阅读说明：本技术 一种牛***冷冻稀释液及其制备方法与应用 (Bovine semen freezing diluent and preparation method and application thereof ) 是由 马毅 陈丽丽 孙欢 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种牛精液冷冻稀释液,包括一液和二液；一液包括卵黄、三羟基氨基甲烷、柠檬酸、果糖、乳糖、棉籽糖、青霉素和链霉素；二液包括一液、甘油、丙酮酸、青霉素和链霉素。本发明的有益效果是：本发明在一定程度上提高了精子冷冻解冻后的完整性,且在显微镜下观察拥有清晰的视野,更适合对解冻后精液进行观察、检测和操作。(The invention provides a bovine semen freezing diluent, which comprises a first liquid and a second liquid; one liquid comprises yolk, trihydroxy aminomethane, citric acid, fructose, lactose, raffinose, penicillin and streptomycin; the two solutions comprise one solution, glycerol, pyruvic acid, penicillin and streptomycin. The invention has the beneficial effects that: the invention improves the integrity of the frozen and thawed sperms to a certain extent, has clear visual field when being observed under a microscope, and is more suitable for observing, detecting and operating the thawed semen.)

一种牛***冷冻稀释液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及动物***稀释液领域，更具体地说涉及一种牛***冷冻稀释液及其制备方法，本发明更公开了牛***冷冻稀释液在提高牛***冷冻解冻后品质和增加镜检视野清晰度方面的应用。

背景技术

牛是一种世代间隔长，繁殖率低的畜种；在牛的育种过程中，牛群的生产水平在很大程度上取决于种公牛的遗传水平，种公牛对牛群整体遗传改良的贡献可以达到总遗传进展的75％-95％。因此选育出优秀的种公牛，生产尽可能多的高质量冻精，保证母牛的受胎率在繁殖育种工作中尤为重要。

***结构、生化和生理功能在冷冻解冻过程中会受到严重破坏，如何将***在冷冻解冻过程所受的损伤降到最低一直是研究的热点。牛的***冷冻保存不仅可以延长***的存活时间，使***不受时间、地域以及动物自身的限制，最大限度地提高种公牛的利用率，降低生产成本，而且对加速新品系的育成有重要的作用，也可以起到保护优良种质资源的作用。最先进行***冷冻尝试的是意大利研究者Spallanzani，他在1787年以冰雪为冷源对人和马的***进行冷冻保存试验，在加热升温解冻后发现仍有少数的***能存活，这一发现为后来进行马***保存技术及***冻融损伤机制的研究奠定了基础。20世纪初，研究者将制冷技术与***冷冻技术结合，开始了***超低温冷冻保存的研究。在***冷冻保存过程中，选择合适的稀释液成分对解冻后***的品质十分重要。***对温度非常敏感，尤其是在15～-60℃时，***易受低温打击，冷冻保存过程中细胞内冰晶的形成是影响解冻后***质量的主要原因之一，冷冻效果的好坏在一定程度上取决于稀释液组分中的冷冻保护剂。

近些年，随着国外冻精生产设备的不断引进和***冷冻生产流程的改进，冷冻***生产技术已取得长足进步，但仍存在一些问题，表现为冷冻解冻后的***活力差、畸形率高，且国内外现用的***稀释液多为卵黄稀释液，由于卵黄中存在较多的脂类，在应用中存在黏度过大、蛋黄脂肪颗粒大而不均匀，影响***运动速率的问题，且不利于冷冻解冻后的观察与操作等问题。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种牛***冷冻稀释液，另一目的是提供一种牛***冷冻稀释液的制备方法，及提高牛***冷冻解冻后品质和增加镜检视野清晰度方面的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种牛***冷冻稀释液，包括一液和二液；

所述一液包括卵黄、三羟基氨基甲烷、柠檬酸、果糖、乳糖、棉籽糖、青霉素和链霉素；

所述二液包括一液、甘油、丙酮酸、青霉素和链霉素。

优选的，每100ml所述一液各原料的含量包括：15-25ml卵黄、1.2-1.4g三羟基氨基甲烷、0.5-0.9g柠檬酸、0.2-0.4g果糖、1-2g乳糖、2-3g棉籽糖、10万国际单位青霉素、10万国际单位链霉素和余量为水。

在上述任一方案中优选的是、每100ml所述一液各原料的含量包括：20ml卵黄、1.375g三羟基氨基甲烷、0.75g柠檬酸、0.375g果糖、1.5g乳糖、2.7g棉籽糖、10万国际单位青霉素、10万国际单位链霉素和75ml水。

在上述任一方案中优选的是，每100ml所述二液各原料的含量包括：80-90ml一液，10-15ml甘油，0.3-0.4g丙酮酸，10万国际单位青霉素和10万国际单位链霉素。

在上述任一方案中优选的是，每100ml所述二液各原料的含量包括：86ml一液，14ml甘油，0.36g丙酮酸，10万国际单位青霉素和10万国际单位链霉素。

一种牛***冷冻稀释液的制备方法，包括如下步骤：

第一步，制备一液：称取三羟基氨基甲烷、柠檬酸、果糖、乳糖、棉籽糖、青霉素、链霉素和卵黄，加入双蒸水至100ml，在磁力搅拌器下充分搅拌2h，卵黄充分打开低密度脂蛋白是混合物，得到的混合溶液冷藏静置，取上清得到***冷冻稀释液一液；

第二步，制备二液：取所述第二步中的一液，准确称量甘油、丙酮酸、青霉素、链霉素，加一液至100ml，在磁力搅拌器下充分搅拌15分钟，得到***冷冻稀释液二液。

优选的，所述第一步中静置时间为36h，冷藏温度为4℃。

在上述任一方案中优选的是，所述第一步中每100ml加入的各原料的含量为：20ml卵黄，1.375g三羟基氨基甲烷，0.75g柠檬酸，0.375g果糖，1.5g乳糖，2.7g棉籽糖，10万国际单位青霉素，10万国际单位链霉素，余量为水。

在上述任一方案中优选的是，所述第二步中每100ml加入的各原料的含量为：86ml一液，14ml甘油，0.36g丙酮酸，10万国际单位青霉素，10万国际单位链霉素。

一种牛***冷冻稀释液，该牛***冷冻稀释液在提高牛***冷冻解冻后品质方面的应用。

本发明的有益效果为：

一种牛***冷冻稀释液配方，添加适量的三羟基氨基甲烷和柠檬酸，可以平衡***稀释液的PH值，同时柠檬酸根离子还可使卵黄中的脂肪颗粒很好地分散，形成清澈的稀释液，用这种稀释液稀释***后在显微镜下能被清晰的观察到。

棉籽糖是一种功能性低聚糖，具有多种生物功能，棉籽糖可促进钙的吸收及促进细胞质玻璃化，保证细胞膜保护功能，配方中添加的适量的棉籽糖可以对***的冻融起到更好的保护作用。

本发明在一定程度上提高了***冷冻解冻后的完整性，且在显微镜下观察拥有清晰的视野，更适合对解冻后***进行观察、检测和操作。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明，除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围(本发明所用原料及试剂市面均有销售)。

本发明主要解决的了常规牛***冷冻稀释液***冻融后***活力低且畸形率相对较高的问题，重点考察了***冻融后的活力与畸形率，该配方的主要难点在于所添加的成分选择，以及在配置过程中各成分添加量对***冷冻稀释液PH值与渗透压的影响。

本发明公开了的牛***冷冻稀释液与现有技术相比所具有的积极效应在于：

(1)提高***冻融后的***活力。

(2)降低***冻融后的***畸形率。

(3)增加***清晰度，便于显微镜下的观察与操作。

一、牛***冷冻稀释液的成分

一种牛***冷冻稀释液，它是由一液和二液组成；

所添加的一液成分为，每100ml含量：75ml水、20ml卵黄、1.375g三羟甲基氨基甲烷、0.75g柠檬酸、0.375g果糖、1.5g乳糖、2.7g棉籽糖、10万国际单位青霉素和10万国际单位链霉素；

所添加的二液成分为：每100ml含量：86ml一液、14ml甘油、0.36g丙酮酸、10万国际单位青霉素和10万国际单位链霉素。

二、牛***冷冻稀释液的制备

牛***冷冻稀释液的制备方法，按如下的步骤进行：

(1)制备一液：准确称取TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、柠檬酸、果糖、乳糖、棉籽糖、青霉素、链霉素、卵黄，加入双蒸水至100ml，在磁力搅拌器下充分搅拌2h，得到的混合溶液放入到4℃冰箱中静置36小时，取上清得到***冷冻稀释液一液；

(2)制备二液：准确称量甘油、丙酮酸、青霉素、链霉素，加一液至100ml，在磁力搅拌器下充分搅拌15分钟，得到***冷冻稀释液二液。

优选的，稀释液的组成详细配方见表1和表2

表1稀释液一液各成分添加量(每100ml)

名称	添加量
		水	75ml
卵黄	20ml
		TRIS	1.375g
柠檬酸	0.75g
		果糖	0.375g
乳糖	1.5g
		棉籽糖	2.7g
青霉素	10万IU
		链霉素	10万IU

表2稀释液二液各成分添加量(每100ml)

名称	添加量
		一液	86ml
甘油	14ml
		丙酮酸	0.36g
青霉素	10万IU
		链霉素	10万IU

三、实际应用

1、***采集

用假***法采集公牛***，于台畜的右后侧站立，右手握住假***，集精杯一端向上。当公牛爬跨时，将假***与公牛***方向成一直线，将***导入假***入口内，公牛的后驱向前冲即***，随后将假***集精杯向下倾斜，以使***完全流入集精杯内。当公牛爬下时，持假***随***后移，打开开关，放出空气，当***自行软缩脱出后迅速而自然地取下假***，并立即送入***处理室进行品质检测。

2、***冻存与解冻

(1)准备：将配制好的***冷冻稀释液一液放入到37℃的水浴锅中，将***放入到4℃平衡柜中；

(2)平衡与分装：将已预热到37℃的一液缓慢加入到检测合格的稀释液中，稀释到最终浓度的一半，***最终浓度为9.6×10³/ml。随后将加入一液的***放入到4℃平衡柜中经1.5小时缓慢降温。随后缓慢加入二液，将***稀释为所需的最终浓度，在平衡柜中平衡2小时。将平衡好的***用法国卡苏自动分装机分装到0.25ml的冻精细管内；

(3)冷冻：将冻精细管置于液氮面上1.5cm处熏蒸7分钟，随后将冻精细管投入到液氮中保存；

(4)解冻：随机取三只冻精，放入到37℃水浴锅中复苏45秒；

(5)观察解冻后***活力与畸形情况(结果统计情况见表3)。

表3鲜精及冻融后***活力与畸形率

阶段	***活力(％)	***畸形率(％)
			鲜精	70	8
冻精	45±0.15	9.6±1.1

四、本发明稀释液与常规***稀释液对比试验

采集种公牛***，检测其***活力与畸形率，新鲜******活力必须≥65％，且畸形率≤15％，分别用本发明配方制备的稀释液与常规***稀释液对***进行稀释。

常规***稀释液包括：一液：2.9％柠檬酸钠80mL、卵黄20mL、青霉素10万IU、链霉素10万IU。二液：2.9％柠檬酸钠和2.5％果糖溶液70mL、卵黄20mL、甘油10mL、青霉素10万IU、链霉素10万IU。

在相同条件下进行平衡与冷冻，解冻观察***活力及畸形率(结果统计情况见表4)。

表4与常规***对比试验

比较	鲜精活力(％)	鲜精畸形率(％)	冻精活力(％)	冻精畸形率(％)
					常规	70	8	41	10.9
本发明	70	8	45	9.6

试验结果显示本稀释液中所含杂质更少，拥有更加清晰的视野，***冻融后的***活力在45％左右，***畸形率在9.6％左右，提高了牛***冷冻解冻后品质(提高牛***冷冻解冻后品质指的是：提高了***冻融后的***活力，降低了***畸形率)。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。