阅读说明：本技术 大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法 (Ultralow-temperature cryopreservation method for paramisgurnus dabryanus semen ) 是由 陆专灵 韦友传 王大鹏 唐章生 乔瑞峰 高爽爽 雷坤 谢业扬 侯树鉴 卢智发 钟 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法,包括以下步骤：步骤一、将NaCl、KCl、CaCl<Sub>2</Sub>·2H<Sub>2</Sub>O、MgCl<Sub>2</Sub>·6H<Sub>2</Sub>O、NaHCO<Sub>3</Sub>按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合,配置成稀释液,置于4℃保存,备用；步骤二、将大鳞副泥鳅精液与稀释液按照体积比为1:2～4进行混合,再加入体积分数为7.5％～12.5％的DMSO混匀,得到精液抗冻混合液,并分装于冻存管中；步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min,接着在液氮面上平衡5min,最后投入液氮中冷冻保存。本发明使得精子活力,精子的寿命,细胞膜的完整率都得到提高,成为有效、持久的保存方法。(The invention discloses an ultralow temperature cryopreservation method for paramisgurnus dabryanus semen, which comprises the following steps: step one, adding NaCl, KCl and CaCl 2 ·2H 2 O、MgCl 2 ·6H 2 O、NaHCO 3 Mixing according to the concentration ratio of 80:50:5:2:50 in sequence to prepare a diluent, and storing at 4 ℃ for later use; mixing the paramisgurnus dabryanus semen with the diluent according to the volume ratio of 1: 2-4, adding DMSO with the volume fraction of 7.5% -12.5%, uniformly mixing to obtain a semen anti-freezing mixed solution, and sub-packaging in a freezing storage tube; and step three, balancing the freezing tube in the step two at a position 6cm above the liquid nitrogen surface for 10min, balancing on the liquid nitrogen surface for 5min, and finally putting into liquid nitrogen for freezing and preserving. The invention improves the sperm motility, the service life of the sperm and the integrity rate of the cell membrane, and becomes an effective and durable preservation method.)

大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及***超低温冷冻保存技术领域，具体是一种大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法。

背景技术

大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)属鲤形目鳅科花鳅亚科副泥鳅属，自然分布于长江、嘉陵江和岷江水系、辽河中下游、黄河及黑龙江地区，其肉质鲜美，维生素和不饱合脂肪酸含量丰富，中医记载具有补血益气、壮阳利尿的功能，已成为我国重要的淡水养殖品种。随着大鳞副泥鳅养殖规模和苗种需求日益扩大，人工育苗才能满足苗种的养殖需求。然而，人工育苗多为近亲交配，易产生种质退化、遗传多样性下降和抗病抗逆性能降低等问题，严重影响大鳞副泥鳅养殖业的可持续健康发展。

不同鱼类的***超低温冷冻保存方法是存在差异的。作为重要的经济养殖鱼类，大鳞副泥鳅***常温(20～24℃)和超低温冷冻(-196℃)保存都进行过研究，常温状态下，保存时间较短，至多保存132h；在超低温冷冻中，虽保存时间延长，由于未进行多种方案探讨，无法确定是否还有最佳方案。且现有的保存方法，对于大鳞副泥鳅的***的活力、***的寿命、细胞膜的完整率均很低，不利于有效、持久的保存。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法，其使得***活力，***的寿命，细胞膜的完整率都得到提高，成为有效、持久的保存方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：

步骤一、将NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合，配置成稀释液，置于4℃保存，备用；

步骤二、将大鳞副泥鳅***与稀释液按照体积比为1:2～4进行混合，再加入体积分数为7.5％～12.5％的DMSO混匀，得到***抗冻混合液，并分装于冻存管中；

步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中冷冻保存。

优选的是，还包括：

步骤四、将***抗冻混合液从液氮中取出，于液氮口处平衡5min后，再于37℃水浴中解冻直至融化。

优选的是，步骤二中大鳞副泥鳅***与稀释液的体积比为1:3，DMSO的体积分数为10％。

优选的是，步骤二中大鳞副泥鳅***通过以下方式采集：使用MS-222溶液对大鳞副泥鳅雄鱼进行麻醉处理，用毛巾擦干鱼体水分，挤压腹部采集***。

优选的是，步骤二中大鳞副泥鳅***与稀释液混合前，将大鳞副泥鳅***盛装于离心管中，在20℃的恒温水浴中保温10min，再加入浓度为50IU/mL的青霉素混匀，然后控制离心转速为160rpm，离心处理4min，保留下层液体，在下层液体中加入葡萄糖和甘油混匀，最后与稀释液混合，其中，每10mL下层液体中加入葡萄糖0.05g和0.5mL甘油。

优选的是，步骤四中在解冻过程中，将水浴中的冻存管固定，以300r/min的转速搅动水浴中的水。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明的***超低温冷冻保存技术可以有效、持久的保存***，方便苗种场之间运输和利于开展不同品种或品系以及不同地理种群间鱼类的杂交，发挥杂交优势，是解决近亲交配问题的有效手段之一。

本发明的***超低温冷冻保存技术获得的大鳞副泥鳅***的***活力高达50％，***的寿命达到69s，细胞膜的完整率达到82％，且经过离心等处理以及水浴解冻后的***活力高达62％，***的寿命达到75s，细胞膜的完整率达到87％。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为不同体积分数的DMSO对***活力的影响图；

图2为不同的***与稀释液的比例对***活力的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

<实施例1>

本发明提供了一种大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：

步骤一、将NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合，配置成稀释液，置于4℃保存，备用；其中，NaCl的浓度可取80mmol/L，KCl的浓度可取50mmol/L，CaCl₂·2H₂O的浓度可取5mmol/L，MgCl₂·6H₂O的浓度可取2mmol/L，NaHCO₃的浓度可取50mmol/L；

步骤二、将大鳞副泥鳅***与稀释液按照体积比为1:2进行混合，再加入体积分数为7.5％的DMSO混匀，得到***抗冻混合液，并分装于冻存管中；

步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中冷冻保存。

步骤四、将***抗冻混合液从液氮中取出，于液氮口处平衡5min后，再于37℃水浴中解冻直至融化。

其中，步骤二中大鳞副泥鳅***通过以下方式采集：使用MS-222溶液对大鳞副泥鳅雄鱼进行麻醉处理，用毛巾擦干鱼体水分，挤压腹部采集***。

<实施例2>

本发明提供了一种大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：

步骤一、将NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合，配置成稀释液，置于4℃保存，备用；其中，NaCl的浓度可取80mmol/L，KCl的浓度可取50mmol/L，CaCl₂·2H₂O的浓度可取5mmol/L，MgCl₂·6H₂O的浓度可取2mmol/L，NaHCO₃的浓度可取50mmol/L；

步骤二、将大鳞副泥鳅***与稀释液按照体积比为1:3进行混合，再加入体积分数为10％的DMSO混匀，得到***抗冻混合液，并分装于冻存管中；

步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中冷冻保存。

步骤四、将***抗冻混合液从液氮中取出，于液氮口处平衡5min后，再于37℃水浴中解冻直至融化。

其中，步骤二中大鳞副泥鳅***通过以下方式采集：使用MS-222溶液对大鳞副泥鳅雄鱼进行麻醉处理，用毛巾擦干鱼体水分，挤压腹部采集***。

<实施例3>

本发明提供了一种大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：

步骤一、将NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合，配置成稀释液，置于4℃保存，备用；其中，NaCl的浓度可取80mmol/L，KCl的浓度可取50mmol/L，CaCl₂·2H₂O的浓度可取5mmol/L，MgCl₂·6H₂O的浓度可取2mmol/L，NaHCO₃的浓度可取50mmol/L；

步骤二、将大鳞副泥鳅***与稀释液按照体积比为1:4进行混合，再加入体积分数为12.5％的DMSO混匀，得到***抗冻混合液，并分装于冻存管中；

步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中冷冻保存。

步骤四、将***抗冻混合液从液氮中取出，于液氮口处平衡5min后，再于37℃水浴中解冻直至融化。

其中，步骤二中大鳞副泥鳅***通过以下方式采集：使用MS-222溶液对大鳞副泥鳅雄鱼进行麻醉处理，用毛巾擦干鱼体水分，挤压腹部采集***。

<实施例4>

本发明提供了一种大鳞副泥鳅***超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：

步骤一、将NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合，配置成稀释液，置于4℃保存，备用；其中，NaCl的浓度可取80mmol/L，KCl的浓度可取50mmol/L，CaCl₂·2H₂O的浓度可取5mmol/L，MgCl₂·6H₂O的浓度可取2mmol/L，NaHCO₃的浓度可取50mmol/L；

步骤二、将大鳞副泥鳅***与稀释液按照体积比为1:3进行混合，再加入体积分数为10％的DMSO混匀，得到***抗冻混合液，并分装于冻存管中；

步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中冷冻保存。

步骤四、将***抗冻混合液从液氮中取出，于液氮口处平衡5min后，再于37℃水浴中解冻直至融化。

其中，步骤二中大鳞副泥鳅***通过以下方式采集：使用MS-222溶液对大鳞副泥鳅雄鱼进行麻醉处理，用毛巾擦干鱼体水分，挤压腹部采集***。

步骤二中大鳞副泥鳅***与稀释液混合前，将大鳞副泥鳅***盛装于离心管中，在20℃的恒温水浴中保温10min，再加入浓度为50IU/mL的青霉素混匀，然后控制离心转速为160rpm，离心处理4min，保留下层液体，在下层液体中加入葡萄糖和甘油混匀，最后与稀释液混合，其中，每10mL下层液体中加入葡萄糖0.05g和0.5mL甘油。

步骤四中在解冻过程中，将水浴中的冻存管固定，以300r/min的转速搅动水浴中的水。

使用本发明的制备方法，本发明中使用的DMSO的体积分数的范围通过对比经超低温冷冻保存后的***活力得到(保存一周后的***活力)。通过图1可知，体积分数为7.5％～12.5％的DMSO，使得最终的***活力达到40％以上。图1中不同字母代表差异性显著(P<0.05)，

使用本发明的制备方法，本发明中使用的***与稀释液的比例范围通过对比经超低温冷冻保存后的***活力得到(保存一周后的***活力)。通过图2可知，***与稀释液的比例范围在1:2～4之间，使得最终的***活力达到50％以上。图2中不同字母代表差异性显著(P<0.05)，

<对比试验>

对比例1：将实施例2中的稀释液替换为鱼用任氏液，鱼用任氏液为：NaCl 0.78g，CaCl₂ 0.021g，KCl 0.02g，NaHCO₃ 0.2g，加双蒸水至100mL，pH＝8.0；

对比例2：将实施例2中的稀释液替换为Hanks***保存液，Hanks***保存液由甲液和乙液组成(甲液:NaCl 9.6g，KCl 0.48g，CaCl₂ 0.168g，MgSO₄·7H₂O 0.274g，蒸馏水60mL；乙液:NaHCO₃ 0.42g，Na₂HPO₄·H₂O 0.208g，KH₂PO₄ 0.072g，C₆H₁₂O₆·H₂O 1.2g，蒸馏水60mL；

对比例3：将实施例2中的稀释液替换为葡萄糖2.90g，KCl 0.05g，CaCl₂ 0.02g，NaHCO₃ 0.21g，蒸馏水100mL；

对比例4：将实施例2中的稀释液替换为NaCl 0.75g，KCl 0.03g，葡萄糖0.3g，NaHCO₃0.04g，再加入蒸馏水至100mL。

如下表1所示，展示了实施例1-4以及对比例1-4的***在保存一周后，进行解冻后的***的质量，说明了以本发明的稀释液的配方，结合抗冻剂DMSO(终浓度为10％)处理后的大鳞副泥鳅***的***活力高达50％，***的寿命达到69s，细胞膜的完整率达到82％，且经过离心等处理以及水浴解冻后的***活力高达62％，***的寿命达到75s，细胞膜的完整率达到87％。

表1

	***的活力	***的寿命	细胞膜的完整率
				实施例1	47％	67s	80％
实施例2	50％	69s	82％
				实施例3	48％	68s	79％
实施例4	62％	75s	87％
				对比例1	25％	42s	50％
对比例2	28％	46s	54％
				对比例3	16％	34s	43％
对比例4	22％	39s	46％

本发明中各个实施例以及对比例中使用的大鳞副泥鳅雄鱼是2龄，体长(20.3±2.4)cm，体质量(78±5)g，由广西水产科学研究院那马基地赠送，实验室暂养两周,水温(26±2)℃，每天喂食1次商品颗粒饲料，确认健康状态良好后用于后续实验。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。