一种止血凝胶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种止血凝胶及其制备方法和应用 (Hemostatic gel and preparation method and application thereof ) 是由 喻青松 甘志华 牛昆 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种止血组合物及其制备方法和应用。所述止血组合物为凝胶的形式,包含壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯,二者的重量比为1:(0.5-10)。本发明提供的止血凝胶组合物有较好的流动性和可塑性的糊状物质,在腋窝、腹股沟等不可压迫型出血模型中,可以较好的填充空隙并密闭创面。可以应用在多种复杂的不规则创口,且可以很好的封闭创面并快速止血。适用于单兵作战中枪械贯穿伤等常规止血敷料无法有效填塞止血的深部大出血现场急救止血,可有效防止大出血导致的死亡,为下一步的送医和治疗争取了宝贵的抢救时间。(The invention discloses a hemostatic composition, a preparation method and application thereof. The hemostatic composition is in the form of gel, and comprises chitosan and fucoidan sulfate in a weight ratio of 1 (0.5-10). The hemostatic gel composition provided by the invention has good fluidity and plasticity of pasty substances, and can better fill gaps and seal wound surfaces in incompressible bleeding models such as armpits and groin. Can be applied to various complicated irregular wounds, and can well seal the wound surface and stop bleeding quickly. The hemostatic dressing is suitable for on-site emergency hemostasis of deep major hemorrhage, wherein the conventional hemostatic dressings such as firearms puncture wound and the like cannot effectively fill hemostasis in single-soldier operation, can effectively prevent death caused by major hemorrhage, and strives for precious rescue time for next medical delivery and treatment.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种止血凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
大出血是战场死亡的主要原因。尤其是在现代战争中，需要地面战斗人员 直接介入的主要是后期的城市战争(即巷战)和特种作战，这两种情况下战场 一般远离后方基地，而且战斗人员相对分散，不利于战场紧急救治。因此，开 发适合单兵使用的战场高效应急止血材料对现代战争背景下的战场救援具有重 要意义。
目前，随着各国军队对防弹衣的重视，内腔出血情况有所减少，四肢出血 仍然是战场最常见的状况。根据美军调查结果，由于四肢失血而导致的死亡占 到所有可预防死亡人数的一半以上，其中尤以颈脖、腋窝、腹股沟等无法应用 止血带的部位失血为主。针对此问题，美军战术战伤护理课程的一个重要原则 是，通过院前使用简单有效的出血控制方法，如止血敷料、止血器或二者的组 合，可以显著增加伤员的生存几率。
众所周知，人体血液自身的凝结和密封能力并不足以控制严重的出血症状， 且这种能力在创伤和大量失血后通常会显著减弱。因此，使用止血敷料或器械， 以及增强血液凝结的药物，对于阻止严重出血和防止受伤士兵死亡而言至关重 要。在***战争之前，美军主要采用野战绷带处理战场失血。随着***战 争和阿富汗战争的进行，美军加速了除纱布外的新型战场止血材料的研制。这 些新型止血装备总体可分为止血敷料和止血颗粒/粉末两大类。从材料来源区分， 止血材料主要包括无机止血材料(沸石、高岭土等，通过高比表面积快速吸附 血浆中的水分或刺激凝血因子的释放从而加速凝血)、植物基止血材料(氧化 纤维素、氧化再生纤维素等)、明胶基止血材料(通过快速吸收血浆中的水分 而引发凝血)、胶原基止血材料、纤维蛋白基止血材料(富含高浓度纤维蛋白 原和凝血因子)、凝血因子基止血材料以及甲壳素基止血材料。图1展示了目前 国外常见的的一些快速止血材料，例如
虽然局部止血敷料的应用获得推广，但在实际应用过程中也面临着诸多问 题。首先，止血敷料须直接接触出血位点，因此一般只适用于较大的开放性伤 口，而对于出血部位较深且开口较小的伤口很难有效止血；其次，由于止血材 料与出血部位接触后一般需要外力按压协助止血，因此对***等造成的多部位 大量失血通常难以处置。为此，CoTCCC在2016年建议在腹股沟和腋下部位大量 失血的情况下应用一种名为的新型止血材料。其主要成分是壳聚糖包 覆的纤维素海绵，与传统止血敷料需要外力压迫不同的是，在吸收血液 中的水分后迅速膨胀从而产生从内而外的压力，因此无需外力作用即可有效止 血。据称其止血时间可以缩短至15秒钟，这对于战时紧急止血具有重要意义。但对受伤部位和伤口尺寸都有要求，例如主要针对腋窝、腹股沟等无法 实施外力压迫部位所受的开口在4.5cm左右且具有空腔结构的伤口，对其它自身 无法提供足够压迫力开放式伤口的止血效果并不优于其它止血敷料。
基于止血领域的现状，对于不可按压型创口出血，亟需一种可注射的、有 较好流动性和较好不规则创面密封效果的凝胶敷料，以实现多种复杂止血情况 的快速止血。
发明内容
本发明提供一种止血组合物，其包括凝胶，所述凝胶包含壳聚糖和褐藻多 糖硫酸酯。
根据本发明的实施方案，所述壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯的重量比为 1:(0.5-10)，例如1:(1-6)、1:(1-5)、1:(2-5)、1:(2-4)，示例性为1:1、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:6。
根据本发明的实施方案，所述凝胶还含有水。优选地，所述凝胶由包含壳 聚糖、褐藻多糖硫酸酯和水的原料形成。其中，所述水可以为超纯水和重蒸水 中的一种，优选为超纯水。
根据本发明的实施方案，所述褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan，FPS)为海藻的 一种提取物，是一类独特的结合有硫酸基的水溶性岩藻聚糖，存在于多种海藻 中，例如褐藻、海带、巨藻、泡叶藻、墨角藻等，在褐藻中更为多见。褐藻多 糖硫酸酯以岩藻糖和硫酸基为主，其中，岩藻糖的重量百分含量为15％-35％， 硫酸基的重量百分含量为15％-35％。
根据本发明的实施方案，所述褐藻多糖硫酸酯的纯度≥95％，例如纯度≥ 97％，示例性地，其纯度为96％、98％、99％或100％。
根据本发明的实施方案，所述壳聚糖是一种天然的海洋碱性多糖，其是从 虾、蟹等甲壳类动物的外壳中提取的甲壳素经脱乙酰后所得到的高分子物质。 其中，所述壳聚糖的脱乙酰度≥95％，例如脱乙酰度≥97％，示例性为95％、96％、 97％、98％。
根据本发明的实施方案，所述壳聚糖的黏度为100-500mpa·s，例如100-200mpa·s。
根据本发明的实施方案，所述壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯为粉体。例如，其 粒径可以为50-200目，例如80-160目。
根据本发明的实施方案，所述凝胶的复合粘度为1500-2000Pa·s，例如为 1600-1900Pa·s或1700-1800Pa·s。所述凝胶有较好的流动性和可塑性，可以涂覆 在各种不规则表面，比如所述凝胶在有沟壑的出血部位可以直接挤出填充，密 闭塑形。
根据本发明的实施方案，所述凝胶有较好的生物相容性，对机体无害。
根据本发明的实施方案，所述组合物中还任选包括至少一种负载物，所述 负载物利用凝胶作为搭载平台。例如，所述负载物为止血药物、抗菌药物和促 愈合药物中的一种、两种或更多种。其中，所述止血药物、抗菌药物和促愈合 药物可以选自本领域已知药物，例如所述止血药物可以选自凝血酶、凝血酶原 复合物、凝血质、维生素K1和二乙酰氨乙酸乙二胺等中的至少一种，优选为凝 血酶；例如所述抗菌药物可以为抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类和喹诺 酮类等中的至少一种；所述促愈合药物可以选自维生素E和表皮生长因子等中的 至少一种。
根据本发明的实施方案，所述止血组合物为凝胶的形式，因此也称为“止 血凝胶组合物”、“止血组合物凝胶”或者“止血凝胶”。
根据本发明的实施方案，可以将所述组合物涂覆在基材(例如医用纺织物) 上，在使用时，借助医用纺织物覆盖创口，并可以按压塑形，适用于各种创口。
根据本发明的实施方案，还可以将所述组合物装入合适的容器中，例如注 射器、医用塑料软袋、医用软管等，优选为注射器和软管。
本发明还提供所述组合物的制备方法，其包括如下步骤：将壳聚糖、褐藻 多糖硫酸酯和水混合均匀，静置形成凝胶。优选地，所述壳聚糖和褐藻多糖硫 酸酯具有如上文所述的重量比。
根据本发明的实施方案，所述组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)分别配制壳聚糖水溶液和褐藻多糖硫酸酯水溶液；
优选地，所述壳聚糖水溶液的浓度为0.1-0.5g/mL；例如为0.2-0.4g/mL；示 例性地，浓度为0.2g/mL、0.3g/mL、0.4g/mL；
优选地，所述褐藻多糖硫酸酯水溶液的浓度为0.5-1.5g/mL；例如为0.7-1.2 g/mL；示例性地，浓度为0.9g/mL、1.0g/mL、1.1g/mL；
(2)将所述壳聚糖水溶液倒入所述褐藻多糖硫酸酯水溶液中，混合均匀， 静置，得到凝胶；
优选地，所述壳聚糖水溶液缓慢地倒入所述褐藻多糖硫酸酯水溶液中，并 在搅拌条件下进行。优选地，所述混合也在搅拌条件下进行，例如搅拌1-5h，优 选搅拌1.5-4h，示例性搅拌2h。例如，所述搅拌的转速为300-1000r/min，优选400-600r/min，示例性为500r/min。
优选地，所述静置的时间可以为5-40h，例如8-24h，示例性为10h、12h、15h。
优选地，以褐藻多糖硫酸酯:壳聚糖＝4:1的重量比混合制备。优选地，壳聚 糖水溶液为0.25g/mL，褐藻多糖硫酸酯水溶液为1g/mL。优选地，所述壳聚糖水 溶液与所述褐藻多糖硫酸酯水溶液的体积比为1:1。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还任选包括以下步骤：将所述凝胶 均匀涂敷在基材上，例如将所述凝胶均匀涂敷在所述医用纺织物上。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还任选地包括以下步骤：将所述凝 胶装入合适的容器中，例如注射器、医用塑料软袋、医用软管等，优选注射器。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还任选包括以下步骤：对所述凝胶 和/或涂覆了所述凝胶的基材进行灭菌的步骤。
本发明还提供所述组合物在制备止血制剂中的应用。
本发明还提供一种包含所述组合物的止血制剂，所述止血制剂可以是贴剂、 软膏剂或注射剂等。
根据本发明的实施方案，所述止血制剂用于不可压迫创面和/或不规则创面 处的止血，比如由(单兵作战中的)枪弹、锐器等枪械造成的贯穿伤等，尤其 是传统止血产品不能适用的腹股沟、腋下等部位的大出血，可以迅速密闭创口， 防止大出血发生。
本发明所示的组合物中，凝胶由壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯与水混合而成。 壳聚糖由于结构中的氨基在酸性条件下而带正电，所以易结合血液中带负电荷 的红细胞、白细胞和血小板等有形成分，在伤口处形成细胞栓子或凝血栓从而 抑制出血。褐藻多糖硫酸酯溶于水后易成胶，以褐藻多糖硫酸酯为基质，混合 壳聚糖在其中，壳聚糖富含氨基、带正电荷，可以和褐藻多糖硫酸酯中的硫酸 基(负电荷)产生交联，形成凝胶。凝胶网络的示意图如图2所示，其中带正电 荷的代表壳聚糖，负电荷的代表褐藻多糖硫酸酯。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的含有由壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯形成的凝胶组合物属于一 种新式止血敷料，通过调节二者配比，使凝胶组合物具有较好的流动性和可塑 性，达到黏附能力和凝胶强度之间的平衡。从而使该凝胶组合物能够涂覆在各 种复杂不规则创口表面，并起到较好的密闭作用和止血作用。
2.本发明提供的凝胶组合物具有良好的生物相容性，作用于伤口后，对机 体无害。
3.本发明提供的凝胶组合物的制备方法条件温和、操作简单、产率较高， 能够扩大量生产，可有效应用于工业生产中。
4.本发明提供的凝胶组合物可以有效应用于止血领域，尤其应用于不可压 迫型出血、不规则创口密封和快速止血。
5.本发明提供的凝胶制剂在腋窝、腹股沟等不可压迫型出血模型中，可以 较好地填充伤口空隙并密闭创面，阻止血液流出，起到快速止血作用。另外在 内脏出血的模型中，也可以完成快速密闭及止血的任务。其适用于单兵作战中 枪械贯穿伤等常规止血敷料无法有效填塞止血的深部大出血现场急救止血，可 有效防止大出血导致的死亡，为下一步的送医和治疗争取了宝贵的抢救时间。
附图说明
图1为美军在***战争和阿富汗战争期间开发的止血敷料与止血粉末产 品图片。其中，A为QuickCombatB为Gauze，C为 D为E为
图2为壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯形成的凝胶网络的结构示意图。
图3为本发明实施例5测试的止血凝胶的流动性表征图。
图4为本发明实施例7测试的壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯分别按照重量比1:1 (实施例1)、1:2(实施例2)混合得到的止血凝胶的止血过程的照片。
图5为本发明实施例7测试的壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯分别按照重量比1:4 (实施例3)、1:6(实施例4)混合得到的止血凝胶的止血过程的照片。
图6为本发明实施例7测试的各止血凝胶在小鼠股动脉止血模型的出血量 图。
图7为本发明实施例8测试的小鼠股动脉止血3天后的创口表面和股动脉血 管形态的照片。
图8为本发明实施例9测试的各止血凝胶在小鼠肝脏出血模型中的止血情况 的照片。
图9为本发明实施例9测试的各止血凝胶在小鼠肝脏出血模型的出血量图。
图10为本发明实施例10测试的各止血凝胶在兔子肝脏出血模型中的止血过 程的照片。
图11为本发明实施例10测试的各止血凝胶在兔子肝脏出血模型中的出血量 图。
图12为本发明实施例10测试的各止血凝胶止血后的肝脏创口表面形态的照 片。
图13为本发明实施例11所示的止兔子股动脉出血模型的构建方法的照片。
图14为本发明实施例11所示的各止血材料在兔子股动脉出血模型中的止血 过程的照片。
图15为本发明实施例11测试的各止血材料在兔子股动脉出血模型中的出血 量图。
图16为本发明实施例11测试的止血凝胶止血后的股动脉创口表面形态的照 片。
图17为本发明实施例12测试的止血凝胶在MCF-7细胞中的细胞毒性结果 图。
图18为本发明实施例12测试的止血凝胶在3T3细胞中的细胞毒性结果图。
图19为本发明实施例13测试的负载凝血酶的止血凝胶在小鼠股动脉止血模 型中的止血情况的照片。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当 理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明 保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保 护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以 通过已知方法制备。
实施例1-4：止血凝胶及其制备
下述实施例中使用的壳聚糖(脱乙酰度≥95％，黏度100-200mpa·s)采购于 阿拉丁试剂公司，褐藻多糖硫酸酯(纯度98％)采购于西安通泽生物科技有限公 司。
止血凝胶的制备过程包括：
(1)将壳聚糖溶解在超纯水中，制备得到0.25g/mL的壳聚糖水溶液。
(2)将褐藻多糖硫酸酯溶解在超纯水中，制备得到1g/mL的褐藻多糖硫酸 酯水溶液。
(3)在搅拌机500r/min的条件下，分别按照下述比例：实施例1中壳聚糖和 褐藻多糖硫酸酯的重量比为1:1、实施例2中壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯的重量比为 1:2、实施例3中壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯的重量比为1:4、实施例4中壳聚糖和褐 藻多糖的重量比为1:6，把壳聚糖水溶液缓慢倒入褐藻多糖硫酸酯水溶液中，并 搅拌2h使之混合均匀，取出，静置过夜，将得到的凝胶移入密封容器中。
(4)制备好的凝胶使用γ射线辐照灭菌，将其密封于注射器中，-4℃的条 件下储存备用。
制备成型的凝胶的凝胶网络结构示意图如图2所示。
实施例5：止血凝胶的流动性表征
使用流变仪对实施例3的凝胶进行了流变性质的表征，使用应力控制流变仪 (HR-1，TA Instrument)测量，使用20mm平板，涂覆实施例3凝胶在平板中心 约4cm2，设置参数为频率不变，温度不变，应力为横坐标变化，观察模量和复 合粘度的变化。表征结果如图3所示。可以看出，实施例3凝胶的储能模量大于 损耗模量，证明其胶体性，且有一定的抗相转变特性。其中，储能模量可以表 示凝胶抵抗应变的能力，实施例3的凝胶最大储能模量可以达到10KPa，显示了 较高的强度。复合粘度表示流体对流动所表现出来的阻力。实施例3凝胶的复合 粘度为1700Pa·s。
实施例6：止血凝胶的粘附能力
体外的组织粘附能力模拟，使用自制的测试粘附能力的装置完成。该装置 由两片等大的玻璃片和拉力计组成，玻璃片的两端固定上拉环，测试时，用医 用组织粘合胶粘合两块等大猪皮到两个玻璃片上，之后一个玻璃片的拉环连接 拉力计，另一个玻璃片的拉环固定不动，把实施例1-4的凝胶等量涂覆到猪皮组 织表面至全覆盖，把两个黏在玻璃片上的猪皮贴合，并用外力向反方向施力， 拉力计设定为“峰值”模式，记录下两片猪皮组织间所能承受的最大粘附力。
结果如表1所示，显示了实施例2和3凝胶具备很好的组织粘附力。
表1
实施例7：小鼠股动脉大出血模型上的止血实验
方法：
15只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(购自北京斯贝福生物技术有限公司)，随 机分为5组，每组3只，实验组中分别给予实施例1-4的不同四组止血凝胶，空白 组不给予止血条件。
实验步骤：
1.动物麻醉
小鼠采用异氟烷呼吸麻醉，实验过程中根据动物的心率、摆尾反应等调整 麻醉吸入量。
2.制造创伤并止血
在小鼠股动脉区体表用指腹触摸确定股动脉搏动处，手术剪开小鼠皮肤以 暴露股动脉血管，并使用手术刀割开血管，之后涂覆止血凝胶，涂覆量为小鼠 体重的4％-8％。止血过程中使止血材料填满创口腔隙，保持止血凝胶材料涂覆 1min，1min后去除止血凝胶材料，观察创口形态和出血情况，并记录过程中的 出血量。
结果：
实施例1-4的四组不同壳聚糖和褐藻多糖硫酸酯配比的凝胶的止血过程如图 4和图5所示。其中，图4中的(a)和(b)显示的是实施例1组止血中和止血后 创面的图像，图4中的(c)和(d)显示了实施例2组止血中和止血后创面的图 像。图5中的(a)和(b)显示了实施例3组止血中和止血后创面的图像，图5中 的(c)和(d)是实施例4组的止血中和止血后创面的图像。可以观察到，实施 例1组由于壳聚糖比例较高，导致凝胶整体流动性较差，可注射性差。随着褐藻 多糖硫酸酯的比例提升，凝胶流动性和可注射性也提升，但是并不是越高越好， 可以看到在实施例4组的止血中，止血效果则较差，凝胶外渗血出现，并且不能 完成止血任务。兼顾流动性和止血性能，发明人发现实施例2和3组的混合凝胶 能够达到较好的平衡，既有很好的流动性，可以很好地填充密闭不规则创口， 又可以起到较好的促凝止血效果。
各组的止血效果用出血量来量化，量化结果显示在图6中。如图6所示，与 市售止血海绵(快康牌A型医用明胶海绵)相比(未能成功完成对动脉断裂的止 血)，止血凝胶对出血量的控制良好。其中，实施例1组平均出血16.6mg，1min 内完成止血，实施例2和实施例3组的出血量都控制在10mg以内，且在1min内即 可完成对创口本身的止血，实施例4组的出血量约为100mg，且1min内无法完成 止血任务。
实施例8：小鼠股动脉出血模型止血后的存活情况
方法：
在实施例5的止血实验完成后，使用4-0的缝合线缝合创口，并使用碘酒进行 创口的消毒，之后检测小鼠的生存情况。
结果：
在实施例5的止血完成后，实施例1-3组的9只小鼠都达到100％的存活率，且 状态良好，3天后观察伤口并解剖观察股动脉的恢复，均愈合良好，并观察到股 动脉的愈合及其运动功能的恢复(如图7所示)。其中实施例4组的3只小鼠，1 只完成止血，2只无法止血，存活率为33％。空白组未能完成止血，小鼠存活率 为0％。
实施例9：小鼠股肝脏出血模型上的止血实验
方法：
9只雌性Balb/c小鼠，随机分为3组，每组3只，实验组中分别给予实施例3组 的止血凝胶、市售海绵(快康牌A型医用明胶海绵)，空白组不给予止血条件。
实验步骤：
1.动物麻醉
小鼠采用异氟烷呼吸麻醉，实验过程中根据动物的心率、摆尾反应等调整 麻醉吸入量。
2.制造创伤并止血
小鼠腹部进行脱毛，在腹腔上方剪开8mm的切口并使用镊子取出肝脏，使 用手术刀在肝脏上施加长度为5mm、深度为2mm的十字刀口，之后涂覆止血凝 胶(涂覆量为小鼠体重的4％-8％)至完全密闭创口，并使用市售海绵组(海绵 规格：1cm×0.8cm)和不给予止血条件的空白组作为对比。止血过程保持止血 材料覆盖创口1min，1min后去除止血材料，观察创口形态和出血情况，并记录 过程中的出血量。
结果：
如图8和图9所示，不经止血处理的空白组出血较多，不能完成止血任务， 出血量在100mg左右。使用市售海绵进行止血后，1min内可以完成止血，出血 量为80mg。使用实施例3组的凝胶，出血较少，可以在1min内快速止血，过程 中出血量为20mg，止血效果良好，优于市售海绵。
实施例10：兔子肝脏出血模型上的止血实验
方法：
12只雌性新西兰大白兔(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，随机 分为4组，每组3只。实验组中，分别给予实施例3组的凝胶、市售纤维蛋白胶(外 用冻干人纤维蛋白粘合剂，上海莱士血液制品股份有限公司)、HaemoCerTM止 血粉三组止血条件，空白组为不给予止血条件。
实验步骤：
1.动物麻醉
兔子采用10％的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，用量为5ml/kg。
2.制造创伤并止血
兔子腹部进行脱毛，在腹腔上方剪开40mm的切口并使用镊子取出肝脏，使 用手术刀在肝脏上施加长度为10mm、深度为5mm的正方形刀口，之后涂覆止血 凝胶(涂覆量为兔子体重的0.5％-1％)，并使用市售纤维蛋白胶组(施用量为 4mL)、HaemoCerTM止血粉(施用量为2g)组和不给与止血条件的空白组作为 对比，记录出血量和止血时间。
结果：
止血过程如图10所示。其中(a)是空白组的出血情况，在无止血条件的情 况下，肝脏出血较多。(b)为实施例3凝胶样品组的止血情况，可以观察到， 凝胶涂覆创口表面时，能够迅速密闭创口，阻止血液渗出，起到较好的止血作 用。(c)为纤维蛋白胶的止血情况，纤维蛋白胶有较好的促凝血作用，但是使 用条件较为苛刻，需要较平整的表面，且对于有血压的出血，纤维蛋白胶不能 较好地压迫住伤口处的出血。(d)是HaemoCerTM止血粉的止血情况，止血粉能 够较快的促进凝血，但缺点是，不能完整的、无缝隙的对创口进行紧密封闭，以至于在边缘有渗血的情况发生。
图11显示了各样品组对肝脏止血模型止血情况的量化结果。可以分析得到， 实施例3的凝胶在肝脏止血模型中获得了最好的止血效果。
图12显示了实施例3的凝胶止血后的肝脏表面情况，可以看到肝脏表面有了 较好的凝血，并再无出血发生，有较好的止血作用。
另外，实施例3凝胶的止血时间是120s，HaemoCerTM止血粉止血时间是140s， 纤维蛋白胶止血时间为70s。综合来看，实施例3凝胶与市售止血产品相比，拥有 类似的止血时间，但是其更好的密闭性能和力学性能，更好的适应性，使其对 大出血有更好的止血能力。
实施例11：兔子股动脉出血模型上的止血实验
方法：
12只雌性新西兰大白兔，随机分为4组，每组3只。实验组中分别给予实施 例3组的凝胶(涂覆量为兔子体重的0.5％-1％)、市售纤维蛋白胶(外用冻干人 纤维蛋白粘合剂，上海莱士血液制品股份有限公司。施用量为4mL)、HaemoCer TM止血粉(施用量为2g)组止血条件，空白组不给与止血条件。
实验步骤：
1.动物麻醉
兔子采用10％的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，用量为5ml/kg。
2.制造创伤并止血
兔子腹股沟部及腿部进行脱毛，剖开腹股沟处皮肤，使用手术刀进行股动 脉血管的剥离，之后使用止血钳夹住血管两端，在两止血钳的中间，使用剪刀 造成血管一半的切口，(如图13所示)之后打开止血钳给与出血条件，进行样 品组的止血，使用市售纤维蛋白胶组、HaemoCerTM止血粉组和不给与止血条件 的空白组作为对比，记录出血量。
结果：
止血结果如图14所示。其中(a)为样品组的止血情况，可以观察到，实施 例3的凝胶涂覆创口表面时，能够迅速密闭创口，阻止血液渗出，可以应对股动 脉的出血的大血压冲击，起到较好的止血作用。(b)为纤维蛋白胶的止血情况， 纤维蛋白胶有较好的促凝血作用，但是使用条件较为苛刻，需要较平整的表面， 对于股动脉的大血压出血，纤维蛋白胶没有较好的力学性能密闭创口，导致局 部凝血，凝血的血块又被高血压冲破，在边缘继续渗血的情况出现，纤维蛋白 胶不能较好地封闭大压力的出血。(c)是HaemoCerTM止血粉的止血情况，止血 粉能够较快的促进凝血，形成局部膜状物质封闭创口，但对于股动脉出血的大血压冲击力，不能全方位的密闭，且没有足够的力学性能应对冲击，易被冲散， 边缘渗血。
另一方面，实施例3的凝胶的止血时间为120s，市售纤维蛋白胶的止血时间 约为270s，HaemoCerTM止血粉的止血时间约80s。实施例3的凝胶与市售产品相 比，止血时间上并不逊色，且有更好的适应性，更好的密闭性，更能应对大压 力出血，优势明显。
图15显示了各样品组对兔子股动脉止血模型止血情况的量化结果。可以分 析得到，实施例3的凝胶在兔子股动脉止血模型中获得了最好的止血效果。图16 显示了壳聚糖/褐藻多糖硫酸酯凝胶止血后的股动脉创口表面情况，可以看到血 管切口处止血成功，并再无出血发生，表明样品有较好的止血作用。综上所述： 实施例3的凝胶与市售产品相比优势显著，有较好的止血能力。
实施例12：止血凝胶的生物相容性
为了验证止血凝胶的生物相容性，进行了止血凝胶材料的细胞层面的生物 学评价，通过细胞毒性进行验证。
方法：
使用人乳腺癌MCF-7细胞和正常3T3细胞(均购自北京丰晖生物有限公司) 进行模拟。首先进行细胞培养，传代两代之后的细胞转移到96孔板中培养，使 用不同梯度的实施例3止血凝胶浸出液(10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25 mg/ml、0.625mg/ml)培养上述两种细胞，并设置空白对照组。
浸出液的制备方法：使用相同条件的培养液，在6组同体积的DMEM培养液 中，分别加入不同量的实施例3的止血凝胶，配制浓度为10mg/ml、5mg/ml、2.5 mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml的溶液，静止过夜，获得浸出液。
其中，细胞培养的条件是，每孔200μL培养液。细胞在各组浸出液及对照组 中培养12h后，每孔加入10μL的cck8检测剂，4小时后使用酶标仪在450nm处检测 各组吸光度，以表征材料对细胞活性的影响。
结果：
MCF-7细胞的毒性实验结果如图17所示。与不加止血凝胶的纯培养液 (0mg/ml)组的细胞活力相比，有止血凝胶浸泡的各组培养液都促进了细胞的 增殖，不同浓度的止血凝胶浸出液对细胞活力的影响无显著差异，表明止血凝 胶对癌细胞无毒性，有较好的生物相容性。
3T3细胞的毒性实验结果如图18所示。与上述结果类似，不同浓度的止血凝 胶浸出液对细胞活力的影响无显著差异，表示止血凝胶对正常细胞无毒性，有 较好的生物相容性。
实施例13：负载药物的止血凝胶
在实施例3凝胶制备过程中，负载3-5％重量(基于实施例3的凝胶重量计) 的凝血酶，制备得到负载凝血酶的止血凝胶。
对负载凝血酶的止血凝胶进行小鼠股动脉止血模型的评价，其步骤同实施 例5。
结果：
如图19所示，其中(a)为负载凝血酶的止血凝胶在小鼠股动脉模型中的止 血情况，可以看到，凝胶可以较好密闭创口，且凝血酶在其间发挥作用，促进 创口凝血；如图(b)所示，1min后破坏表面涂覆的凝胶，创口再无出血发生， 表示止血完成。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施 方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。
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