烟粉虱MED隐种染色质重塑因子Btbrm2及其编码基因和应用
阅读说明：本技术 烟粉虱MED隐种染色质重塑因子Btbrm2及其编码基因和应用 (Bemisia tabaci MED cryptomorphic chromatin remodeling factor Btbrm2 and coding gene and application thereof ) 是由 吕志创 冀顺霞 王晓迪 申晓娜 刘万学 万方浩 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业生物技术领域,具体地涉及烟粉虱MED隐种染色质重塑因子Btbrm2及其编码基因和应用。所述重塑因子的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明明确了不同温度下Btbrm2基因在烟粉虱入侵种MED隐种与本地种Asia II 1隐种中表达模式的差异。降低该基因的表达直接降低了MED隐种对逆境温度的耐受能力。所获得的结果为进一步研究烟粉虱MED隐种的温度耐受性机理与表观遗传之染色质重塑的关系奠定基础,可用于破坏烟粉虱温度耐受性,进而用于防治烟粉虱的危害及扩散。(The invention relates to the technical field of agricultural biology, in particular to a bemisia tabaci MED cryptic chromatin remodeling factor Btbrm2, and a coding gene and application thereof. The amino acid sequence of the remodeling factor is shown in SEQ ID No:2, respectively. The invention defines the difference of the expression modes of the Btbrm2 gene in the tobacco whitefly invasive species MED hidden species and the local species Asia II 1 hidden species at different temperatures. The reduction of the expression of the gene directly reduces the tolerance of the MED cryptic species to the adversity temperature. The obtained result lays a foundation for further researching the relationship between the temperature tolerance mechanism of the hidden species of the bemisia tabaci MED and the epigenetic chromatin remodeling, and can be used for destroying the temperature tolerance of the bemisia tabaci and further preventing and controlling the harm and the diffusion of the bemisia tabaci.)
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地涉及烟粉虱MED隐种染色质重塑因子Btbrm2及其编码基因和应用。
背景技术
烟粉虱(Bemisia tabaci(Gennadius))属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，粉虱科，小粉虱属，是一种世界范围内重要的农业害虫。该虫寄主范围极广，可以通过取食植物汁液、分泌蜜露诱发煤污病、传播植物病毒等方式危害豆科、茄科、菊科、葫芦科、锦葵科以及十字花科等600余种经济作物，是我国作物生产必须应对的重大有害生物。烟粉虱是一个包含36个以上隐种的物种复合体。目前我国已有的烟粉虱隐种有15种，包括2个入侵种和13个本地种。入侵种MED隐种在我国全国范围内广泛分布。而本地种仅分布在我国局部地区，如AsiaII 1隐种主要分布在中南部局部地区如海南、广东、广西、台湾、贵州、浙江等地，并且没有向其他地区扩散的趋势。
随着全球温度的变化，烟粉虱MED隐种在不同地理环境下的成功适应，已经广泛引起了人们对其入侵机制的理论探讨，对于其温度适应性的分子机制更是近几年来的研究热点之一。对烟粉虱进行热激选择的实验中发现，入侵种烟粉虱2代内存活率显著提高，表明存活能力的快速提高是其在恶劣环境生存的重要策略。这种短期内生物体对环境变异产生的响应机制与表观遗传有关。表观遗传过程会增加有机体对非温度胁迫和其它环境挑战的进化潜能的响应，这与全球环境变暖的背景是高度相关的。
染色质重塑(chromatin remodeling)是目前表观遗传领域的研究热点之一，它能驱动核小体的置换或重新排列，改变染色质的空间构象。ATP依赖的染色质重塑是染色质重塑复合体利用ATP水解释放的能量来改变染色质结构,从而调控真核生物基因表达的一种重要的表观遗传调控机制。染色质重塑在生物防御相关基因的表达调控中发挥着关键作用，而染色质重塑因子BRM能参与环境胁迫对生物逆境的调控，在调节非生物胁迫相关基因的表达中起重要作用。但其在烟粉虱温度胁迫中的作用仍未知。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrand RNA,dsRNA)导入细胞后能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。RNAi广泛存在于生物界，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基
因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，进而达到利用或防治其危害的目的。由于烟粉虱个体体积小，注射dsRNA不易操作、费时等限制，而饲喂dsRNA具有简便、易于操作等特点而在烟粉虱研究中得以应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种烟粉虱MED隐种染色质重塑因子。
本发明的再一目的是提供上述烟粉虱MED隐种染色质重塑因子的编码基因。
本发明的再一目的在于提供含有上述烟粉虱MED隐种染色质重塑因子的编码基因的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供含有上述烟粉虱MED隐种染色质重塑因子的编码基因的重组菌株。
本发明的再一目的在于提供上述烟粉虱MED隐种染色质重塑因子的编码基因的应用。
根据本发明的
具体实施方式
，首次克隆出烟粉虱MED隐种染色质重塑基因Btbrm2，其cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID No:1所示：
ATGGCAGCTCCCACTCAAGACAATCTGAATGCTTTGCAGCACGCTATAGATTCAATGGAAGAGAAAGGTATGCAAGAGGATCCTAGATATTCTCAGCTCCTCGCTATCAGAGCTCGTCAAAATAACATGGAGCCCCCTCGACTTCCTGGATCGCAAGGATTTTGCGTATCCTCTGATAGCCCATCGAATTCCAAGCAAGTTTTGAGTCCCATCCAGTTGCAACAGTTACGAGTCCAAATCATGGCATATCGAGTTCTCGCTCGGAATCAGCCGTTGCCTCATCAACTTGCAGTAGCGGTTCAAGGGAAACGAATGGACTCGTCTCTCATTCAACCGGGTCTGGGACCTCCACCTCTCATGCCTCCAACCTCCGGTGGAAACACTCCAAGCCCACAAGCACGACCCACTGATTCAAGCAATGAAAACTCATCTGGAATGAGTGCAGCTCCTGTGTACCCTGTCGCACCCCCAACTTCACCCAACGTACCCCAAGGACCTCCGCCATCTCAGTTGCCCCCAGTAACCCCACCTCCCCCACAGTCATCCTCAACGATGGCTCCACCTCCTGCTGTTCCAGCACCACCTGCTCCATCTGTTCCTGCCCCTCTCCCACCCCCTGCTCTCAATTCAACACCCCCTGCGCCCCTCATGCCTCCCATTTCAGCACCGACACCACCTGTACCCTTGCAGCCACCAGTGACGTCACACGTCCATATCGCCCCACCCATGCCTCGGCTCCCCATCACGAGTCATCCCGTCATGGTTGTCCCTCCTCCTCCTAACTCAATGCTGAAACCGATGCCCAGTCCAGTTGTTCTGCCTCCTCCGCCACCACCACCCCCCAATCCGCAGCAACTTACGCAGCAACTTCAGTTACAAAAACAGAACAGAGTTACGACTATTCCTCGTCCAACTGGGATCGACCCTATACTAATTTTACAAGAAAGAGAAAATAGAGTCGCAGCTCGCATTGCCCATCATATGGAGAAGCTCTCCAATCTTCCGTCAACAGTGTCGGATGAAATTCGCCTCAAAGCTCAGATCGAACTTCGTGCTTTGAGAATCTTGAATTTTCAACGTCAGCTCCGAAGCGAGATCATATCTTGTGCTCGCAGAGATTCAACCCTGGAAACAGCCGTCAATATGAAAGCCTACAAGCGAGTCAAAACCCAAGGATTAAAAGAATCTCGCGCGACAGAAAAGTTGGAAAAGCAGCAGAAACTGGAAGCAGAGAGGAAACGGAGACAAAAACATCAAGAATATTTGGCAGCCATCATTCAGCACGGTAAAGACTTTAAAGAATACCATCGGAATAATCAAGCGAGGATCGTCCGGTTGAATAAAGCCATGCTTAGTTACCATGTGAATGCGGAGCGGGAGCAGAAGAAAGAACAGGAGAGGATCGAAAAGGAACGAATGAGACGCCTAATGGCAGAAGATGAAGAGGGTTACAGGAAACTCATCGATCAAAAGAAAGACAAGAGACTGGCATTCTTACTGTCTCAAACTGACGAATACATCACAAACTTGACAGAAATGGTCAAACAACACAAAGTTGAACAAAAACGTAAACTTGCAGAGAAAGCGAAAGAAGACAAGAGGAAAAAGAAAGAAACTGAGGATGCGGAGCGGAGAGCTTGCGTAATGGAAATGGAAAGTGGGAAAAAATTGAAGGGAGAAGAAGCTCCCTTGATGGTGGACCTAGGCACTTGGCTGGAAGCTCATCCTGGTTGGGAAGCATGTGAGGACTCAGAGGCAGAGACTGAAGAAGAGTCTGATTCTGATTCCGATCAAAATATCGAAGAAAAAATTGAAGAAGTCAAAGAAGAGAAGAAACCAAAAGAAGAACTTGATCCGAAAGAAGTTGTTGAAAAAGCGAAAAGTGAAGACGATGAATACAAAAATACCTCCGAAGAACTTACCTACTACAGTATTGCTCACACAATCAATGAAATTGTGACAGAACAAGCCTCTATCATGGTTAATGGTAAATTAAAAGAATATCAAATCAAGGGACTTGAGTGGCTAGTCTCTCTGTACAATAATAATCTCAATGGCATCCTGGCCGATGAAATGGGTCTTGGAAAAACCATCCAAACAATCGCATTGATCACATACTTGATGGAGATGAAAAAAGTAAACGGTCCATATTTAATCATCGTACCTCTTTCCACCCTTTCAAATTGGGTGTTGGAGTTTGAAAAATGGGCCCCATCTGTAAATGTTGTTGCGTACAAAGGCTCACCAGCTGTCAGACGTGCACTTCAAGCACAAATGAGATCATCTAAATTCAATGTGCTACTCACAACGTATGAATACGTTATCAAGGATAAAGCTGTTCTAGCCAAGTTGCACTGGAAGTACATGATCATCGATGAAGGGCATCGAATGAAGAATCACCATTGCAAATTGACACAAGTGCTAAATTCACATTATGTTGTTCCGCAAAGGCTCCTTTTGACTGGAACTCCGTTGCAAAATAAGTTGCCCGAACTGTGGGCTCTCCTCAATTTTCTTCTTCCGTCTATTTTCAAATCCTGCTCAACATTTGAACAGTGGTTCAATGCTCCTTTTGCCACAACTGGTGAAAAAGTGGAATTAAATGAGGAAGAAACTATTTTGATCATTCGCCGTCTACATAAAGTTTTACGTCCATTTTTGCTGCGACGTTTGAAGAAAGAAGTCGAGTCTCAACTTCCAGACAAAATCGAATATATCGTAAAATGTGATATGTCAGGGCTCCAGAGAGTCTTGTATAGGCACATGCAAAGTAAAGGGGTCCTTCTAACTGATGGCTCTGAAAAAGGTAACAAGGGCAAAGGTGGAGCCAAAGCACTGATGAATACAATTGTCCAACTTCGCAAGTTGTGCAATCATCCATTCCTGTTTCAACATATCGAAGAGAAGTTCTGCGATCATATCGGCTGTTCGTCAAATGGTGTTGTAAGTGGACCTGACCTTTATCGAGTCTCTGGTAAGTTTGAACTATTGGATCGAATTTTGCCAAAGTTGAAGGCCACCAATCACCGAGTACTTCTATTTTGTCAAATGACCCAGCTCATGAGCATAATGGAGGATTATTTCAACTGGCGAGGATTCTCGTACCTTCGTCTTGATGGAACAACCAAAGCGGAAGATCGAGGGGATTTATTGAAAAAATTTAACAGCGCCACCAGTGAATATTTCATATTCTTACTGAGCACACGAGCTGGTGGACTTGGCTTAAATCTTCAAGCTGCAGACACTGTAGTTATTTTCGACTCTGATTGGAATCCCCATCAGGATTTACAAGCGCAAGATCGAGCACATCGAATTGGTCAAAAGAACGAGGTACGAGTATTGAGGTTAATGACGGTCAATTCCGTTGAAGAACGAATCTTAGCAGCAGCTCGATACAAATTGAACATGGATGAAAAAGTCATCCAGGCAGGCATGTTCGATCAGAAGTCTACTGGAACTGAGAGGCAGCAGTTTTTGCATAGTATTTTGCATCAAGATGATGCAGAAGATGAGGAAGAGAATGAGGTTCCGGATGATGAAACTGTAAATCAGATGATTGCTCGCAGTGAAGCTGAATTTGACACTTTTCAAAAAATGGATGCTGAAAGACGCAAAGAAGAGTCTAAGGGCAAAAAATCCCGGCTTATTGAGGAGAGTGAACTACCAGACTGGTTGGTTAAAGATGACGCAGAGGTTGAAGCTTGGACGTACGAACAGGAAGAAGTGCAGATGGGACGAGGCTCAAGGACAAGAAAGGAAATTGACTACTCAGACAGCATGACAGAAAAGGAATGGTTAAAGGCCATTGATGATGGTATTGATGACTTTGATGAGATTGAAGATGAAGTGAAAGTGAAGAAAACTCGCAAACGGCGCAAAAAAGAAGAGGAGGAAGAGGAACCGGCCAAAAAACGAAGAAATGGTACAGAGAAGAATCCGCAAGAGAAAACACCACCTGCTAATTCAGGAGCGGATGCTCGAATGAAGAAGCAAATGCATAAATTGATGACGATTGTTGTAGAGTACACTGAACCTCAAGATTCGCGTGTTCTCAGTGAACCATTCATGAAACTACCATCTCGTCGTGAACTTCCTGATTATTATGAAGTCATCAAGAAACCCCTCGACATCAAGAAAATTCTCACAAAAATTGATGAAGGAAAGTACGAGGAACTGGATGATCTGGAGCGCGATTTCATGCAATTATGCAAGAATGCGCAGTTGTATAATGAAGAAGCATCACTCATCTATGAAGACTCAATTGTACTGCAGTCTGTTTTTACGAACGCTCGTCAGCGTTTGGAAAGTGAAGAGGAAGAAGCTCCGGAGGAAGAAGAAAAAGCGGCACCTGCTGAAGAGGAAGCCTCATCTGGAGCAGAATCGTCCTCTGTGAAAATGAAATTAAAATTGAAGGCATCAACCAAAGCGCCGAAAAATTCCGATGCCAAAACTGATACAAAGTCTACCCCACGATCAAGGAAAAGAACCTCGAAAAAATACATAAGTGACGATGAGAATGAAGATGATGCCGAATCAAGTAATGGCTAA
烟粉虱MED隐种染色质重塑基因Btbrm2编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：
MAAPTQDNLNALQHAIDSMEEKGMQEDPRYSQLLAIRARQNNMEPPRLPGSQGFCVSSDSPSNSKQVLSPIQLQQLRVQIMAYRVLARNQPLPHQLAVAVQGKRMDSSLIQPGLGPPPLMPPTSGGNTPSPQARPTDSSNENSSGMSAAPVYPVAPPTSPNVPQGPPPSQLPPVTPPPPQSSSTMAPPPAVPAPPAPSVPAPLPPPALNSTPPAPLMPPISAPTPPVPLQPPVTSHVHIAPPMPRLPITSHPVMVVPPPPNSMLKPMPSPVVLPPPPPPPPNPQQLTQQLQLQKQNRVTTIPRPTGIDPILILQERENRVAARIAHHMEKLSNLPSTVSDEIRLKAQIELRALRILNFQRQLRSEIISCARRDSTLETAVNMKAYKRVKTQGLKESRATEKLEKQQKLEAERKRRQKHQEYLAAIIQHGKDFKEYHRNNQARIVRLNKAMLSYHVNAEREQKKEQERIEKERMRRLMAEDEEGYRKLIDQKKDKRLAFLLSQTDEYITNLTEMVKQHKVEQKRKLAEKAKEDKRKKKETEDAERRACVMEMESGKKLKGEEAPLMVDLGTWLEAHPGWEACEDSEAETEEESDSDSDQNIEEKIEEVKEEKKPKEELDPKEVVEKAKSEDDEYKNTSEELTYYSIAHTINEIVTEQASIMVNGKLKEYQIKGLEWLVSLYNNNLNGILADEMGLGKTIQTIALITYLMEMKKVNGPYLIIVPLSTLSNWVLEFEKWAPSVNVVAYKGSPAVRRALQAQMRSSKFNVLLTTYEYVIKDKAVLAKLHWKYMIIDEGHRMKNHHCKLTQVLNSHYVVPQRLLLTGTPLQNKLPELWALLNFLLPSIFKSCSTFEQWFNAPFATTGEKVELNEEETILIIRRLHKVLRPFLLRRLKKEVESQLPDKIEYIVKCDMSGLQRVLYRHMQSKGVLLTDGSEKGNKGKGGAKALMNTIVQLRKLCNHPFLFQHIEEKFCDHIGCSSNGVVSGPDLYRVSGKFELLDRILPKLKATNHRVLLFCQMTQLMSIMEDYFNWRGFSYLRLDGTTKAEDRGDLLKKFNSATSEYFIFLLSTRAGGLGLNLQAADTVVIFDSDWNPHQDLQAQDRAHRIGQKNEVRVLRLMTVNSVEERILAAARYKLNMDEKVIQAGMFDQKSTGTERQQFLHSILHQDDAEDEEENEVPDDETVNQMIARSEAEFDTFQKMDAERRKEESKGKKSRLIEESELPDWLVKDDAEVEAWTYEQEEVQMGRGSRTRKEIDYSDSMTEKEWLKAIDDGIDDFDEIEDEVKVKKTRKRRKKEEEEEEPAKKRRNGTEKNPQEKTPPANSGADARMKKQMHKLMTIVVEYTEPQDSRVLSEPFMKLPSRRELPDYYEVIKKPLDIKKILTKIDEGKYEELDDLERDFMQLCKNAQLYNEEASLIYEDSIVLQSVFTNARQRLESEEEEAPEEEEKAAPAEEEASSGAESSSVKMKLKLKASTKAPKNSDAKTDTKSTPRSRKRTSKKYISDDENEDDAESSNG
上述氨基酸序列具有brm蛋白典型的结构特征：HSA结构域(406-478aa)、BRK结构域(541-585aa)、ATP酶域(DEXDc:661-853aa和HELICc:1022-1106aa)、SnAC结构域(1201-1266aa)以及Bromo结构域(1325-1436aa)。
对温度胁迫下Btbrm2基因的表达模式进行分析，实时荧光定量PCR结果表明，烟粉虱MED隐种经过低温胁迫处理5h后，Btbrm2基因的表达量显著升高；高温胁迫处理1h后，Btbrm2基因的表达量即显著升高。而短时高、低温胁迫处理后，烟粉虱本地种Asia II 1隐种该基因的表达量显著降低。比较不同隐种在同一温度胁迫下Btbrm2基因的表达量发现，高、低温胁迫处理后MED隐种Btbrm2基因的表达量显著高于Asia II 1隐种。
本发明提供了上述烟粉虱MED隐种染色质重塑基因Btbrm2的应用。对烟粉MED隐种进行RNAi，结果显示，饲喂dsBtbrm2的MED隐种成虫的高温击倒时间显著降低，低温冷致昏恢复时间显著增加，说明Btbrm2基因在烟粉虱MED隐种的温度耐受性中起关键作用。上述烟粉虱MED隐种染色质重塑基因Btbrm2可用于破坏烟粉虱温度耐受性，进而可以用于烟粉虱的防治。
本发明首次从烟粉虱MED隐种中克隆得到染色质重塑基因Btbrm2，明确了温度胁迫下Btbrm2基因在烟粉虱MED隐种与其他隐种中表达模式的差异。此外，降低该基因的表达直接降低了MED隐种对高、低温的耐受能力。所获得的结果为进一步研究烟粉虱MED隐种的温度耐受性机理与表观遗传之染色质重塑的关系奠定基础，可用于破坏烟粉虱温度耐受性，进而用于防治烟粉虱的危害及扩散。
附图说明
图1烟粉虱MED隐种Btbrm2基因中的保守结构域；
图2显示不同温度处理1h(A)、3h(B)和5h(C)Btbrm2基因在烟粉虱MED隐种与AsiaII 1隐种中表达模式的差异；
图3显示饲喂Btbrm2基因dsRNA、饲喂dsEGFP、饲喂10％蔗糖溶液和CK条件下Btbrm2的表达量变化情况；
图4显示Btbrm2基因的dsRNA处理对烟粉虱MED隐种成虫耐热性(A)和耐寒性(B)的影响：比较饲喂Btbrm2基因dsRNA、饲喂dsEGFP、饲喂10％蔗糖溶液和CK条件下烟粉虱MED隐种成虫高温击倒时间和低温冷致昏恢复时间。
具体实施方式
实施例1：烟粉虱MED隐种Btbrm2基因全长cDNA序列克隆
分别取不同温度胁迫条件下烟粉虱成虫200头放入1.5mL的离心管，液氮冷冻后利用研磨棒将其研成粉末，然后提取RNA，-80℃保存以备用。根据全式金反转录试剂盒(One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix)说明，对提取的RNA进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，设计引物，进行PCR扩增。设计引物如表1、表2所示：
表1
表2
实验发现，利用表1中的引物，PCR扩增获得烟粉虱MED隐种Btbrm2基因的全长cDNA。而利用表2中的引物，无法得到目的基因序列。
利用表1序列，通过PCR扩增，获得Btbrm2基因的cDNA序列全长为4548bp，所得的基因具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，该基因编码1515个如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。克隆获得的基因编码的氨基酸序列的保守结构域分析表明，其具有brm蛋白典型的结构特征：包括406-478位点的HSA结构域、541-585位点的BRK结构域、661-853位点的DEXDc结构域、1022-1106位点的HELICc结构域、1201-1266位点的SnAC结构域以及1325-1436位点的Bromo结构域。该基因的保守结构域如图1所示。
实施例2：分析Btbrm2基因的表达特性
(1)提取不同温度胁迫下烟粉虱成虫的RNA及合成cDNA
选取初羽化的烟粉虱MED隐种和Asia II 1隐种成虫，分别在0、12、26、35、40℃下对烟粉虱成虫进行胁迫处理。各3个生物学重复，共3000头成虫，胁迫结束后立即置于液氮中冷冻3分钟后-80℃保存。按照实例1的方法提取RNA并反转录成cDNA。
(2)荧光定量PCR检测不同温度下Btbrm2表达量：
设计荧光定量PCR的Btbrm2基因和两个内参基因(EF1-α、β-tublin)的引物：
brm2-QF：AAAACCATCCAAACAATCGC
brm2-QR：TTTCAAACTCCAACACCCAA
EF1-α-F：TAGCCTTGTGCCAATTTCCG
EF1-α-R：CCTTCAGCATTACCGTCC
β-tub-F：TGTCAGGAGTAACGACGTGTTTG
β-tub-R：TTCGGGAACGGTAAGTGCTC
反应体系为20μL：2×TransStartTM Green qPCR 10.0μL、ROA 0.4μL、cDNA模板1.0μL、Primer-F 0.4μL、Primer-R 0.4μL、ddH2O 7.8μL。
反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；绘制熔解曲线。
(3)数据分析
通过2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。利用SAS9.4软件对数据进行统计分析，不同温度处理之间的差异使用单因素方差分析(ANOVA)，并进行Duncan检验；同一温度不同隐种间的差异使用独立样本T-test进行分析。数据以均值±标准误差表示，显著性检验水平**代表P<0.01，***代表P<0.001。
如图2显示，实时荧光定量PCR结果表明，烟粉虱MED隐种经过低温胁迫处理5h(C)后，Btbrm2基因的表达量显著升高；高温胁迫处理1h(A)后，Btbrm2基因的表达量即显著升高。而短时高、低温胁迫处理后，烟粉虱本地种Asia II 1隐种该基因的表达量显著降低。比较不同隐种在同一温度胁迫下Btbrm2基因的表达量发现，高、低温胁迫处理后MED隐种Btbrm2基因的表达量显著高于Asia II 1隐种。
实施例3：分析Btbrm2基因对烟粉虱MED隐种温度耐受性的影响
3.1合成dsRNA
(1)设计合成加上T7启动子(下划线所示序列)的引物序列：
T7+Btbrm2-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGTGATATGTCAGGGCT-3’
T7+Btbrm2-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGGTGATTGGTGG-3’。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(2)总RNA提取及cDNA合成：同实施例1。
(3)T7引物PCR扩增、产物纯化，纯化所得的PCR产物即为合成dsRNA的模板。使用试剂盒合成和纯化dsRNA，按照试剂盒说明书进行操作。
3.2dsRNA饲喂
Parafilm膜预先用DEPC水处理以去除RNA酶。在浓度为10％的蔗糖液中加入dsRNA，浓度为0.3～0.5μg/μL。根据烟粉虱的取食特点，对Parafilm膜夹营养液法做了相应的改进：取初羽化烟粉虱成虫约200头，放入两端通透的玻璃管中，用双层Parafilm覆盖玻璃管上端，在两膜之间加入浓度为10％的蔗糖溶液200μL，并加入dsRNA，并使其终浓度为0.3-0.5μg/μL，玻璃管下端用纱布覆上，保持通风透气。玻璃管周围及下端用黑色塑料包裹，使烟粉虱向顶端Paraflim膜聚集更好的取食dsRNA，将装置放入人工气候箱(温度26±0.5℃，24h光照，相对湿度为60-70％)，饲喂3h。把完成饲喂的烟粉虱收集于指型管中，一组放入预热的高温水浴锅进行热击倒，并开始记录至烟粉虱不能自主站立的时间，处理温度为45℃。另一组放入低温水浴锅中进行冷击倒十分钟后取出记录冷致昏恢复时间，处理温度为-5℃。以未做任何处理(CK)、饲喂10％蔗糖溶液和饲喂含有dsEGFP的10％蔗糖混合溶液(dsEGFP终浓度为0.3-0.5μg/μL)的烟粉虱为对照，各处理均设置4个生物学重复。
通过2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量，结果如图3所示，饲喂dsBtbrm2可以显著降低Btbrm2基因的表达。利用SAS 9.4统计软件分析饲喂不同溶液后烟粉虱MED隐种成虫的高温击倒时间和低温冷致昏恢复时间，结果如图4所示，饲喂Btbrm2基因dsRNA的烟粉虱MED隐种的高温击倒时间(A)显著低于CK组、饲喂dsEGFP组和蔗糖组的击倒时间，而低温冷致昏恢复时间(B)显著高于三个对照组(P<0.05)；所饲喂的靶序列片度为Btbrm2基因特有的序列，由此确保了干扰效果为烟粉虱MED隐种的目的Btbrm2基因所产生，因此，说明Btbrm2基因在烟粉虱MED隐种温度耐受性中起着关键作用。
本发明从烟粉虱MED隐种中克隆得到Btbrm2基因的全长cDNA，荧光定量PCR显示Btbrm2基因在不同温度下在不同烟粉虱隐种中表达量存在差异；最后通过饲喂Btbrm2基因dsRNA，进而导致烟粉虱MED隐种成虫的高温击倒时间显著缩短、低温冷致昏恢复时间显著延长。根据本发明的具体实施方式，试验结果明确了Btbrm2基因在烟粉虱MED隐种温度耐受性中起关键作用。本发明为进一步研究烟粉虱MED隐种的温度耐受性机理与表观遗传之染色质重塑的关系奠定基础，可用于破坏烟粉虱温度耐受性，进而用于防治烟粉虱的危害及扩散。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 烟粉虱MED隐种染色质重塑因子Btbrm2及其编码基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4548
<212> DNA
<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)
<400> 1
atggcagctc ccactcaaga caatctgaat gctttgcagc acgctataga ttcaatggaa 60
gagaaaggta tgcaagagga tcctagatat tctcagctcc tcgctatcag agctcgtcaa 120
aataacatgg agccccctcg acttcctgga tcgcaaggat tttgcgtatc ctctgatagc 180
ccatcgaatt ccaagcaagt tttgagtccc atccagttgc aacagttacg agtccaaatc 240
atggcatatc gagttctcgc tcggaatcag ccgttgcctc atcaacttgc agtagcggtt 300
caagggaaac gaatggactc gtctctcatt caaccgggtc tgggacctcc acctctcatg 360
cctccaacct ccggtggaaa cactccaagc ccacaagcac gacccactga ttcaagcaat 420
gaaaactcat ctggaatgag tgcagctcct gtgtaccctg tcgcaccccc aacttcaccc 480
aacgtacccc aaggacctcc gccatctcag ttgcccccag taaccccacc tcccccacag 540
tcatcctcaa cgatggctcc acctcctgct gttccagcac cacctgctcc atctgttcct 600
gcccctctcc caccccctgc tctcaattca acaccccctg cgcccctcat gcctcccatt 660
tcagcaccga caccacctgt acccttgcag ccaccagtga cgtcacacgt ccatatcgcc 720
ccacccatgc ctcggctccc catcacgagt catcccgtca tggttgtccc tcctcctcct 780
aactcaatgc tgaaaccgat gcccagtcca gttgttctgc ctcctccgcc accaccaccc 840
cccaatccgc agcaacttac gcagcaactt cagttacaaa aacagaacag agttacgact 900
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gatgcggagc ggagagcttg cgtaatggaa atggaaagtg ggaaaaaatt gaagggagaa 1680
gaagctccct tgatggtgga cctaggcact tggctggaag ctcatcctgg ttgggaagca 1740
tgtgaggact cagaggcaga gactgaagaa gagtctgatt ctgattccga tcaaaatatc 1800
gaagaaaaaa ttgaagaagt caaagaagag aagaaaccaa aagaagaact tgatccgaaa 1860
gaagttgttg aaaaagcgaa aagtgaagac gatgaataca aaaatacctc cgaagaactt 1920
acctactaca gtattgctca cacaatcaat gaaattgtga cagaacaagc ctctatcatg 1980
gttaatggta aattaaaaga atatcaaatc aagggacttg agtggctagt ctctctgtac 2040
aataataatc tcaatggcat cctggccgat gaaatgggtc ttggaaaaac catccaaaca 2100
atcgcattga tcacatactt gatggagatg aaaaaagtaa acggtccata tttaatcatc 2160
gtacctcttt ccaccctttc aaattgggtg ttggagtttg aaaaatgggc cccatctgta 2220
aatgttgttg cgtacaaagg ctcaccagct gtcagacgtg cacttcaagc acaaatgaga 2280
tcatctaaat tcaatgtgct actcacaacg tatgaatacg ttatcaagga taaagctgtt 2340
ctagccaagt tgcactggaa gtacatgatc atcgatgaag ggcatcgaat gaagaatcac 2400
cattgcaaat tgacacaagt gctaaattca cattatgttg ttccgcaaag gctccttttg 2460
actggaactc cgttgcaaaa taagttgccc gaactgtggg ctctcctcaa ttttcttctt 2520
ccgtctattt tcaaatcctg ctcaacattt gaacagtggt tcaatgctcc ttttgccaca 2580
actggtgaaa aagtggaatt aaatgaggaa gaaactattt tgatcattcg ccgtctacat 2640
aaagttttac gtccattttt gctgcgacgt ttgaagaaag aagtcgagtc tcaacttcca 2700
gacaaaatcg aatatatcgt aaaatgtgat atgtcagggc tccagagagt cttgtatagg 2760
cacatgcaaa gtaaaggggt ccttctaact gatggctctg aaaaaggtaa caagggcaaa 2820
ggtggagcca aagcactgat gaatacaatt gtccaacttc gcaagttgtg caatcatcca 2880
ttcctgtttc aacatatcga agagaagttc tgcgatcata tcggctgttc gtcaaatggt 2940
gttgtaagtg gacctgacct ttatcgagtc tctggtaagt ttgaactatt ggatcgaatt 3000
ttgccaaagt tgaaggccac caatcaccga gtacttctat tttgtcaaat gacccagctc 3060
atgagcataa tggaggatta tttcaactgg cgaggattct cgtaccttcg tcttgatgga 3120
acaaccaaag cggaagatcg aggggattta ttgaaaaaat ttaacagcgc caccagtgaa 3180
tatttcatat tcttactgag cacacgagct ggtggacttg gcttaaatct tcaagctgca 3240
gacactgtag ttattttcga ctctgattgg aatccccatc aggatttaca agcgcaagat 3300
cgagcacatc gaattggtca aaagaacgag gtacgagtat tgaggttaat gacggtcaat 3360
tccgttgaag aacgaatctt agcagcagct cgatacaaat tgaacatgga tgaaaaagtc 3420
atccaggcag gcatgttcga tcagaagtct actggaactg agaggcagca gtttttgcat 3480
agtattttgc atcaagatga tgcagaagat gaggaagaga atgaggttcc ggatgatgaa 3540
actgtaaatc agatgattgc tcgcagtgaa gctgaatttg acacttttca aaaaatggat 3600
gctgaaagac gcaaagaaga gtctaagggc aaaaaatccc ggcttattga ggagagtgaa 3660
ctaccagact ggttggttaa agatgacgca gaggttgaag cttggacgta cgaacaggaa 3720
gaagtgcaga tgggacgagg ctcaaggaca agaaaggaaa ttgactactc agacagcatg 3780
acagaaaagg aatggttaaa ggccattgat gatggtattg atgactttga tgagattgaa 3840
gatgaagtga aagtgaagaa aactcgcaaa cggcgcaaaa aagaagagga ggaagaggaa 3900
ccggccaaaa aacgaagaaa tggtacagag aagaatccgc aagagaaaac accacctgct 3960
aattcaggag cggatgctcg aatgaagaag caaatgcata aattgatgac gattgttgta 4020
gagtacactg aacctcaaga ttcgcgtgtt ctcagtgaac cattcatgaa actaccatct 4080
cgtcgtgaac ttcctgatta ttatgaagtc atcaagaaac ccctcgacat caagaaaatt 4140
ctcacaaaaa ttgatgaagg aaagtacgag gaactggatg atctggagcg cgatttcatg 4200
caattatgca agaatgcgca gttgtataat gaagaagcat cactcatcta tgaagactca 4260
attgtactgc agtctgtttt tacgaacgct cgtcagcgtt tggaaagtga agaggaagaa 4320
gctccggagg aagaagaaaa agcggcacct gctgaagagg aagcctcatc tggagcagaa 4380
tcgtcctctg tgaaaatgaa attaaaattg aaggcatcaa ccaaagcgcc gaaaaattcc 4440
gatgccaaaa ctgatacaaa gtctacccca cgatcaagga aaagaacctc gaaaaaatac 4500
ataagtgacg atgagaatga agatgatgcc gaatcaagta atggctaa 4548
<210> 2
<211> 1515
<212> PRT
<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)
<400> 2
Met Ala Ala Pro Thr Gln Asp Asn Leu Asn Ala Leu Gln His Ala Ile
1 5 10 15
Asp Ser Met Glu Glu Lys Gly Met Gln Glu Asp Pro Arg Tyr Ser Gln
20 25 30
Leu Leu Ala Ile Arg Ala Arg Gln Asn Asn Met Glu Pro Pro Arg Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Gln Gly Phe Cys Val Ser Ser Asp Ser Pro Ser Asn Ser
50 55 60
Lys Gln Val Leu Ser Pro Ile Gln Leu Gln Gln Leu Arg Val Gln Ile
65 70 75 80
Met Ala Tyr Arg Val Leu Ala Arg Asn Gln Pro Leu Pro His Gln Leu
85 90 95
Ala Val Ala Val Gln Gly Lys Arg Met Asp Ser Ser Leu Ile Gln Pro
100 105 110
Gly Leu Gly Pro Pro Pro Leu Met Pro Pro Thr Ser Gly Gly Asn Thr
115 120 125
Pro Ser Pro Gln Ala Arg Pro Thr Asp Ser Ser Asn Glu Asn Ser Ser
130 135 140
Gly Met Ser Ala Ala Pro Val Tyr Pro Val Ala Pro Pro Thr Ser Pro
145 150 155 160
Asn Val Pro Gln Gly Pro Pro Pro Ser Gln Leu Pro Pro Val Thr Pro
165 170 175
Pro Pro Pro Gln Ser Ser Ser Thr Met Ala Pro Pro Pro Ala Val Pro
180 185 190
Ala Pro Pro Ala Pro Ser Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Pro Ala Leu
195 200 205
Asn Ser Thr Pro Pro Ala Pro Leu Met Pro Pro Ile Ser Ala Pro Thr
210 215 220
Pro Pro Val Pro Leu Gln Pro Pro Val Thr Ser His Val His Ile Ala
225 230 235 240
Pro Pro Met Pro Arg Leu Pro Ile Thr Ser His Pro Val Met Val Val
245 250 255
Pro Pro Pro Pro Asn Ser Met Leu Lys Pro Met Pro Ser Pro Val Val
260 265 270
Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asn Pro Gln Gln Leu Thr Gln
275 280 285
Gln Leu Gln Leu Gln Lys Gln Asn Arg Val Thr Thr Ile Pro Arg Pro
290 295 300
Thr Gly Ile Asp Pro Ile Leu Ile Leu Gln Glu Arg Glu Asn Arg Val
305 310 315 320
Ala Ala Arg Ile Ala His His Met Glu Lys Leu Ser Asn Leu Pro Ser
325 330 335
Thr Val Ser Asp Glu Ile Arg Leu Lys Ala Gln Ile Glu Leu Arg Ala
340 345 350
Leu Arg Ile Leu Asn Phe Gln Arg Gln Leu Arg Ser Glu Ile Ile Ser
355 360 365
Cys Ala Arg Arg Asp Ser Thr Leu Glu Thr Ala Val Asn Met Lys Ala
370 375 380
Tyr Lys Arg Val Lys Thr Gln Gly Leu Lys Glu Ser Arg Ala Thr Glu
385 390 395 400
Lys Leu Glu Lys Gln Gln Lys Leu Glu Ala Glu Arg Lys Arg Arg Gln
405 410 415
Lys His Gln Glu Tyr Leu Ala Ala Ile Ile Gln His Gly Lys Asp Phe
420 425 430
Lys Glu Tyr His Arg Asn Asn Gln Ala Arg Ile Val Arg Leu Asn Lys
435 440 445
Ala Met Leu Ser Tyr His Val Asn Ala Glu Arg Glu Gln Lys Lys Glu
450 455 460
Gln Glu Arg Ile Glu Lys Glu Arg Met Arg Arg Leu Met Ala Glu Asp
465 470 475 480
Glu Glu Gly Tyr Arg Lys Leu Ile Asp Gln Lys Lys Asp Lys Arg Leu
485 490 495
Ala Phe Leu Leu Ser Gln Thr Asp Glu Tyr Ile Thr Asn Leu Thr Glu
500 505 510
Met Val Lys Gln His Lys Val Glu Gln Lys Arg Lys Leu Ala Glu Lys
515 520 525
Ala Lys Glu Asp Lys Arg Lys Lys Lys Glu Thr Glu Asp Ala Glu Arg
530 535 540
Arg Ala Cys Val Met Glu Met Glu Ser Gly Lys Lys Leu Lys Gly Glu
545 550 555 560
Glu Ala Pro Leu Met Val Asp Leu Gly Thr Trp Leu Glu Ala His Pro
565 570 575
Gly Trp Glu Ala Cys Glu Asp Ser Glu Ala Glu Thr Glu Glu Glu Ser
580 585 590
Asp Ser Asp Ser Asp Gln Asn Ile Glu Glu Lys Ile Glu Glu Val Lys
595 600 605
Glu Glu Lys Lys Pro Lys Glu Glu Leu Asp Pro Lys Glu Val Val Glu
610 615 620
Lys Ala Lys Ser Glu Asp Asp Glu Tyr Lys Asn Thr Ser Glu Glu Leu
625 630 635 640
Thr Tyr Tyr Ser Ile Ala His Thr Ile Asn Glu Ile Val Thr Glu Gln
645 650 655
Ala Ser Ile Met Val Asn Gly Lys Leu Lys Glu Tyr Gln Ile Lys Gly
660 665 670
Leu Glu Trp Leu Val Ser Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu
675 680 685
Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile
690 695 700
Thr Tyr Leu Met Glu Met Lys Lys Val Asn Gly Pro Tyr Leu Ile Ile
705 710 715 720
Val Pro Leu Ser Thr Leu Ser Asn Trp Val Leu Glu Phe Glu Lys Trp
725 730 735
Ala Pro Ser Val Asn Val Val Ala Tyr Lys Gly Ser Pro Ala Val Arg
740 745 750
Arg Ala Leu Gln Ala Gln Met Arg Ser Ser Lys Phe Asn Val Leu Leu
755 760 765
Thr Thr Tyr Glu Tyr Val Ile Lys Asp Lys Ala Val Leu Ala Lys Leu
770 775 780
His Trp Lys Tyr Met Ile Ile Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His
785 790 795 800
His Cys Lys Leu Thr Gln Val Leu Asn Ser His Tyr Val Val Pro Gln
805 810 815
Arg Leu Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu
820 825 830
Trp Ala Leu Leu Asn Phe Leu Leu Pro Ser Ile Phe Lys Ser Cys Ser
835 840 845
Thr Phe Glu Gln Trp Phe Asn Ala Pro Phe Ala Thr Thr Gly Glu Lys
850 855 860
Val Glu Leu Asn Glu Glu Glu Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His
865 870 875 880
Lys Val Leu Arg Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu
885 890 895
Ser Gln Leu Pro Asp Lys Ile Glu Tyr Ile Val Lys Cys Asp Met Ser
900 905 910
Gly Leu Gln Arg Val Leu Tyr Arg His Met Gln Ser Lys Gly Val Leu
915 920 925
Leu Thr Asp Gly Ser Glu Lys Gly Asn Lys Gly Lys Gly Gly Ala Lys
930 935 940
Ala Leu Met Asn Thr Ile Val Gln Leu Arg Lys Leu Cys Asn His Pro
945 950 955 960
Phe Leu Phe Gln His Ile Glu Glu Lys Phe Cys Asp His Ile Gly Cys
965 970 975
Ser Ser Asn Gly Val Val Ser Gly Pro Asp Leu Tyr Arg Val Ser Gly
980 985 990
Lys Phe Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Pro Lys Leu Lys Ala Thr Asn
995 1000 1005
His Arg Val Leu Leu Phe Cys Gln Met Thr Gln Leu Met Ser Ile Met
1010 1015 1020
Glu Asp Tyr Phe Asn Trp Arg Gly Phe Ser Tyr Leu Arg Leu Asp Gly
1025 1030 1035 1040
Thr Thr Lys Ala Glu Asp Arg Gly Asp Leu Leu Lys Lys Phe Asn Ser
1045 1050 1055
Ala Thr Ser Glu Tyr Phe Ile Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly
1060 1065 1070
Leu Gly Leu Asn Leu Gln Ala Ala Asp Thr Val Val Ile Phe Asp Ser
1075 1080 1085
Asp Trp Asn Pro His Gln Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg
1090 1095 1100
Ile Gly Gln Lys Asn Glu Val Arg Val Leu Arg Leu Met Thr Val Asn
1105 1110 1115 1120
Ser Val Glu Glu Arg Ile Leu Ala Ala Ala Arg Tyr Lys Leu Asn Met
1125 1130 1135
Asp Glu Lys Val Ile Gln Ala Gly Met Phe Asp Gln Lys Ser Thr Gly
1140 1145 1150
Thr Glu Arg Gln Gln Phe Leu His Ser Ile Leu His Gln Asp Asp Ala
1155 1160 1165
Glu Asp Glu Glu Glu Asn Glu Val Pro Asp Asp Glu Thr Val Asn Gln
1170 1175 1180
Met Ile Ala Arg Ser Glu Ala Glu Phe Asp Thr Phe Gln Lys Met Asp
1185 1190 1195 1200
Ala Glu Arg Arg Lys Glu Glu Ser Lys Gly Lys Lys Ser Arg Leu Ile
1205 1210 1215
Glu Glu Ser Glu Leu Pro Asp Trp Leu Val Lys Asp Asp Ala Glu Val
1220 1225 1230
Glu Ala Trp Thr Tyr Glu Gln Glu Glu Val Gln Met Gly Arg Gly Ser
1235 1240 1245
Arg Thr Arg Lys Glu Ile Asp Tyr Ser Asp Ser Met Thr Glu Lys Glu
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Trp Leu Lys Ala Ile Asp Asp Gly Ile Asp Asp Phe Asp Glu Ile Glu
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Asp Glu Val Lys Val Lys Lys Thr Arg Lys Arg Arg Lys Lys Glu Glu
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1505 1510 1515