基因在提高植物耐盐中的应用

文档序号：1053027 发布日期：2020-10-13 浏览：10次 >En<

阅读说明：本技术 基因在提高植物耐盐中的应用 (Application of gene in improving salt tolerance of plant ) 是由宝力格刘敏轩陆平于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基因在提高植物耐盐中的应用,具体的公开了LOC110433180和LOC8070651在耐盐高粱中高表达,且在盐胁迫试验中,LOC110433180和LOC8070651对盐胁迫产生响应,呈现与耐盐株相同的表达趋势。可以将LOC110433180和LOC8070651应用于植物耐盐的改良。(The invention discloses application of genes in improving salt tolerance of plants, and particularly discloses high expression of LOC110433180 and LOC8070651 in salt tolerant sorghum, wherein in a salt stress test, LOC110433180 and LOC8070651 respond to salt stress and show the same expression trend as salt tolerant plants. LOC110433180 and LOC8070651 can be applied to the improvement of salt tolerance of plants.)

基因在提高植物耐盐中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因在提高植物耐盐中的应用。

背景技术

盐害是当前农业生产上重要的逆境危害之一，严重制约了粮食生产和农业持续发展。目前全球范围内约有10亿hm²的土地存在不同程度的盐渍化(Zhu J K.Plant salttolerance.2001.Trends in Plant Science,6(2):66-71.)，主要分布于土壤蒸发量大，降水量少的干旱、半干旱地区和滨海地区。中国的盐渍土面积大，类型多样，分布广泛。据最新研究报道，现在盐渍化土壤面积约为3693.3万hm²，残余盐渍化土壤面积约为4486.7万hm²，潜在盐渍化土壤面积为1733.3万hm²，各类盐碱地面积总计达到9913.3万hm²(李彬，王志春，孙志高，陈渊，杨福.2005.中国盐碱地资源与可持续利用研究.干旱地区农业研究，23(2):154-158.)。由于灌溉扩展、不合理的开发利用与管理以及气候变化等原因，还在以每年上百万公顷的速度增加。世界上大约有半数的灌溉土地受盐渍化的影响(Rhoades J D,Loveday J.1990.Salinity in irrigated agriculture.In Ameerican society ofcivil engineers,irrigation of agricultural crops,1089-1142.)。土壤盐渍化已成为一个世界性问题，与人类面临的人口、资源、环境、粮食等问题都密切相关。

植物与土壤盐渍化问题关系极为密切。植物参与了特定类型的盐渍化发生与演变过程，同时，盐渍化造成了植物生境条件的变化，严重影响了植物的生长过程和干物质积累。另一方面，世界面临的人口、资源和粮食问题压力，要求人们充分挖掘盐渍化耕地的生产潜力和开发利用不同类型的盐渍土资源，以增加有效耕地面积，提高盐渍土资源利用效率和土地生产力。在盐渍土的开发利用与管理过程中，植物的作用受到人们的高度重视。由于盐渍化是世界范围内植物的主要非生物胁迫形式，这使得人们致力于研究植物耐盐性以改进作物品性。植物的耐盐特性与耐盐和盐生植物的开发利用、耐盐作物品种的培育和提高作物抗盐能力等已成为在盐渍土资源的开发利用和改良中迫切需要加以解决的重大问题。

发明内容

本发明的目的在于提供增强植物耐盐胁迫能力的基因及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

在本发明的第一方面，提供一种高粱耐盐相关基因及其编码的蛋白，所述基因选自：LOC110433180和/或LOC8070651。

在本发明的第二方面，提供LOC110433180和/或LOC8070651在筛选耐盐高粱中的应用。

在本发明的第三方面，提供LOC110433180和/或LOC8070651在高粱育种中的应用。

在本发明的第四方面，提供一种鉴定高粱耐盐性的方法，通过检测样品中LOC110433180和/或LOC8070651的表达水平来预测高粱的耐盐性。

在一个优选例中，通过核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测样品中LOC110433180和/或LOC8070651的表达水平。

更为优选的，通过核酸扩增技术检测样品中LOC110433180和/或LOC8070651的表达水平。

更为优选的，LOC110433180和LOC8070651在耐盐高粱中表达上调。

在本发明的第五方面，提供了一种预测高粱耐盐性的产品，所述产品包括检测LOC110433180和/或LOC8070651表达水平的试剂。

在本发明的第六方面，提供一种改善高粱耐盐性的方法，所述方法包括提高LOC110433180和/或LOC8070651的表达水平。

在一个优选例中，将LOC110433180和/或LOC8070651核酸转入高粱中。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LOC110433180或LOC8070651与植物耐盐相关，在耐盐植株的鉴定筛选以及在农作物的抗盐遗传改良领域具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1是分子标志物LOC110433180和LOC8070651在敏盐株和耐盐株中的表达情况图；其中，A是LOC110433180；图B是LOC8070651；

图2是LOC110433180和LOC8070651在盐胁迫中的表达情况图；其中，图A是LOC110433180，图B是LOC8070651。

具体实施方式

本发明通过对敏盐高粱和耐盐高粱进行转录组测序，利用遗传学手段来寻找耐盐和敏盐基因表达谱的差异，并同时通过盐胁迫试验检测盐响应的基因，挖掘耐盐的功能基因，解析其复杂的分子机理奠定理论基础，同时为耐盐高粱的鉴定以及育种提供重要的手段。

如本文所用，本发明中划分某一环境术语盐胁迫环境还是正常环境的准则与现有公知技术相符。例如，对于大多数植物，通常“耐盐胁迫能力”是指耐受盐浓度0.1％-0.2％或者更高浓度的能力。

如本文所用，LOC110433180和LOC8070651在耐盐高粱中表达上调，是指与敏盐高粱中的LOC110433180和LOC8070651表达的常规值相比，LOC110433180和LOC8070651表达上调，LOC110433180和LOC8070651作为一种已知基因，本领域技术人员可以方便的了解这种常规值，比较基因及其编码的蛋白的表达的方法也是人们熟知的，如核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，mRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，mRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

本发明涉及LOC110433180和/或LOC8070651核酸，所述核酸可以是编码蛋白的多核苷酸，也可以是包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明中，LOC110433180和/或LOC8070651多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1耐盐基因的筛选

1、实验材料

苗期极耐盐品种圪红(GH，00000601，河北)和极敏盐品种褐高粱(HGL，00013200，贵州)。

2、实验方法

2.1材料的处理

选用苗期耐盐品种(00000601)及盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m^-2·s^-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用，每组设三个重复。

2.2转录组测序

叶片总RNA的提取纯化与质量评估、cDNA文库的构建、转录组测序工作交由北京百迈客生物科技有限公司完成。转录组测序平台使用Oxford Nanopore Technologies的PromethION测序平台。

2.2.1RNA的提取与质量评估

液氮研磨幼苗叶片，使用天根生化的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒按说明书提取总RNA，用Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对样品纯度、浓度、RNA完整性等指标进行检测。

2.2.2文库的构建与转录组测序

整个文库构建与测序工作根据牛津纳米孔技术公司(ONT)提供的方案，用1ug的总RNA经过SQK-PCS109系统进行cDNA文库制备。简而言之，使用SuperScript IV第一链合成系统(Invitrogen)进行全长mRNA逆转录，然后对cDNA进行PCR扩增反应14个循环，DNA聚合酶使用LongAmp热启动Taq DNA聚合酶(NEB)。对PCR产物进行FFPE DNA损伤修复和末端修复(NEB)，使用T4 DNA连接酶(NEB)进行测序接头连接。随即用Agencourt XP对DNA进行磁珠纯化。将最终的cDNA文库添加到FLO-MIN109流通池中，在百迈客生物科技有限公司(北京)的PromethION平台上测序。

2.2.3测序数据与质量控制

从原始下机序列中过滤序列中的低质量(长度小于500bp，Qscore小于7)序列和核糖体RNA序列，并根据识别序列两端是否存在引物得到全长序列。

全长序列用minimap2软件与参考基因组进行比对，通过比对信息进行聚类后，得到一致性序列。

合并每个样品的一致性序列，通过minimap2与参考基因组(Sorghum_bicolor_NCBIv3，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝sorghum)进行比对，对比对到参考基因组的读长序列进一步使用cDNA_Cupcake程序包(https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake)进一步去冗余，过滤identity小于0.9，coverage小于0.85的序列，合并仅5’端外显子有差异的比对。

2.2.4数据分析

1)新基因、SSR及转录因子的预测

使用TransDecoder软件(http://transdecoder.github.io/)预测转录本中编码区序列(Coding Sequence，CDS)，使用MISA软件鉴定转录组的简单重复序列(SimpleSequence Repeats，SSR)，用iTAK软件预测转录因子。

2)LncRNA预测

因长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)不编码蛋白，因此，通过对转录本进行编码潜能筛选，判断其是否具有编码潜能，从而可以判定该转录本是否为lncRNA。分别应用CPC分析、CNCI分析、CPAT、pfam蛋白结构域分析四种方法对新发现的转录本进行lncRNA的预测。CPC(Coding Potential Calculator)是基于序列比对的蛋白质编码潜能计算工具。CNCI(Coding-Non-Coding Index)分析是一种通过相邻核苷酸三联体特征区分编码-非编码转录本的方法。CPAT(Coding Potential Assessment Tool)分析是一种通过构建逻辑回归模型，基于ORF长度、ORF覆盖度，计算Fickett得分和Hexamer得分来判断转录本编码和非编码能力的分析方法。Pfam数据库是最全面的蛋白结域注释的分类系统构。

3)基因功能的注释分类

主要利用NR(NCBI non-redundant protein sequences)数据库，该数据库是NCBI中的非冗余蛋白质数据库；Pfam(Protein family)数据库是最全面的蛋白结构域注释的分类系统；COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)数据库是对基因产物进行同源分类的数据库；KOG(euKaryotic Ortholog Groups)数据库是针对真核生物，基于基因直系同源关系，结合进化关系将来自不同物种的同源基因分为不同的Ortholog簇；Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)数据库是由EBI(欧洲生物信息学研究所)负责维护的数据库，包含了有相关参考文献且经过校对的蛋白质注释信息数据库，可信度很高；KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库；GO(GeneOntology)数据库是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表来全面描述生物体中基因和基因产物的功能属性。

4)转录表达水平的定量与差异表达分析

转录组测序可以模拟成一个随机抽样的过程，为了让片段数目能真实地反映转录本表达水平，需要对样品中的Mapped Reads的数目进行归一化。采用CPM(counts permillion)作为衡量转录本或基因表达水平的指标，CPM计算公式如下(“reads mapped totranscript”表示比对到某一转录本上的reads数目；“total reads aligned in sample”表示比对到参考转录组的片段总数)：

使用DESeq R软件包(1.18.0)和EBSeq软件对盐胁迫下不同处理时间、不同品种幼苗叶片进行差异表达分析。在此过程中，Fold Change≥2且FDR<0.01作为筛选标准。符合筛选条件的基因为差异表达基因。差异倍数(Fold Change)表示两样品(组)间表达量的比值。FDR(False Discovery Rate)是通过对差异显著性p值(p-value)进行校正得到的。由于转录组测序的差异表达分析是对大量的转录本表达值进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在进行差异表达分析过程中，采用了公认的Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值(p-value)进行校正，并最终采用FDR作为差异表达转录本筛选的关键指标。

5)差异表达基因的功能富集分析

差异表达基因的功能富集分析主要包括GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析是通过GOseq R程序包完成，KEGG通路富集分析由KOBAS软件进行分析。

6)数据的统计与图形绘制

差异表达基因的韦恩图统计、GO注释分类、KEGG富集分析图形绘制使用百迈客云分析平台完成，GO富集分析图使用ggplot2 R程序包完成，样本表达量相关性分析聚类热图、盐胁迫响应基因差异表达热图绘制使用pheatmap R程序包完成，差异表达基因统计、转录因子统计柱形图使用origin 8.5完成，使用EXCEL 2016进行数据统计，其他图形绘制由百迈客生物科技公司提供完成。

2.3qRT-PCR验证

使用金百特生物的RT Kit With gDNA Eraser试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA,反转录体系以及步骤如下：

依次加入，在加入5×RT MasterMix之前，轻轻混匀，42℃孵育2min，全部加入后，轻轻混匀，42℃孵育20min,85℃加热5s。置冰上，合成的cDNA用于qRT-PCR，使用前加180μLddH₂O稀释至终浓度约为5ng/μL。

随机选取6个差异表达基因，使用ABI 7300Real-Time PCR System(USA)进行qRT-PCR，验证转录组测序数据的准确性，使用金百特生物2×Sybr Green qPCR Mix(High ROX)试剂，反应液配制在冰上进行，PCR反应液体系如下：

qRT-PCR反应程序设置如下：

反应条件循环数

94℃ 3min 1

94℃ 10s，60℃ 34s 40

Dissociation Stage

qRT-PCR引物设计使用NCBI Primer Blast工具完成，具体引物信息见表1，引物序列由北京擎科生物公司合成。使用Sorbi.3007G140700(GAPDH)基因作为内参基因，使用2^-ΔΔCt相对定量方法以耐盐品种和敏盐品种非处理样本为对照进行表达定量，每个样本三个重复。

表1 qRT-PCR选用基因及引物序列

2.4结果与分析

2.4.1RNA质量检测

转录组测序对于RNA的质量要求很高，良好的RNA质量是获得可靠测序数据的前提，经Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对总样品进行检测，结果显示8.2<RIN<8.6，2.11<OD260/OD280<2.16，28S/18S在1.3到1.6之间，说明总RNA质量较高，完整性较好，能够满足构建cDNA文库需求。

2.4.2测序数据质量

对总样品进行全长转录组测序，每个样品测序产出clean data均达到6.38GB,过滤短片度和低质量的reads后的信息见表2得到的clean read数从6319936到10297642不等，N50在1134-1282之间，平均质量值在Q9以上，总的clean data去除核糖体RNA(ribosomeRNA，rRNA)并通过reads两端的引物序列鉴定全长(full length)序列详见表3，每个样品得到的全长,率均在80％以上。将clean reads与参考基因组进行比对，比对统计结果见表3，比对上的序列为99.47％以上。

表2总样品的clean data数据统计

表3总样品全长序列数据统计表

2.4.3两个品种的基因表达情况分析

对耐盐品种圪红(GH)和敏盐品种(HGL)全部样本进行全长转录组测序分析，与敏盐品种相比，呈现显著性差异的有604个基因，其中，显著上调的有212个，显著下调的有392个。

LOC110433180和LOC8070651在耐盐品种中显著上调(图1，表4)，说明LOC110433180和LOC8070651作为可能的耐盐基因在植物的耐盐中起着重要的作用。

表4分子标志物的表达水平

2.4.5qRT-PCR验证分析

随机挑选6个差异表达基因进行定时荧光定量PCR以验证转录组数据的准确性，结果显示，6个差异表达基因与转录组测序结果中的表达量变化倍数趋势基本一致，说明转录组测序数据准确可靠。

实施例2耐盐基因对盐胁迫的响应

1、材料处理

选用盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m^-2·s^-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，开始用含有150mmol·L^-1NaCl溶液胁迫处理幼苗，分别设胁迫处理时间梯度为0h(CK)、6h、24h、48h，每个处理三个重复。为保持盐胁迫浓度，处理NaCl溶液每24h更新一次。胁迫处理结束，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用。

2、转录组测序及数据分析方法同实施例1。

3、结果

结果显示，敏盐株在适应盐胁迫的过程中，LOC110433180和LOC8070651基因显著上调(图2，表5)，同耐盐株与敏盐株的基因表达趋势一致，说明LOC110433180和LOC8070651是耐盐基因。

表5盐胁迫试验中分子标志物的表达水平

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 基因在提高植物耐盐中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA