉及沙棘中有效物质的提取领域，特别是涉及沙棘提取物和多步萃取的提取方法及其用途。

背景技术

沙棘(拉丁学名：Hippophae rhamnoides Linn.)，是一种胡颓子科、沙棘属落叶性灌木，其特性是耐旱、抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持。中国西北部大量种植沙棘，用于沙漠绿化。

沙棘果实营养丰富，据测定其果实中含有多种维生素、黄酮类化合物、三萜类化合物、油和脂肪酸、酚类、挥发油类、微量元素、磷脂类、5-羟色胺等活性物质和人体所需的各种氨基酸和蛋白质。

另外，目前沙棘广泛应用于沙棘果汁、沙棘原浆液的生产，在生产过程中，将沙棘榨汁后会产生大量的沙棘果渣，往往会被当作废料丢弃，或生产成干粉当作饲料，价格非常低廉。倘若能更多的开发出沙棘果渣的利用价值，将具有极大的经济意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种沙棘提取物及其提取方法，能够从沙棘果渣中提取出具有活性价值的提取物。

α-葡萄糖苷酶在食物吸收过程中起着重要的作用，必须与之结合后，食物才能消化和吸收。α-葡萄糖苷酶抑制剂的降糖机制是，通过抑制肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶，使淀粉分解为葡萄糖的速度减缓，减少和延缓小肠对葡萄糖的吸收，以降低血糖，对餐后高血糖的作用比较明显。

本发明通过实验表明，本发明通过不同的溶剂萃取得到的沙棘提取物均对α-葡萄糖苷酶的活性具有很好的抑制作用，抑制能力优于现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，其中，乙酸乙酯萃取得到的沙棘提取物抑制效果最优。

α-葡萄糖苷酶抑制剂不刺激胰岛素的分泌，单独使用此类药物通常不会引发低血糖，因此可帮助减少血糖的波动，可以明显降低糖尿病患者发生心血管病变的概率，对心肌梗死的改善作用最为显著。是少数可干预糖耐量受损的口服降糖药之一。据报道，α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对糖尿病有确切的疗效，而且对于肥胖症，慢性乙肝，艾滋病及肿瘤都有一定的治疗作用。

基于本发明的实验结果，本发明可以提供如下技术方案：

一种沙棘提取物A的提取方法，包括下列内容：将沙棘果渣与乙醇混合提取后，移除乙醇后得到预提取物，用水和石油醚对预提取物进行萃取，合并石油醚相移除溶剂得提取物A。

其中，沙棘果渣与乙醇混合提取的提取方式不限，只要是本领域可使用的提取方式均可适用于本发明，比如超声提取、回流提取、超高压提取、微波提取等等。

在本发明的

具体实施方式

中，沙棘果渣与乙醇混合提取的方式是超声提取。

本发明中，所述“用水和石油醚对预提取物进行萃取”，是指，采用水和石油醚这一溶剂系统进行萃取。若待萃取的物料中含适量水，则可以仅加入石油醚，形成水和石油醚溶剂系统，进行萃取；若待萃取的物料中不含水或含水量极低，则可以加入石油醚和适量水，形成水和石油醚溶剂系统，进行萃取；等等。

本发明还提供了一种沙棘提取物B的提取方法，采用上述方法，使用水和石油醚对预提取物进行萃取后，剩余的水相为A1，将水相A1用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相移除溶剂得提取物B。

本发明还提供了一种沙棘提取物C的提取方法，采用上述方法，使用乙酸乙酯对水相A1进行萃取后，剩余的水相为B1，将水相B1用正丁醇萃取，合并正丁醇相移除溶剂得提取物C。

正丁醇萃取后所剩余的水相减压浓缩后获得水部位D。

在本发明的具体实施方式中，沙棘果渣：乙醇的料液比为1g：1～15mL，优选1g：10mL；

进一步地，超声时温度为30～80℃，优选45℃；

进一步地，超声时间为1～5h，优选1～3h，更优选2h；

进一步地，乙醇浓度为95％。

更进一步地，超声功率为200W，频率为40KHz。

在本发明的具体实施方式中，预提取物：水的比例为1g：2～15mL；进一步为1g：3～10mL；更进一步为1g：9.5～10.5mL；

预提取物：石油醚的比例为1g：2～15mL；进一步为1g：3～10mL；更进一步为1g：9.5～10.5mL；

进一步地，水：石油醚的体积为1：0.5～1.5，优选为1：1；

进一步地，是先将预提取物溶解在水中，再与石油醚混合进行萃取。

在本发明的具体实施方式中，预提取物：乙酸乙酯的比例为1g：2～10mL；进一步为1g：3～9mL；更进一步为1g：8～9mL。

更进一步地，预提取物：正丁醇的体积比为1g：1～10mL，进一步为1g：2～8mL；更进一步为1g：7～8mL。

本发明还提供了采用上述的方法提取得到的沙棘提取物。

本发明还提供了本发明沙棘提取物在制备预防和/或治疗糖耐量受损、糖尿病、肥胖症、慢性乙肝、艾滋病、肿瘤中的一种或几种病症的产品中的用途。

糖耐量受损即糖尿病前期，主要包括空腹血糖受损(impaired fasting glucose,IFG)和糖耐量减低(impaired glucose tolerance,IGT)。可有效改善糖调节受损，预防和/或治疗糖耐量受损和/或糖尿病，同时也可预防或改善糖尿病并发症，可用于制备相关产品。

本发明还提供了本发明沙棘提取物在制备α-糖苷酶抑制中的用途。

本发明还提供一种产品，所述产品包含上述的沙棘提取物。

在本发明中，所述产品包括但不限于药品、保健品、食品等。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提取方法步骤简单，简便快捷，可高效得到沙棘提取物，通过多步萃取的方式，实现了沙棘有效物质的充分提取和利用。

(2)本发明通过不同溶剂萃取得到的不同沙棘提取物，通过试验验证了其都可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，效果优于阿卡波糖，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类产品，也可用于制备预防和/或治疗以α-葡萄糖苷酶为靶点的疾病的产品，如治疗糖耐量受损、糖尿病、高血压、肥胖症、慢性乙肝、艾滋病、肿瘤等疾病的产品，实现了废物利用，变废为宝。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)准确称取干燥的沙棘果渣1kg，置于容器中，加入10L乙醇(95％)，在45℃下超声提取2小时，超声功率为200W，频率为40KHz，超声结束后过滤得到滤液，旋蒸移除溶剂后减压浓缩即得预提取物浸膏405.36g。

(2)将405.36g预提取物用4000mL水溶解，加入4000mL石油醚进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物石油醚部位28.24g。

(3)将(2)中石油醚萃取后剩余的部位，加入3500mL乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物乙酸乙酯部位76.57g。

(4)将(3)中乙酸乙酯萃取后剩余的部位，加入3000mL正丁醇进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物正丁醇部位95.12g，正丁醇萃取后的剩余部分为水部位134.56g。

实施例2

(1)准确称取干燥的沙棘果渣1kg，置于容器中，加入15L乙醇(95％)，在80℃下超声提取1小时，超声功率为200W，频率为40KHz，超声结束后过滤得到滤液，旋蒸移除溶剂后减压浓缩即得预提取物332.54g。

(2)将332.54g预提取物用2000mL水溶解，加入2000mL石油醚进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物石油醚部位13.04g。

(3)将(2)中石油醚萃取后剩余的部位，加入1000mL乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物乙酸乙酯部位57.56g。

(4)将(3)中乙酸乙酯萃取后剩余的部位，加入800mL正丁醇进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物正丁醇部位75.74g，正丁醇萃取后的剩余部分为水部位108.05g。

实施例3

(1)准确称取干燥的沙棘果渣1kg，置于容器中，加入5000mL乙醇(95％)，在30℃下超声提取3小时，超声功率为200W，频率为40KHz，超声结束后过滤得到滤液，旋蒸移除溶剂后减压浓缩即得预提取物270.32g。

(2)将270.32g预提取物用1000mL水溶解，加入1000mL石油醚进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物石油醚部位11.02g。

(3)将(2)中石油醚萃取后剩余的部位，加入800mL乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物乙酸乙酯部位49.02g。

(4)将(3)中乙酸乙酯萃取后剩余的部位，加入600mL正丁醇进行萃取，合并有机相，旋蒸移除溶剂后即得本发明沙棘提取物正丁醇部位67.54g，正丁醇萃取后的剩余部分为水部位92.10g。

试验例1

1、试剂的配制

(1)甲液的配置：NaH₂PO₄·2H₂O称取15.603g，定容至500mL，4℃，棕色瓶保存，备用。

(2)乙液的配置：Na₂HPO₄·12H₂O称取35.822g，定容至500mL，4℃，棕色瓶保存，备用。

(3)0.1M磷酸缓冲液的配置：量取甲液51mL，乙液49mL，加入100mL水，混匀，得pH值6.8的磷酸缓冲液，4℃，棕色瓶保存，备用。

(4)酵母α-葡萄糖苷酶：将100U/ml酶原液用磷酸缓冲液(pH 6.8)稀释为20U/mL的酶溶液，冷冻备用，使用前用磷酸缓冲液(pH 6.8)稀释为1U/mL，备用。

(5)底物pNPG配制：精密称取0.3766g pNPG，加入适量的磷酸钠缓冲液中溶解，再定容至50mL，配制成25mmol/L母液，使用前用磷酸钠缓冲液配制成0.5mmol/L，备用。

(6)阿卡波糖抑制剂配制：精密称取13.9mg阿卡波糖，用DMSO定容至1mL，配制成13.9mg/mL，备用。

(7)0.1mol/L的Na₂CO₃配制：称取1.06g Na₂CO₃于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。

2、抑制剂的制备

精密称取100mg沙棘提取物至10mL容量瓶中，用少量DMSO溶解后定容至刻度，并用DMSO稀释4倍浓度为2.5mg/mL作为母液，需要使用时再稀释至适当的浓度，即得系列不同浓度沙棘提取物的抑制剂。糖苷酶抑制效果不好时，可重新配置更大浓度的母液，以获得受试物的IC50值用于后续的α-糖苷酶抑制作用的分析。

3、沙棘提取物对α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果实验

分别测定实施例1提取到的不同提取物对α-糖苷酶活性的抑制作用，测定方法为本领域内常规的测定对α-糖苷酶活性的抑制效果的方法，如下：

试验过程：在96孔板上按表1所示步骤进行试验，每组3个平行，将待测试剂、磷酸缓冲液和酶溶液混合均匀，在恒温振荡器中37℃保温10min，结束后，取出，加入50μL0.5mmol/L pNPG溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入50μL 0.1mol/L的Na₂CO₃溶液中止反应，在405nm波长下测定吸光值，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC 50值。

公式:

其中，Ac为空白组吸光值，A_B为对照组吸光值，As为样品组吸光值，A_SB为样品空白组吸光值。

计算IC50值，测定结果见表1。

表1试验步骤及方法(单位：μL)

表2不同部位对α-糖苷酶的IC50值

	石油醚部位	乙酸乙酯部位	正丁醇部位	水部位	阿卡波糖
						IC50(mg/mL)	0.401	0.053	0.471	6.824	1.273

阿卡波糖为一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，可抑制各种α-葡萄糖苷酶如麦芽糖酶、异麦芽糖酶、葡萄糖淀粉酶及蔗糖酶的活性，使淀粉分解成寡糖如麦芽糖(双糖)、麦芽三糖及糊精(低聚糖)进而分解成葡萄糖的速度减慢，使蔗糖分解成葡萄糖和果糖的速度减慢，因此造成肠道葡萄糖的吸收减缓，从而缓解餐后高血糖，达到降低血糖的作用。长期服用，可降低空腹血糖和糖化血红蛋白的浓度。

从上述实验结果可以看出，通过本发明不同溶剂萃取得到的不同洗沙棘提取物，均能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且效果均优于阿卡波糖，其中，乙酸乙酯萃取的提取物抑制作用最强，对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度远低于阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度，效果显著，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，也可用于制备治疗以α-葡萄糖苷酶为靶点的疾病的药物，如治疗糖耐量受损、糖尿病、高血压、肥胖症、慢性乙肝、艾滋病、肿瘤等疾病的药物。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。