阅读说明：本技术 含nmn的益智健脑药物组合物 (NMN-containing pharmaceutical composition for improving intelligence and strengthening brain ) 是由 沈洁 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：一种用于干预轻度认知功能损害的药物组合物,由NMN、高山火绒草提取物以及药学上可接受的辅料组成,其中高山火绒草提取物能显著降低NMN在干预轻度认知损害中的用药浓度。(A pharmaceutical composition for intervening mild cognitive impairment comprises NMN, a Leontopodium alpinum extract and pharmaceutically acceptable auxiliary materials, wherein the Leontopodium alpinum extract can remarkably reduce the administration concentration of the NMN for intervening mild cognitive impairment.)

含NMN的益智健脑药物组合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明提供一种含NMN的益智健脑药物组合物，用于抑制由氧化应激引起的轻度认知功能损害。

背景技术

轻度认知功能损害(Mild congnitive impairment，MCI)是指介于同等年龄及教育程度下的正常老化与Alzheimer病(AD)之间的一种过渡阶段的认知障碍，其主要病因是机体不可避免的氧化应激(Oxidative Stress，OS)伤害。因此，机体抗氧化治疗成为预防和抑制MCI的主要临床手段。

然而，临床发现利用常规抗氧化剂如维生素C、维生素E及β-胡萝卜素对改善氧化应激所造成的损伤收效甚微后，开始转向对天然抗氧化剂如白藜芦醇、二苯乙烯苷等物质的提取、功能、机理研究，虽然取得一定成效，但在临床过程中，因作用靶点和用药浓度存在个体差异，尤其是抗氧化物质通过血脑屏障后的浓度不能保证，难以进行大规模临床。

研究发现，NMN(Nicotinamide mononucleotide，烟酰胺单核苷酸)可通过激活Nampt-NAD防御系统，保护脑神经和促进血管及神经再生，对脑出血及脑出血转化成的神经损伤均有较好的保护作用，是潜在的抗卒中治疗药物。其作用机理是NMN可以降低梗死组织中血红蛋白的含量，减轻出血和水肿，降低由氧化应激造成的脑组织氧化毒性损伤。然而，其并未证实，NMN能抑制机体在自然衰老的过程中不可避免的OS伤害；更为重要的是，伴随衰老的OS损伤过程是缓慢、持续的，且不会产生因出血导致的急性、大规模损伤，因此其用药浓度、方式和药理必然存在天壤之别。

发明内容

本发明提供一种含NMN的益智健脑药物组合物，用于抑制由氧化应激引起的轻度认知功能损害。本发明还提供一种含NMN的益智健脑药物组合物的制备方法。

本发明提供一种药物组合物，由NMN、高山火绒草提取物以及药学上可接受的辅料组成。

优选的，本发明的药物组合物中，NMN：高山火绒草提取物的质量份数比为1-10:10-1000；

更为优选的，本发明的药物组合物中，NMN：高山火绒草提取物的质量份数比为1-2:500-800,例如，1-2:600。

进一步的，本发明的药物组合物中的高山火绒草提取物的提取方法包括如下步骤：

1)用低级醇超声预处理高山火绒草鲜草或鲜高山火绒草细胞培养物；

2)高温水浸提1)的预处理产物，浸提产物经离心或抽滤后得A液；

3)用低级醇索氏提取高山火绒草干粉得B液；

4)将A液与B液等比混合，减压浓缩后冻干得高山火绒草提取物。

进一步的，本发明的药物组合物是将NMN和高山火绒草提取物按质量分数比混合后制备的。

进一步的，本发明的药物组合物中高山火绒草提取物的制备方法包括如下步骤：

1)向1份质量的高山火绒草鲜草粉末或鲜高山火绒草细胞培养物中加入2倍体积的低级醇后(料液比1:2(m/v))，在25-30℃的条件下200-300W超声预处理10-30min；

2)向超声预处理产物中加入5-10倍体积的纯水，在80-120℃的条件下浸提1-2h，浸提产物经离心或抽滤后得A液；

3)向1份质量的高山火绒草干草粉末中加入10-20倍体积的低级醇，索氏提取至无色后得B液；

4)等体积混合A、B液，经减压浓缩后冻干得高山火绒草提取物。

进一步的，本发明的药物组合物中高山火绒鲜草粉末须在超声预处理前10-30min内预制。

进一步的，本发明的药物组合物中高山火绒干草粉末须在醇提前泡发。

进一步的，本发明的药物组合物中高山火绒草提取物的制备工艺中用到的低级醇为乙醇或丁二醇。

优选的，高山火绒草提取物的制备工艺中用到的低级醇为乙醇。

进一步的，本发明提供的药物组合物包含NMN和高山火绒草提取物。药物组合物指的是用于配制成药物的具有医疗活性的组合物，除医疗活性组合物外，还包括适量药学上可接受的辅料。

进一步的，本发明的药物组合物还包括称取配方量的NMN,与高山火绒草提取物等比倍比混合，混合后加入适量药学上可接受的辅料制剂成型即可。

在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与药物活性成分相容。运用药学上可接受的辅料制备药物制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。

本发明的药物组合物包含本发明NMN和高山火绒草提取物组合物作为活性成分，将该组合物和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂，如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、混悬剂、颗粒剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液等剂型以及各种缓释剂型，优选以口服给药形式。

在本发明的

具体实施方式

中，用于抑制由氧化应激引起的轻度认知功能损害，以烟酰胺单核苷酸计的剂量为每天5-10ng/kg体重。

在本发明的具体实施方式中，高山火绒草鲜草与培养的高山火绒草的植物细胞是等效的，可以相互替换。

在本发明的具体实施方式中，高山火绒草干草是指自然风干、冻干或经烘干炮制后再破碎的粉末。

在本发明的具体实施方式中，高山火绒草的粉末是指粒径小于等于0.5cm的草屑。

在本发明的具体实施方式中，同批次针对相同质量的干草和鲜草提取时，分别加入的液体总体积约为2:1。

在本发明的具体实施方式中，用于超声预处理的低级醇优选为乙醇，其用相同质量或体积的丁二醇替换，不影响工艺效果。

在本发明的具体实施方式中，超声提条件可根据超声效果在本发明给出的范围内进行调整。

本发明制备的药物组合物用于干预轻度认知损害。

本发明人发现，高山火绒草中主要含有火绒草酸、绿原酸、黄酮、咖啡酰奎宁酸类、酚类等生物活性物质；而高山火绒草在干燥或冻存过程中，细胞的活性成分尤其是黄酮、绿原酸或咖啡酰奎宁酸类物质会因为处理工艺或自身酶解而大量丧失，甚至难以通过常规提取工艺获取；同时，提取物中的有效成分和含量会伴随提取工艺的不同而呈现显著的差异。不同提取物在与NMN配伍后，用于抑制由氧化应激引起的轻度认知功能损害的效力也差异显著。在综合利用水提高山火绒草鲜草粉末或鲜高山火绒草细胞培养物以及醇提高山火绒草干草粉末的基础上，配以适当比例的NMN，能取得对抑制由氧化应激引起的轻度认知功能损害的最优效果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1高山火绒草提取物的制备

准确称量高山火绒草鲜草1000g，破碎预制成粉末，以料液比1:2(m/v)加入95％浓度的乙醇2000mL，搅拌混合后，超声处理15min(超声功率：300w，超声温度：25℃)。在超声破壁处理过的高山火绒草溶液中加入细胞质量8倍的纯水8L，在100℃的高温下进行提取，提取时间为1h，之后进行6000g离心10min，所得上清液为A液。

准确称量高山火绒草干草粉末1000g，分批次以料液比1:10(m/v)加入95％浓度的乙醇10000mL进行索氏提取至无色，6000g离心10min收集提取液为B液。

取3L A液和3L B液，混合均匀后，减压浓缩后冻干得高山火绒草提取物C。

余下的A液和B液经减压浓缩后冻干分别得高山火绒草提取物A和B。

实施例2药物组合物的制备

称取0.1g NMN与60g提取物A等比倍比混合均匀后，即得药物组合物A；

称取0.1g NMN与60g提取物B等比倍比混合均匀后，即得药物组合物B；

称取0.1g NMN与60g提取物C等比倍比混合均匀后，即得药物组合物C。

实施例3药物组合物对ApoE基因敲除小鼠认知功能干预实验

实验材料：

1)实验动物：8周龄ApoE基因敲除雄性小鼠72只，8周龄相同遗传背景C57BL/6J雄性小鼠8只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于我司清洁级动物房分组暂养。

2)试验药物：

本发明实施例2制备的药物组合物；

NMN:邦泰生物工程(深圳)有限公司。

3)主要实验仪器

避暗穿梭测试仪、Morris水迷宫系统(包括摄像和分析系统)均购自上海软隆科技发展有限公司。

实验方法：

1)分组：

将72只ApoE基因敲除小随机分为9组，即药物A组、药物B组、药物C组、NMN对照一组、NMN对照二组、NMN对照三组、提取物对照一组、提取物对照而组及空白对照组，每组8只；8只同品系C57BL/6J小鼠为对照组。

2)给药：

将小鼠正常喂养至16周龄，用药实验组用药物组合物灌胃24周，空白对照组及对照组以同体积生理盐水灌胃24周，每日灌胃一次。具体分组及给药如下：

药物A组：正常饲养至16周龄后，将药物组合物A(以NMN质量15ng/只计)溶于0.5ml生理盐水，每日连续灌胃24周；

药物B组：正常饲养至16周龄后，将药物组合物B(以NMN质量15ng/只计)溶于0.5ml生理盐水，每日连续灌胃24周；

药物C组：正常饲养至16周龄后，将药物组合物C(以NMN质量15ng/只计)溶于0.5ml生理盐水，每日连续灌胃24周；

NMN对照一组：正常饲养至16周龄后，将NMN溶于生理盐水，按15ng/只，每日连续灌胃24周(灌注药物体积0.5ml)；

NMN对照二组：正常饲养至16周龄后，将NMN溶于生理盐水，按100ng/只，每日连续灌胃24周(灌注药物体积0.5ml)；

NMN对照三组：正常饲养至16周龄后，将NMN溶于生理盐水，按200ng/只，每日连续灌胃24周(灌注药物体积0.5ml)；

提取物对照一组：正常饲养至16周龄后，配制20mg/ml的高山火绒草提取物C的生理盐水溶液，0.5ml/只，每日连续灌胃24周；

提取物对照二组：正常饲养至16周龄后，配制200mg/ml的高山火绒草提取物C的生理盐水溶液，0.5ml/只，每日连续灌胃24周；

空白对照组：正常饲养至16周龄后，每日用0.5ml生理盐水灌胃，连续灌胃24周。

对照组：正常饲养至16周龄后，每日用0.5ml生理盐水灌胃，连续灌胃24周。

3)避暗实验

给药前两天和给药结束后两天，分别进行避暗实验。第一天将小鼠尾部朝向洞口放入明室，让其适应环境5min，然后给暗室栅栏通电(36V)，小鼠只要进入暗室即受电击，其正确反应是回到明室，再次进入暗室即为错误行为，暗室栅栏持续通电5min，训练结束。第二天对小鼠进行记忆测验，记录小鼠第一次进入暗室的时间(即规避潜伏期)，并记录5min内小鼠进入暗室的次数，5min内未进入暗室的小鼠其潜伏期按300s计算。

表1各组受试小鼠用药前避暗试验结果

表2各组受试小鼠用药后避暗试验结果

16周龄时ApoE小鼠(空白对照组)与C57BL/6J小鼠(对照组)认知能力差异不显著。

用药前的避暗试验中，各组小鼠第二天测试阶段的犯错次数略少于第一天学习阶段，各组小鼠之间测试阶段的潜伏时间差异不显著。

40周龄时，ApoE小鼠(空白对照组)与C57BL/6J小鼠(对照组)认知能力差异显著。

用药后的避暗试验中，药物C组、NMN对照三组与对照组的小鼠认知能力或学习能力差异显著。其余用药组与空白对照组小鼠的认知能力差异不显著。

4)Morris水迷宫实验

用药结束第二天开始Morris水迷宫定位巡航实验，巡航实验历时6天，其中训练5天，正式测试1天。在池壁上悬挂4个易于辨识的入水点标识，同时对应的将水池分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限，在第Ⅲ象限内设置隐匿平台。小鼠训练第一天，隐匿平台露出水面1cm左右，并在其上端放置红色旗形标识便于受训小鼠识别并记忆；训练第二至五天，将隐匿平台置于水下1cm左右，并拆除其上端的旗形标识；小鼠每天逐一从每个象限入水点处各入水一次，由图像采集及处理系统记录小鼠航行轨迹、找到隐匿平台的时间(即逃避潜伏期)等；训练期间，若受训小鼠60s内未找到隐匿平台，则逃避潜伏期按60s计算，并人为引导小鼠至平台休息20s后捞出；第六天进行正式测试，测试方法与训练发放一致，并采集各项数据。

Morris水迷宫空间探索实验，在受试小鼠完成定位巡航试验次日进行。小鼠入水步骤不变，将位于第Ⅲ象限内的隐匿平台拆除，记录其在5min内在第Ⅲ象限内的滞留时长并计算穿台次数。

表3用药后各组小鼠水迷宫巡航实验成绩

组别	第1天(s)	第2天(s)	第3天(s)	第4天(s)	第5天(s)	第6天(s)
							药物A组	57.29	57.34	56.47	54.36	52.46	50.39
药物B组	58.79	56.43	54.73	53.23	52.84	49.41
							药物C组	56.87	53.86	49.68	43.83	35.26	33.24
NMN对照一组	59.07	58.31	54.57	54.63	50.99	49.87
							NMN对照二组	56.72	54.65	52.19	44.31	39.84	37.52
NMN对照三组	58.12	53.69	49.37	44.54	37.27	32.37
							提取物对照一组	58.87	56.13	54.67	52.92	52.43	49.74
提取物对照二组	59.19	59.24	57.85	54.36	53.28	50.12
							空白对照组	59.93	59.19	57.75	54.36	51.75	49.42
对照组	57.36	53.24	48.25	43.77	34.49	31.27

表4用药后各组小鼠水迷宫探索实验成绩

组别	穿台次数(次)	第Ⅲ象限滞留时长(s)
			药物A组	3.62	44.62
药物B组	3.25	41.96
			药物C组	8.75	59.94
NMN对照一组	3.88	42.54
			NMN对照二组	5.88	51.13
NMN对照三组	9.13	58.52
			提取物对照一组	2.63	39.96
提取物对照二组	2.25	43.86
			空白对照组	2.75	40.78
对照组	9.87	62.71

水迷宫定位巡航实验中，第一天各组受试小鼠的实验成绩均无明显差异，随着训练时间的延长，各组受试小鼠平均逃避潜伏期时长呈下降趋势；从训练至第四天开始，药物C组、NMN对照三组与对照组的小鼠均显著由于空白对照组，且随着时间推移至第六天，其逃避潜伏期时长较空白对照组显著缩短，但上述三组小鼠之间的逃避潜伏期时长差异不显著。

在水迷宫空间探索实验中，各受试组小鼠的成绩与水迷宫定位巡航实验呈相同规律，药物C组、NMN对照三组与对照组的小鼠均显著由于空白对照组，且三组之间差异不显著。

上述实验结果表明，NMN能有效干预ApoE基因敲除小鼠的认知功能(由于氧化应激引发的认知障碍)，但需要较高的用药浓度。高山火绒草提取物虽具备抗氧化作用，但是即使在较高浓度下也不能单独干预ApoE基因敲除小鼠的认知功能，但是能促进NMN对ApoE基因敲除小鼠的认知功能的干预效力，显著降低NMN的用药浓度。且本申请发明人发现，只有高山火绒草干草与鲜草提取物的混合物才具有促进NMN对ApoE基因敲除小鼠的认知功能的干预效力。

上述实施例是发明的最优实施例，在本发明技术方案中关于药物组方配比的范围内所制备的组合物，均具有近似的技术功效。本领域技术人员在本发明技术思想的指导下，通过简单的技术替换实现近似技术效果的技术方案，应均属于本发明的保护范围。