阅读说明：本技术 菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法 (Dioscorea composita transgenic hairy root induction method ) 是由 谢君 周建婵 钟春梅 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,包括组培苗培养,转基因侵染菌液的制备,侵染与共培养,毛状根的诱导,毛状根的除菌培养,毛状根的液体扩大培养。本发明提供了针对菊叶薯蓣转基因毛状根的诱导方法,以菊叶薯蓣去根组培苗作为外植体,发根农杆菌C58C1作为诱导菌株,在特定浓度的乙酰丁香酮条件下可高效诱导产毛状根,诱导率可达50％～85％,同时本发明可根据需求诱导产生含不同目的基因的转基因毛状根。本发明对菊叶薯蓣功能基因的鉴定、薯蓣皂苷合成等生物代谢途径的研究、分子育种、次生代谢物产业化生产等具有重要意义。(The invention provides a dioscorea composita transgenic hairy root induction method, which comprises the steps of tissue culture seedling culture, preparation of transgenic infection bacterial liquid, infection and co-culture, induction of a hairy root, degerming culture of the hairy root and liquid expansion culture of the hairy root. The invention provides an induction method for dioscorea composita transgenic hairy roots, which takes dioscorea composita root-removed tissue culture seedlings as explants and agrobacterium rhizogenes C58C1 as induction strains, can efficiently induce and produce hairy roots under the condition of acetosyringone with specific concentration, and the induction rate can reach 50-85 percent. The invention has important significance for the identification of dioscorea composita functional genes, the research of biological metabolic pathways such as dioscin synthesis and the like, molecular breeding, the industrial production of secondary metabolites and the like.)

菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法。

背景技术

菊叶薯蓣(Dioscorea composita Hemsl.)为薯蓣科多年生缠绕型草本植物，原产于墨西哥，是墨西哥生产激素类药物原料薯蓣皂苷元的主要栽培品种之一。我国于1978年首次在西双版纳热带植物园引种成功，其特点是薯蓣块茎产量高，薯蓣皂苷元和淀粉含量也高，是生产薯蓣皂素和发酵生产燃料乙醇的优选原材料。但由于野生薯蓣资源被过度开采，其再生速度跟不上市场的需求，薯蓣皂苷元的产量也远无法满足甾体药物工业的生产需求，供求矛盾越发突出。因此，通过优选良好的薯蓣资源，并加以研究如何提高其根状或块茎的产量和薯蓣皂苷元的含量，掌握薯蓣皂苷元在植物体内的消长规律，以稳定其含量等潜在着巨大的经济效益。

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科农杆菌属的一种侵染性很强的革兰氏阴性土壤杆菌，能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及裸子植物，在植物基因工程领域具有广泛的应用。发根农杆菌携带的Ri质粒是位于发根农杆菌染色体之外独立的双链环状DNA，包括Vir区和T-DNA区。发根农杆菌侵染植物时，植物受创伤后在伤口处产生小分子酚类化合物，从而诱导活化Ri质粒上的Vir区基因群，调控T-DNA区，将诱导发根的基因位点rol基因(rol B、rol C等)转移到植物宿主细胞基因中，从而引起植物形态和代谢改变，导致毛状根产生。发根农杆菌诱导植物所产生的毛状根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定以及分化程度高、不易变异等特点，常用来作为很多重要研究的模型。

薯蓣属植物属于单子叶植物，而单子叶植物不合成酚类物质，如乙酰丁香酮，很难诱导出毛状根。根据毛状根诱导的相关研究报道，关于单子叶植物成功诱导毛状根的相关研究报道很少，而关于薯蓣属植物毛状根诱导的相关研究报道，目前也仅见于盾叶薯蓣的毛状根诱导有初步研究(陈永勤,沈君豪,潘军.盾叶薯蓣毛状根的诱导与薯蓣皂甙元的生产[J].湖北大学学报(自然科学版),2009(01):79-83.)，其应用R1601、A4等发根农杆菌，以盾叶薯蓣的茎段、叶片和愈伤组织为外植体进行了毛状根诱导，发现只有愈伤组织能够被诱导产生毛状根，而且诱导效率较低，为34.5％，而有关于菊叶薯蓣毛状根诱导的相关技术目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法，包括如下步骤：

S1.组培苗培养

将生根的菊叶薯蓣组培苗去掉根后转接到继代培养基上预培养10～20天，获得外植体；

S2.转基因工程菌的准备

将活化后的发根农杆菌C58C1经扩大培养后制备感受态细胞，然后转入含目的基因的表达载体，再筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌C58C1工程菌；

S3.转基因侵染菌液的制备

将步骤S2的转基因发根农杆菌C58C1工程菌经进行扩大培养，OD₆₀₀在0.5～0.6时，离心收集菌种，然后用含有乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基重悬菌体，至OD₆₀₀在0.5～0.6，得到侵染菌液；

S4.侵染与共培养

将步骤S1的外植体于步骤S3的侵染菌液中侵染15～30min，侵染完毕后，移出外植体并去除外植体表面的液体，然后将外植体转接至含有乙酰丁香酮的MS固体培养基，于23～27℃黑暗共培养2～3天；

S5.毛状根的诱导

将外植体从共培养的培养基中取出，置于含有头孢噻肟钠抗生素无菌水中浸泡8～10分钟，然后用纯无菌水清洗2～4遍；待清洗完毕后将去除外植体表面的水分，然后将外植体转接至含有头孢噻肟钠的MS固体培养基中培养；

S6.毛状根的除菌培养

待外植体发根后12～16天，去掉外植体的茎、叶，将留下的毛状根转接到新的含头孢噻肟钠的MS固体培养基中，每两周转接一次，并且不断降低头孢噻肟钠的工作浓度直到为零；

S7.毛状根的液体扩大培养

将除菌培养后的毛状根从外植体分离成一条一条，然后接种到1/2MS液体培养基震荡培养。

优选地，还包括转基因毛状根PCR检测步骤：提取毛状根DNA，然后进行PCR鉴定，鉴定基因包括rol B、rol C以及转入的目的基因。

优选地，所述继代培养基为MS+0.05～0.3mg/L NAA+1.2～1.7mg/L 6-BA。

进一步优选地，所述继代培养基为MS+0.1mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA。

优选地，步骤S1预培养为23～27℃，光照强度1500～2500lx，每天光照时间14～18h，培养10～20天。

进一步优选地，步骤S1预培养为25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h，培养约两周。

优选地，步骤S2为活化发根农杆菌C58C1并制作感受态细胞，然后将含有目的基因的表达载体转化到该菌种的感受态细胞，复苏菌种，离心富集菌体，并涂布于含有利福平抗生素的YEB固体培养基上，待长出单菌落后，挑去单菌落培养，并进行PCR鉴定和酶切鉴定，阳性转基因工程菌C58C1。

进一步优选地，含目的基因的表达载体转化到发根农杆菌使用的是冻融法；菌种复苏条件为28℃，180r/min震荡培养3h；所使用的利福平抗生素的工作浓度为50mg/L。

优选地，步骤S4所述侵染为26～30℃，130～160r/min震荡侵染15～30min。

进一步优选地，步骤S4所述侵染为28℃，150r/min震荡侵染20min。

优选地，步骤S3含有乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基及步骤S4中含有乙酰丁香酮的MS固体培养基中乙酰丁香酮浓度为100～600μmol/L。

进一步优选地，所述乙酰丁香酮浓度为400～600μmol/L。

优选地，步骤S5所述含有头孢噻肟钠抗生素无菌水和含有头孢噻肟钠的MS固体培养中头孢噻肟钠浓度为200～300mg/L。

进一步优选地，所述头孢噻肟钠浓度为250mg/L。

优选地，步骤S5所述培养为于23～27℃，光照强度1500～2500lx，每天光照时间14～18h，培养3～5天。

进一步优选地，步骤S5所述培养为于温度25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h，培养3～5天。

优选地，步骤S6第一次转接的MS培养基中头孢噻肟钠的工作浓度为250mg/L，第二次转接的头孢噻肟钠工作浓度为100mg/L，最后将材料转接到不含Cef的MS固体培养基中。

优选地，所述目的基因为GFP。但不仅限于基因，可根据不同的研究需求，构建含有不同目的基因的表达载体，转入发根农杆菌C58C1感受态中制备转基因工程菌，再诱导表达目的基因的转基因毛状根。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了针对菊叶薯蓣转基因毛状根的诱导方法，以菊叶薯蓣去根组培苗作为外植体，发根农杆菌C58C1作为诱导菌株，在特定浓度的乙酰丁香酮条件下可高效诱导产毛状根，诱导率可达50％～85％，同时本发明可根据需求诱导产生含不同目的基因的转基因毛状根。本发明对菊叶薯蓣功能基因的鉴定、薯蓣皂苷合成等生物代谢途径的研究、分子育种、次生代谢物产业化生产等具有重要意义。

附图说明

图1为菊叶薯蓣转基因毛状根的诱导及培养。

图2为发根农杆菌C58C1+pCanG-eGFP转基因工程菌菌落PCR鉴定。M：DNA Marker；1～4：C58C1+pCanG-eGFP的4个拟转化子。

图3为菊叶薯转基因毛状根的PCR检测。1和2：野生型菊叶薯蓣组培苗的根部DNA；3：发根农杆菌C58C1的质粒DNA；4：转基因发根农杆菌C58C1+PcanG-GFP的质粒DNA；5和6：转基因发根农杆菌C58C1+PcanG-GFP诱导外植体产生的毛状根DNA。

图4为毛状根诱导的外植体优化结果。右边为叶片实验组的转接状态，左边为去根组培苗实验组的转接状态。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

发根农杆菌发根农杆菌C58C1、R1601、K599、A4均购自上海生物网瑞楚生物科技有限公司。

实施例1

(1)组培苗的培养

将生长约一个月的生根组培苗于超净工作台，用解剖刀将其根部去掉，去根后转接到MS+0.1mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA继代培养基上于25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h的组培房进行预培养约2周。生根组培苗材料见图1-a。

(2)转基因工程菌的准备

将两次活化后发根农杆菌C58C1按接种量1％进行扩大培养，将菌液培养至吸光度约为0.6，然后用20mmol/L CaCl₂制作感受态细胞，然后用冻融法将pCanG-GFP表达载体转化到该感受态细胞，于28℃，180r/min震荡培养3h以复苏菌种，离心富集菌体，并涂布于含有浓度为50mg/L利福平抗生素的YEB固体培养基上，待长出单菌落后，挑去单菌落培养，并进行拟转化子菌落PCR鉴定，获得阳性转基因工程菌C58C1+pCanG-GFP。拟转化子菌落PCR鉴定结果见图2。

(3)转基因侵染菌液的制备

将转基因工程菌菌液按接种量1％进行扩大培养，用紫外分光光度计检测菌液吸光度OD₆₀₀约为0.6，离心收集菌种，然后用含有浓度为200μmol/L乙酰丁香酮(AS)的1/2MS液体培养基重悬菌体，用紫外分光光度计检测重悬液吸光度OD₆₀₀在0.5～0.6为宜，转基因侵染液配制完成。

(4)侵染与共培养

将外植体于转基因侵染液中于28℃，150r/min震荡侵染约20分钟。待侵染完毕后，将外植体转移至滤纸上去除外植体表面的液体，然后将外植体转接至含有浓度为200μmol/L AS的MS固体培养基，置于25℃黑暗共培养2～3天。

(5)毛状根的诱导

将外植体从共培养的培养基中取出，置于含有浓度为250mg/L头孢噻肟钠(Cef)抗生素的无菌水中浸泡10分钟，然后用纯无菌水清洗3遍。待清洗完毕后将外植体转移至滤纸上去除外植体表面的水分，然后将外植体转接至含有浓度为250mg/L Cef的MS固体培养基，见图1-b。然后将外植体放置于培养条件为温度25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h的组培房培养，并观察发根情况。在转接培养3～5天内，部分外植体开始发根，见图1-c。

(6)毛状根的除菌培养

将外植体的茎、叶去掉，留下一小段约0.5cm长度的茎段，该茎段可能带一条或多条毛状根；将毛状根转接到MS固体培养基，第一次MS培养基中Cef的工作浓度为250mg/L，第二次转接的工作浓度为100mg/L，最后将材料转接到不含Cef的MS固体培养基中，见图1-d到图1-i。

(7)毛状根的液体扩大培养

将除菌培养后的毛状根从外植体分离成一条一条，然后接种到1/2MS液体培养基于25℃，150r/min震荡培养，见图1-j。

(8)毛状根的PCR检测

以菊叶薯蓣无菌组培苗的根部总DNA以及发根农杆菌C58C1的质粒DNA作为阴性对照，同法提取转基因发根农杆菌C58C1+pCanG-GFP的质粒DNA作为阳性对照，取2份已经过除菌培养的拟转基因毛状根作为实验组样品，利用CTAB法进行DNA提取，然后进行PCR鉴定，鉴定基因包括rol B、rol C以及GFP三个基因。rol B、rol C和GFP这三个基因的扩增引物分别为：

rol B-F-423bp：GCTCTTGCAGTGCTAGATTT，

rol B-R-423bp：GAAGGTGCAAGCTACCTCTC；

rol C-F-534bp：CTCCTGACATCAAACTCGTC，

rol C-R-534bp：TGCTTCGAGTTATGGGTACA；

pCanG-670-F：AGGTGGCTCCTACAAATGCC，

pCanG-670-R：AGACCGGCAACAGGATTCAA。

PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。经PCR检测，阳性对照转基因发根农杆菌C58C1+pCanG-GFP的质粒DNA以及转基因阳性毛状根均能检测到rol B、rol C和GFP这三个基因，阴性对照菊叶薯蓣无菌组培苗的根部总DNA无法检测到这三个基因，而阴性对照发根农杆菌C58C1的质粒DNA只能检测到rol B、rol C基因。检测结果见图3，图中“1”和“2”为菊叶薯蓣组培苗的根部DNA检测，对应的孔道无条带；“3”为发根农杆菌C58C1的质粒DNA检测，对应的孔道均有单一明显条带，条带大小均对应rol B和rol C基因片段的大小，表明阴性对照组正常，能起到对照作用。“4”为C58C1+pCanG-GFP转基因工程菌质粒DNA检测，经PCR克隆得到rol B、rolC和GFP这三个基因片段，表明阳性对照组正常，能起到对照作用。“5”和“6”为实验组，“5”对应的克隆结果无任何目标条带，而“6”对应的克隆结果出现了与rol B、rol C和GFP这三个基因片段大小相符的目标片段，表明“6”所对应的样品为阳性毛状根，菊叶薯蓣转基因毛状根诱导成功。而“5”所对应的样品为阴性，可能是由于除菌培养时间太长，毛状根能产生植物激素，从而诱发普通根生长，从而导致样品检测为阴性，实验样品为普通根。

实施例2

(1)组培苗的培养

将生长约一个月的生根组培苗于超净工作台，用解剖刀将其根部去掉，去根后转接到MS+0.1mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA继代培养基上于25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h的组培房进行预培养约2周。

(2)转基因侵染菌液的制备

将转基因工程菌C58C1+pCanG-GFP进行活化，然后按接种量1％进行扩大培养，用紫外分光光度计检测菌液吸光度OD₆₀₀约为0.6，离心收集菌种，然后用含有浓度为200μmol/L乙酰丁香酮(AS)的1/2MS液体培养基重悬菌体，用紫外分光光度计检测重悬液吸光度OD₆₀₀在0.5～0.6为宜，转基因侵染液配制完成。

(4)侵染与共培养

将外植体于转基因侵染液中于28℃，150r/min震荡侵染约20分钟。分批进行侵染，一共侵染了91个外植体。为了减少普通根发根对毛状根诱导统计的影响，设计一组对照组，该对照组用无菌种侵染液处理，其它处理条件均与实验组一致。然后将外植体转移至滤纸上去除外植体表面的液体，然后将外植体转接至含有浓度为200μmol/L AS的MS固体培养基，置于25℃黑暗共培养2～3天。

(5)毛状根的诱导

将外植体从共培养的培养基中取出，置于含有浓度为250mg/L头孢噻肟钠(Cef)抗生素的无菌水中浸泡10分钟，然后用纯无菌水清洗3遍。待清洗完毕后将外植体转移至滤纸上去除外植体表面的水分，然后将外植体转接至含有浓度为250mg/L Cef的MS固体培养基。然后将外植体放置于培养条件为温度25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h的组培房培养，并观察发根情况。在转接培养3～5天，实验组的部分外植体开始陆续发根。待培养到第3～4周，对照组开始发根，然后统计实验组的发根以及污染情况。在91个外植体中，其中有2个外植体存在污染现象，共有54个外植体发根，且发根长度在2.5～4.5cm不等。计算外植体的发根数或污染数在总样本中所占的比例，得到发根率为59.34％，污染率为2.20％

实施例3毛状根诱导的AS浓度优化

对用于菊叶薯蓣毛状根诱导的AS进行浓度优化，设计了0μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM这7个AS浓度梯度，以去根组培苗为外植体进行毛状根诱导。经侵染、黑暗共培养处理后，将外植体转接到250mg/L Cef-MS固体培养基进行培养，培养第1周内，观察各实验组的发根情况，除了AS浓度为0μM的实验组，其余6个实验组均开始发根。待培养第3周时，对各实验组进行发根数和污染数统计，并计算各实验组的发根率和污染率。结果如表1所示，只有AS浓度为0的实验组存在低污染现象，其余均没有。AS浓度为0的实验组的发根率明显比其它6个实验组的低，表明AS能有效促进发根农杆菌对外植体的侵染，提高外植体发根率；在其余6个实验组中，AS浓度为200μM、300μM和600μM的3个实验组的发根率类似，为50％；AS浓度为100μM的实验组的发根率比前面提及的3个实验组的稍高，为52.38％；AS浓度为400μM的实验组的发根率为61.71％，在所有实验组中为次高；而AS浓度为500μM的实验组的发根率最高，为85％。待培养1个月后，观察各实验组的发根生物量，AS浓度为400μM和500μM的实验组明显比其它实验组的大，且发根长度相对较长。根据上述实验结果表明，当AS浓度为400～500μM时，对菊叶薯蓣的去根组培苗进行毛状根诱导较为适宜，发根率高且生物量大。

表1毛状根诱导的AS浓度优化

实施例4毛状根诱导的外植体优化

(1)对用于菊叶薯蓣毛状根诱导的外植体进行优化，选取育龄为1～2个月的生根组培苗的叶片和去根组培苗(或带腋芽的茎段)作为外植体进行毛状根诱导，其中，AS的浓度均为200μM。在进行侵染时，先用无菌小刀在叶片上划切几刀以形成创伤口诱导发根；外植体转接到250mg/L Cef-MS固体培养基上时，不同外植体的状态如图4所示，右边为叶片实验组的转接状态，左边为去根组培苗实验组的转接状态。外植体经培养约1周，去根组培苗实验组开始发根；而叶片实验组的外植体保持绿色，创伤口未见褐化现象，但无发根。将各组材料继续进行培养，培养至约1个月，去根组培苗实验组发根越来越多；而叶片实验组无发根，且创伤口开始出现褐化现象，叶片开始变黄。待将材料培养至约2个月时，去根组培苗实验组发根不断伸长，且有很多侧根生成；而叶片实验组仍无发根，且叶片已明显褐化，部分还出现了霉菌污染的现象。根据上述实验结果表明，菊叶薯蓣的叶片不适宜用于毛状根诱导，而其去根组培苗或带腋芽的茎段均可以发根；其中，茎段较粗壮的外植体更利于诱导毛状根。

(2)同时，以菊叶薯蓣的愈伤组织为外植体，然后用发根农杆菌C58C1、R1601、K599、A4这四个菌种侵染所得的愈伤进行毛状根诱导，所得的诱导率均不高，均低于20％；而以菊叶薯蓣的去根组培苗作为外植体进行毛状根诱导，用C58C1+pCanG-eGFP工程菌进行毛状根诱导，所得诱导率为59.34％，约为愈伤诱导的3倍，明显提高了毛状根诱导率。

实施例5毛状根诱导的发根农杆菌菌株菌株优化

对用于菊叶薯蓣毛状根诱导的发根农杆菌菌株菌株进行优化，用发根农杆菌C58C1、R1601、K599、A4这四个菌种按照方法分别侵染菊叶薯蓣的愈伤组织和菊叶薯蓣根组培苗，其中发根农杆菌C58C1、R1601、K599、A4侵染菊叶薯蓣的愈伤组织的效果如实施例4中所述，诱导率均低于20％，且污染率高；而发根农杆菌C58C1、R1601、K599、A4侵染菊叶薯蓣根组培苗，不同菌株之间有显著差异，其中C58C1和A4菌株的诱导率均超过了42％，而R1601和K599菌株的诱导率均低于30％，但是同时A4菌株也存在着诱导污染率过高的问题，而C58C1菌株诱导污染率为零，因此综合看，发根农杆菌C58C1的毛状根诱导效果最好。