克氏综合征动物模型和其应用
阅读说明：本技术 克氏综合征动物模型和其应用 (Ke's syndrome animal model and application thereof ) 是由 李卫 刘超 陈子江 刘洪彬 王丽娜 于 2019-04-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了研究克氏综合征的动物模型,所述动物缺失Usp26。所述动物模型是可育的,其可产生XXY染色体组的后代。本发明还提供了所述动物模型在研究克氏综合征中的用途。本发明还提供了所述动物模型的产生方法,包括使得所述动物的内源性Usp26产生突变或缺失,例如通过CRISPR-Cas9系统进行基因编辑。(The invention provides an animal model for studying Klebsiella syndrome, which animal lacks Usp 26. The animal model is fertile, which can produce offspring of the XXY genome. The invention also provides the application of the animal model in the research of the Klebsiella syndrome. The invention also provides a method for producing the animal model, which comprises the step of mutating or deleting endogenous Usp26 of the animal, such as gene editing through a CRISPR-Cas9 system.)
技术领域
本发明涉及分子生物学和疾病研究动物模型领域。具体的，本发明涉及研究克氏综合征的可育的动物模型和其产生方法和用途。
背景技术
克氏综合征(Klinefelter's syndrome，KS)是严重影响生育后代能力的疾病。克氏综合征也被称为XXY、47XXY综合征，是以47XXY核型为特征的，雄性有两条或两条以上的X染色体所导致的疾病。克氏综合征患者不可避免地存在***症，在不育男性中克氏综合征患病率高达3 ％-4％，在无***症患者中高达10％-12％。KS的几种合并症也已有报道，包括代谢紊乱、某些心理社会问题以及对某些肿瘤的形成的易感性。由于克氏综合征患者的临床表现可能与正常男性相似，因此存在严重的诊断不足问题。
自从Harry Klinefelter于1942年首次描述克氏综合征以来，大量的研究试图揭示KS起源的致病机制。在克氏综合征中存在额外的X染色体，其可能是由于在母体卵子发生的减数***I或减数***II期间，或在父本***发生的减数***期间的染色体不分离造成的。母亲高龄是克氏综合征唯一的循证风险因素，这也是其他常染色体三体性的重要病因。但这种影响仅限于源自MI的一部分病例，而源于母亲MII的病例似乎与产妇年龄无关。已发现KS中的父系因子似乎有显着差异。另外，KS被认为不是遗传性的，而是在减数***期间随机发生的。到目前为止，尽管克氏综合征已被发现和研究超过70年，但是KS起源的分子机制从未真正阐明过。
由于克氏综合征起源的分子机制还未得到充分阐明，因此，可用于研究克氏综合征的起源的动物模型并不成熟，特别是缺乏关于可用于产生克氏综合征后代的动物模型。
因此，本领域还需要对克氏综合征的分子机制做更多的研究，以及需要新的研究克氏综合征的动物模型。
发明内容
本发明提供了一种研究克氏综合征的动物模型和其(包括其后代) 用于研究克氏综合征或后代患有克氏综合征风险的用途。具体的，本发明首次通过研究，确定USP26突变是克氏综合征其中一种发生的根源，并且根据其原理，提供了一种能够保持生育能力而又能产生克氏综合征后代的动物模型。
具体的，本发明提供了一种用于研究克氏综合征的转基因动物，其缺失Usp26。在本发明的其中一个方面，所述动物为雄性大鼠或小鼠。本发明还提供了所述转基因动物的组织或细胞。
USP26(ubiquitin specific peptidase 26)，即泛素特异肽酶26，是泛素特异性肽酶家族(ubiquitin-specific processing(UBP)family of proteases)的成员之一。通过辐射杂交分析，Wang等(Nature Genet.27: 422-426,2001)将人Usp26基因定位于X染色体(Gene ID:83844)。小鼠的Usp26基因也定位于X染色体(Gene ID:83563)。
本发明提供的上述转基因动物是可育的。尽管克氏综合征是严重影响生育后代能力的疾病，本发明提供的转基因动物本身是可育的，由此可稳定地传代。其产生的部分后代可具有XXY染色体组型，适于用于研究克氏综合征。
本发明还提供了产生上述转基因动物的方法，其中包括使得所述动物的内源性Usp26产生突变或缺失。在本发明的其中又一个方面，通过在所述动物的X染色体上的Usp26引入导致USP26蛋白不表达的突变。在本发明的其中又一个方面，通过使得所述动物的X染色体上的 Usp26缺失，
本领域已知各种改变哺乳动物基因的方法。其中包括改变哺乳动物基因组，并使得所述改变可以在所述动物后代传递的方法。例如可通过CRISPR-Cas9系统进行基因编辑。
本发明还提供了上述转基因动物用于研究克氏综合征的用途。本发明还提供了上述转基因动物的组织或细胞在用于研究克氏综合征中的用途。
在本发明的其中又一个方面，上述转基因动物用于研究克氏综合征的用途中包括用所述转基因啮齿类动物产生后代。所述后代包括具有XXY染色体组的后代。
在本文中，蛋白符号不用斜体，并全部大写；基因符号使用斜体。例如USP26为蛋白质，编码该蛋白质的基因写为Usp26。但有时在本文中基因符号也不使用斜体。例如有时本文中“USP26”或“USP26基因”表示编码USP26蛋白质的基因Usp26。
附图说明
图1显示Usp26缺陷小鼠产生41XXY后代。
图1A显示Usp26-/Y睾丸中不存在USP26蛋白。在Usp26+/Y和 Usp26-/Y睾丸中进行USP26免疫印迹。组蛋白3用作上样对照。
图1B和图1C显示Usp26-/Y小鼠的生育能力随着年龄的增加而降低。在2个月大和6个月大的Usp26+/Y，Usp26-/Y小鼠中进行生育能力评估实验(图1B)，并观察它们的窝产仔数(图1C)。
图1D显示WT和Usp26突变等位基因。
图1E显示Usp26-/Y小鼠后代的基因分型。
图1F显示在2个月大和6个月大的Usp26+/Y，Usp26-/Y小鼠的后代中41XXY小鼠的比例。
图1G显示Usp26+/-/Y小鼠的睾丸小于对照组。
图1H显示Usp26+/Y和Usp26+/-/Y小鼠中睾丸重量/体重的比率。
图1I右图显示通过苏木精和伊红(H&E)染色对Usp26+/Y和 Usp26+/-/Y小鼠的曲细精管和尾部附睾进行组织学分析。左图显示在 Usp26+/-/Y小鼠中，尾部附睾中的***数量显着减少。
图2显示USP26参与性染色体配对。
图2A显示USP26主要在睾丸中表达。在心脏，肝脏，脾脏，肺，肾，肠，脑，卵巢和睾丸中进行USP26的免疫印迹。组蛋白3用作上样对照。
图2B显示USP26在减数***过程中的定位。在WT***细胞中进行SCP3(红色)，USP26(白色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图2C显示在Usp26-/Y***细胞中X和Y染色体未配对。在Usp26+/Y和Usp26-/Y***细胞中进行Chr X-FISH(绿色)，Chr Y-FISH(红色)和 SCP3(白色)的免疫荧光分析。箭头表示X染色体。
图2D显示未配对的Chr X和Chr Y的定量。
图2E显示在Usp26+/Y和Usp26-/Y***细胞中进行SCP3(绿色)，ATR (红色)和p-ATM(粉红色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色) 染色。箭头表示性染色体。
图3显示Usp26缺陷小鼠产生XY非整倍体***。
图3A和图3B显示在Usp26-/Y***细胞的中期I中观察到落后染色体。在Usp26+/Y和Usp26-/Y***细胞中进行微管蛋白(绿色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。箭头表示落后的染色体。
图3C显示在Usp26+/Y和Usp26-/Y小鼠中表现出落后染色体的中期I ***细胞的比例。
图3D显示Usp26缺陷型小鼠产生XY非整倍体***。在Usp26+/Y和Usp26-/Y***中进行Chr X(绿色)，Chr Y(红色)的FISH测定。细胞核用DAPI(蓝色)染色。箭头表示Y染色体，箭嘴表示X染色体。
图3E显示在2个月和6个月大的Usp26+/Y和Usp26-/Y小鼠中不同类型的***的定量。
图4显示在MI期的不分离导致性染色体非整倍体***。
图5显示Usp26的破坏对雌性小鼠的卵泡发育和染色体分离没有影响。
图5A显示Usp26+/+和Usp26-/-小鼠中卵巢的苏木精和伊红(H&E) 染色。
图5B显示在Usp26+/+和Usp26-/-***中进行Tub(绿色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图6显示Usp26的缺陷导致粗线期和减数***停滞。
Usp26+/Y和Usp26-/Y睾丸中产生的代表性的TUNEL。用TUNEL(绿色)和DAPI(蓝色)染色来自Usp26+/Y和Usp26-/Y睾丸的Paraffin切片，以显示分别具有粗线期和中期***细胞的IV期和XII期小管中的死亡细胞。箭嘴表示落后的染色体。
图7显示未配对的性染色体也可以在其他类型的Usp26缺陷小鼠中检测到。
图7A显示X和Y染色体在两种类型的Usp26缺陷小鼠***细胞中未配对。在WT和Usp26缺陷***细胞中进行SCP3(绿色)，γH2AX (红色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图7B显示在WT和Usp26缺陷***细胞中进行SCP3(绿色)，TRF1 (红色)和ATR(白色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1实验方法和材料
抗体
小鼠抗γH2AX抗体(05-636)购自Merck Millipore(Darmstadt， Germany)。兔抗USP26抗体(A7999)购自Abclonal(武汉，中国)。兔抗SYCP1抗体(NB300-228c)购自NovusBiologicals(Littleton，CO)。小鼠抗TRF1抗体(ab10579)和兔抗SCP3(ab150292)购自Abcam (Cambridge,MA)。小鼠抗SYCP3抗体(SC-74569)，山羊抗ATR抗体 (SC-1187)购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas，TX)。抗组蛋白3 抗体(17168-1-AP)购自ProteintechGroup(Rosemont，IL)。抗-FLAG 抗体(M20008)，抗泛肌动蛋白抗体(M20010L)购自Abmart(中国上海)。山羊抗兔FITC(ZF-0311)，山羊抗小鼠FITC(ZF-0312)和山羊抗小鼠TRITC(ZF-0313)的缀合二抗购自中杉金桥(中国北京)。用于免疫印迹的Alexa Fluor 680-缀合的山羊抗小鼠抗体(A21057)和Alexa Fluor 680-缀合的山羊抗兔抗体(A21109)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
评估Usp26缺陷小鼠的生育能力
将每只雄性小鼠与2只野生型CD1雌性(7或8周)一起笼养，并且每天早晨检查它们的***栓。将发生堵塞的雌性分开并单独笼养，记录妊娠结果。如果雌性在第22天后没有产生任何幼崽，则认为小鼠未怀孕并安乐死以确认结果。每只雄性进行6-10个循环的上述育种试验。
附睾***计数
解剖尾部附睾。从尾部附睾中挤出***，并在37℃，5％CO2下孵育30分钟。然后将孵育的***的培养基以1：500稀释并转移至血细胞计数器中进行计数。
小鼠***制备和***FISH分析
从Usp26+/Y和Usp26-/Y小鼠分离附睾尾部，从附睾尾部释放***，并在5％CO2下于37℃温育30分钟。首先用PBS洗涤收集的***以消除杂质(300g，持续5分钟)，用Carnoy溶液(纯甲醇/冰醋酸＝3/1) 固定两次，然后铺在载玻片上进行***FISH。***头部用1N NaOH去除，通过乙醇系列(70％，85％，100％)脱水。将载玻片置于80℃加热器上以蒸发剩余的EtOH。用探针(Empire Genome，Chromosome X Green,Chromosome Y Red)在85℃变性10分钟后，在预热的加湿箱中于37℃杂交24小时。将切片依次在含有0.1％吐温的2X生理盐水柠檬酸钠(SSC)65℃下和2X SSC(两次)在室温下洗涤5分钟，然后用 DAPI染色。
统计分析
所有数据均以平均值±SEM表示。通过Student t检验以配对的双尾分布测量不同基因型的平均值之间差异的统计学显著性。当P值小于0.05(*)或0.01(**)时，数据被认为是显着的。
组织收集和组织学分析
每种基因型至少3只小鼠的睾丸在小鼠安乐死后立即解剖，用4％ (质量/体积)多聚甲醛(PFA；Solarbio，北京，中国，P1110)固定长达24小时，以70％(体积/体积)乙醇储存，并用石蜡封嵌。制备5 μm切片并将其安装在载玻片上。脱蜡后，将载玻片用H&E染色用于组织学分析。免疫荧光
***细胞在载玻片上铺展以进行免疫染色。吹气干燥后，用PBS洗涤载玻片3次，并用5％牛血清白蛋白(Amresco，Solon，OH，AP0027) 封闭。将第一抗体加入切片中并在4℃温育过夜，然后与第二抗体一起温育。用DAPI染色细胞核。使用LSM 780/710显微镜(Zeiss，Oberkochen， Germany)或SP8显微镜(Leica，Wetzlar，Germany)立即拍摄IF图像。
实施例2通过CRISPR-Cas9系统制备Usp26敲除小鼠
使用以下引物通过PCR扩增将T7启动子和引导序列添加至sgRNA：
Usp26-ugRNA1：AGTCCAGATGTGGAGTGCAAAGG；
Usp26-ugRNA2：TAAATGCTCAAGTCCAGATGTGG；
Usp26-ugRNA3：GTAAATCCCCCCGAGTACTCTGG；
Usp26-ugRNA4：TATCCATCCATCCGCAGTTGAGG；
Usp26-dgRNA5：GTAATTCTGGTCTTCGCCATAGG；
Usp26-dgRNA6：GGTCTTCGCCATAGGTTTGAAGG；
Usp26-dgRNA7：GCGGCCTAATCAGTACCATCAGG；
Usp26-dgRNA8：GACACCGTACTTGTATTAACTGG。
B6D2F1(C57BL/6×DBA2，RRID：IMSR_JAX：100006)雌性小鼠和 ICR雌性小鼠分别用作胚胎供体和***母鼠。超数***的雌性B6D2F1 小鼠(6-8周龄)与B6D2F1雄性种鼠交配，从输卵管收集受精胚胎。将Cas9mRNA(20ng)和sgRNA(10ng)注射到M2培养基(Sigma，M7167-50ml，Santa Clara，CA)中的具有明显原核的受精卵的细胞质中。注射的受精卵在37℃，5％CO2的空气下，在含有氨基酸的KSOM (modified simplex-optimized medium,Millipore)中培养，然后将15-25 个胚泡转移到假孕ICR雌鼠的子宫中。所有动物实验均根据中国科学院动物研究所的动物护理和使用委员会(institutional animal care anduse committee，IACUC)方法(#08-133)进行。
实施例3 Usp26敲除小鼠的敲除效率
USP26蛋白在Usp26-/Y睾丸中完全没有(图1A)，表明得到的敲除小鼠是Usp26-null。缺乏Usp26的小鼠是存活的，并且到达成年期，没有任何可观察到的缺陷。
实施例4 Usp26缺陷小鼠产生41XXY后代
对Usp26-/-雌性小鼠进行观察和检测。发现Usp26-/-雌性小鼠是可育的，并且在减数***期间显示正常的卵泡发育和染色体分离(图5)。
对Usp26缺陷雄性小鼠的繁殖力进行评估。发现随着年龄的增长，与对照组相比，Usp26-/Y小鼠的妊娠率和产仔数均显着降低(图1B和 1C)。没有从2个月大的Usp26-/Y小鼠繁殖得到任何XXY F2小鼠，但确实从6个月大的Usp26-/Y小鼠繁殖得到了KS小鼠(图1D-F)，因为在超过20％的雄性后代中可以检测到WT等位基因和Usp26敲除等位基因(图1D-F)：Usp26位于X染色体上，所以Usp26“加/减”雄性小鼠应该含有两条X染色体。
由于大多数克氏综合征患者和已报道的XXY小鼠模型显示无***症，因此在本实验分析了Usp26+/-/Y小鼠的***发生。结果发现睾丸大小和重量显着降低(图1G和1H)，并且通过苏木精和曙红(H&E) 染色的组织学检查显示Usp26+/-/Y睾丸缺乏减数***后细胞(图1I)。在附睾尾部只检测到很少的***，并且在Usp26+/-/Y小鼠中***的总数显着减少(图1I)，这与KS患者的现象相似。
因此，在较老的Usp26-null雄性小鼠中产生41XXY后代的机会更大。
实施例5 USP26参与性染色体配对
为了研究USP26的生理功能，检测了它的表达，发现USP26主要在睾丸中表达，但不在任何其他组织或器官中表达(图2A)。
然后，通过扩散核的免疫染色表征USP26在***发生过程中的精确定位，发现USP26与早期粗线期阶段的联会染色体轴一起出现，并且在后期粗线期和双线期阶段主要定位于XY体区域(图2B)，表明USP26 可能参与重组和联会，但主要作用于性染色体。
发明人发现在Usp26缺陷的***细胞中有大约40％未配对的性染色体(图2C和2D)。在其他类型的Usp26缺失小鼠中也可以检测到未配对的性染色体(图7)，表明所有Usp26缺失的雄性小鼠的表型都是由同样的原因引起的。
实施例6 Usp26缺陷型小鼠中未配对的性染色体导致XY非整倍体***
由于染色体配对和联会对减数***中期的正确同源性排列至关重要，因此减数***重组和染色体联会的错误会增加细胞携带单价染色体进入中期的可能性。Usp26缺陷的***细胞中的未交叉(achiasmate) 性染色体可能导致中期I的分离错误(mis-segregation)。发明人确实观察到具有落后染色体的Usp26-/Y纺锤体的比例显着增加(图3A-C)，表明Usp26的缺失导致了未交叉性染色体并导致中期I的染色体单价。非交换染色体通常由纺锤体装配检查点(spindle assembly checkpoint， SAC)监测并导致细胞死亡，而在一些具有落后染色体的Usp26缺陷的中期I***细胞的TUNEL信号为阴性(图6)，表明这些具有分离错误的性染色体Usp26-/Y***细胞可以逃避纺锤体装配检查点监测。
然后还检查了***中的X和Y染色体，发现与对照组相比，在6 个月大的Usp26-/Y小鼠中可以检测到更高比例的XY非整倍体***(图 3D和3E)，而在2个月大的对照小鼠和Usp26-/Y小鼠中几乎没有XY非整倍体***(图3E)，以及在所有这些小鼠中都没有发现XX和YY***，这表明Usp26的破坏只影响减数***I但不影响减数***II(图4)。
因此，Usp26的破坏扰乱了性染色体重组和配对，导致它们在中期 I的分离错误，并最终导致XY非整倍体***，造成41XXY后代的产生。
本发明在哺乳动物中首次发现USP26突变是KS起源的重要因素。 USP26主要定位于XY体区域，它的破坏会导致性染色体配对异常(图 2C-E)。减数***重组和染色体联会的错误增加细胞以单价染色体形式进入中期的可能性。理论上，如果性染色体在减数***I中随机分离，则分别有25％的X，Y，XY和O***。如果性染色体在减数***II中随机分离，则分别有25％X，25％Y，12.5％XX，12.5％YY和25％O ***。本专利的发明人首次研究和发现从6个月大的Usp26敲除雄性小鼠产生约10％的XY***，而不是XX或YY***(图3D和3E)。最重要的是，本专利的发明人从6个月的Usp26敲除雄性小鼠中获得了一些XXY小鼠(图1F)。这些结果表明，一旦Usp26被敲除，性染色体就不能有效配对和联会，导致性染色体在减数***I中随机分离，产生XY非整倍体***，最终导致XXY小鼠的产生。USP26的缺乏并不能绝对导致其后代产生XXY小鼠(图1F)，但是通过非经典的孟德尔遗传模式大大增加了KS后代产生的频率。
本专利的发明人还发现2个月大的Usp26缺陷雄性小鼠是可育的，但随着鼠龄的增加，怀孕率和产仔数均减少(图1B和1C)，表明Usp26 缺陷型雄性小鼠的生育能力与年龄高度相关。同时，本专利的发明人还发现除了生育能力之外，41XXY后代的比例也与Usp26缺陷雄性小鼠的年龄有关，因为41XXY后代的产生仅来自6个月大的Usp26缺陷型雄性小鼠，而2个月大的Usp26缺陷型雄性小鼠则没有。
因此，本发明通过首次发现USP26突变是哺乳动物克氏综合征父系起源的重要因素以及其作用机制，提供了一种能够保持生育能力而又能产生克氏综合征后代的动物模型，并提供了该动物模型在研究克氏综合征中的用途。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。