一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用 (HTLV-1 Env mediated cell-cell fusion model, preparation method and application ) 是由 段良伟 王辉 郑倩倩 张赟 牛玉娜 张阳 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学技术领域,尤其涉及一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用。本申请中获得HTLV-1 Env基因片段,并替换载体pSRHS-Tat-Env<Sub>HIV-1</Sub>的HIV-1 Env基因中对应的gp145片段,转染效应细胞COS-1,并与基因组中整合有LTR及其下游串联着的萤火虫荧光素酶报告基因的TZM-bl细胞共培养；通过检测萤火虫荧光素酶的活性间接检测HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合能力。利用抑制多肽P-400的对该融合系统进行验证,表明该系统非常适用于针对HTLV-1病毒进入抑制剂的筛选和验证,以及对进入抑制剂有效浓度和毒性等指标进行评估。(The invention belongs to the technical field of biomedicine, and particularly relates to an HTLV-1 Env mediated cell-cell fusion model, a preparation method and application. In the application, an HTLV-1 Env gene fragment is obtained and replaces a vector pSRHS-Tat-Env HIV‑1 Transfecting an effector cell COS-1 with a gp145 fragment corresponding to the HIV-1 Env gene, and co-culturing with TZM-bl cells integrated with LTR and a firefly luciferase reporter gene connected downstream of the LTR in series in the genome; HTLV-1 Env-mediated cell-cell fusion capacity was indirectly measured by measuring the activity of firefly luciferase.The fusion system is verified by utilizing the inhibitory polypeptide P-400, which shows that the fusion system is very suitable for screening and verifying the entry inhibitor of the HTLV-1 virus and evaluating the indexes such as effective concentration, toxicity and the like of the entry inhibitor.)
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用。
背景技术
人类T淋巴细胞白血病1型病毒(HTLV-1)，最先由美国国立癌症研究所的罗伯特·盖洛研究组于1980年报道发现，为首个证明与人类癌症直接相关的逆转录病毒。目前全球范围内的感染者超千万，其感染可诱发成人T细胞白血病(ATL)和HTLV-1相关脊髓病变(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(也称为强直性下肢轻瘫，TSP)等多种疾病。尽管经过40年的研究，但至今仍没有针对HTLV-1感染的特效疗法和安全持久有效的疫苗制剂，HTLV-1感染仍是严重威胁人类健康的地方性流行病，并给全球社会经济发展造成很大压力。
进入抑制剂是一类重要的抗包膜病毒药物，它在病毒感染早期阶段阻断病毒复制的中心环节——入侵靶细胞，既能预防病毒感染，也能阻止病毒感染新的宿主细胞，降低血浆中的病毒载量，具有明显的优越性，越来越受到科研人员和药物研发人员的关注和重视，具有成为HTLV-1病毒感染有效疗法的潜力。新的强效进入抑制剂的筛选和鉴定对于人类的健康与社会的发展有着重要意义。
病毒是结构极其简单的微生物，无完整的代谢酶系统，需要借助宿主细胞合成自身物质，进而完成自身的生命周期。HTLV-1也是一种包膜病毒(又称囊膜病毒)，首先要通过膜融合入侵到宿主细胞内才能起始新的生命周期，因而是整个病毒复制周期的首要环节。包膜病毒一般通过两种方式进入宿主细胞。第一种方式，位于病毒表面的包膜糖蛋白与受体结合，诱导构象变化，导致病毒包膜和宿主细胞膜在细胞表面直接融合。第二种方式，病毒通过内吞途径入侵细胞，定位于胞内体，以pH和(或)蛋白酶依赖的方式触发包膜糖蛋白的构象变化，从而触发膜融合。
很久之前科研人员就发现，与人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)不同，游离的HTLV-1病毒粒子对CD4+T淋巴细胞的感染效率十分低下，这种情况适用于除树突细胞以外的大多数HTLV-1靶细胞类型。近期的研究发现，游离的HTLV-1病毒粒子可以高效地感染树突细胞。同时，被感染的树突细胞可以快速地、重复性地将HTLV-1转移给自体CD4+T细胞，造成CD4+T细胞的长期多产性感染，并导致T细胞的白介素-2非依赖性的转化。树突细胞作为重要的抗原呈递细胞，被认为是多种病原入侵后最先遭遇的细胞，因而很可能在HTLV-1的传播过程中起着关键作用。Alais等人通过精巧的实验证明了树突细胞比自体淋巴细胞对HTLV-1的感染更敏感，并可有效地将病毒传递给淋巴细胞。因而，树突细胞作为体内最先被HTLV-1感染的细胞，它很可能代表着一个真正的病毒库。
游离的HTLV-1病毒入侵树突细胞等靶细胞是由病毒包膜糖蛋白Envelope(Env)介导的。HTLV-1 Env属于I型跨膜蛋白，以488个氨基酸的前体蛋白形式于糙面内质网中合成、折叠并伴随着寡聚化和初始糖基化，随后被输送到高尔基体中，经furin样蛋白酶家族剪切形成成熟的表面糖蛋白gp46和跨膜糖蛋白gp21，酶切后gp46和gp21仍非共价地联系在一起形成异二聚体，最后形成由三个gp46分子和三个gp21分子构成的三聚体刺突。其中，gp46含有受体结合区域，决定病毒的嗜性，起始病毒的感染；gp21含有三聚化结构域，主导Env的三聚化，还含有膜融合结构域，介导病毒和细胞的膜融合过程，完成病毒入侵。与此相对应的是，位于靶细胞表面的Env三聚体可以介导靶细胞与受体表达细胞之间的融合，形成多胞体。此外，大量研究表明Env对HTLV-1病毒突触的形成十分重要，因此，Env在HTLV-1的细胞-细胞传播过程中同样起着十分重要的作用，并且与诱导合胞体形成的能力相关联。
HTLV-1 Env在病毒的复制周期、细胞嗜性和致病性中起着至关重要的作用，因而是最重要且最有希望的潜在疫苗组分和重要的抗病毒药物靶点。针对HTLV-1 Env的进入抑制剂能够抑制HTLV-1病毒进入靶细胞，进而在感染的最初环节抑制病毒的传播，因而是HTLV-1感染早期治疗和预防的最佳方式之一。高效准确的入侵抑制剂筛选模型是获得药物的必要保证，目前关于HIV-1的细胞-细胞融合模型有很多，对于HTLV-1来说，因其受到关注的程度远小于HIV-1，已有的HTLV-1包膜糖蛋白Env介导的细胞-细胞融合模型均没有HIV-1的高效、方便和快捷。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种重组HTLV-1 Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法，包括以下步骤：
将质粒pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07中HIV-1 Env中对应的gp145片段后面第一个氨基酸残基(G713，按照国际标准病毒株HXB2编码)突变成终止密码子，获得突变体；
用HTLV-1 Env全长片段替换所述突变体的HIV-1 Env基因的gp145片段，获得重组HTLV-1 Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1。
突变为终止密码子后，突变体表达的蛋白为gp145，序列见SEQ ID NO.1所示。之后，将突变体中表达gp145的片段去除，将表达HTLV-1 Env的片段与通过反向PCR去除gp145片段的线性化载体连接，替换HIV-1 Env基因的gp145部分。
进一步地，利用滚环PCR技术将所述G713氨基酸残基突变成终止密码子，所述滚环PCR技术涉及的点突变引物序列见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
进一步地，利用反向PCR技术获得去除gp145片段的线性化载体，所述反向PCR技术涉及的引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
进一步地，滚环PCR法点突变反应体系：
滚环PCR法点突变反应条件：
进一步地，所述HTLV-1 Env片段序列见SEQ ID NO.4所示。
进一步地，获得重组HTLV-1 Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1后转化至Top10感受态细胞中。
一种按照上述的重组HTLV-1 Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法构建的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1。
如上述的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1在HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合体系中的应用。
如上述的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1在针对HTLV-1病毒的进入抑制剂筛选和/或验证方面的应用。
一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合体系，包括：效应细胞COS-1，权利要求6所述的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1以及靶细胞TZM-bl。
如上述的HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合体系在针对HTLV-1病毒的进入抑制剂筛选和/或验证方面的应用。
本发明将已经广泛应用成熟的HIV-1的细胞-细胞融合模型运用到HTLV-1病毒上来。通过转染pSRHS-Tat-EnvHIV-1质粒共表达HIV-1包膜糖蛋白Env和反式调控蛋白Tat的细胞称为效应细胞(即本申请中的COS-1细胞)。选取HIV-1指示细胞系TZM-bl为靶细胞，实际上是HeLa的衍生细胞株，其细胞膜上稳定高表达CD4受体，以及CCR5和CXCR4辅受体，并且在基因组中整合有含有Tat响应元件的HIV-1长末端重复序列LTR，可启动其下游串联的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)报告基因的表达。当效应细胞和靶细胞发生融合后，效应细胞中的反式激活因子Tat能够激活靶细胞基因组中的LTR从而启动荧光素酶(Luc)的高效表达。因此检测到的荧光素酶的活性就能间接反映HIV-1 Env介导的细胞间融合水平。
鉴于HeLa细胞系本身就表达有HTLV-1病毒入侵所需的多个功能性受体，理论上存在将成熟的HIV-1细胞-细胞融合模型应用到HTLV-1病毒上来的可能性。但是HIV-1 Env的胞内区含有Tat蛋白的第二个密码子区(编码Tat的67-101片段)，被替换掉以后可能会影响Tat的功能。本申请中，首先通过滚环PCR方法将pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07质粒中HIV-1 Env的G713氨基酸残基(按照国际标准病毒株HXB2编码)突变为终止密码子，结果显示突变产生的HIV-1包膜糖蛋白gp145介导细胞-细胞融合的能力并未受到影响，甚至与全长蛋白相比还有轻微升高。这样本申请就可以创造性地用HTLV-1 Env将pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07质粒上的HIV-1 Env的gp145部分替换掉，在效应细胞中实现了具有较大毒性的HTLV-1包膜糖蛋白的表达，并且HIV-1Tat蛋白并未受到影响。相对于对照载体，目的质粒可获得较高水平的荧光素酶激活倍数，表明HTLV-1 Env成功介导了效应细胞和靶细胞之间的融合，且融合能力与HIV-1 Env的相差无几，具有原HIV-1细胞-细胞融合系统的快捷、简便、高效、灵敏度强和适用性好等各个优点。
本申请中进一步利用该模型对已报道的对应于HTLV-1 Env 400-429氨基酸的多肽P-400的抑制效果进行验证，在20μg/ml的浓度下，荧光素酶的活性降低了20多倍，抑制效果优于报道数据，特别适用于针对HTLV-1病毒的进入抑制剂的筛选和验证，以及对进入抑制剂有效浓度和毒性等指标的评估。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明首先通过滚环PCR方法将pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07质粒中HIV-1 Env的713位氨基酸(跨膜区后的第一个氨基酸)突变为终止密码子，产生的HIV-1包膜糖蛋白gp145形式介导细胞-细胞融合的能力完全不受影响，与全长蛋白相比甚至有所升高。接着利用聚合酶链式反应PCR技术，获得HTLV-1 Env基因片段，并用其将经典的包膜表达载体pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07的HIV-1 Env基因中对应的gp145片段替换掉，转染效应细胞COS-1，使其共表达HTLV-1包膜蛋白Env和反式调控蛋白Tat。选用TZM-bl为靶细胞，该细胞表达有HTLV-1的受体，其基因组中整合有HIV-1长末端重复序列LTR，控制着下游串联的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)报告基因的表达。因为效应细胞和靶细胞发生融合的水平与荧光素酶(Luc)的表达水平是正相关的，所以可通过检测Luc的活性来间接检测HTLV-1 Env介导的细胞融合能力，利用已报道的抑制多肽P-400的对该融合系统进行验证，得出的抑制效果高于20倍，优于已报道的数据。所以该细胞-细胞融合系统具有快捷、简便、高效、灵敏度强和适用性好等优点，非常适用于针对HTLV-1病毒的进入抑制剂的筛选，对其它系统筛选到的进入抑制剂进行验证，以及对进入抑制剂有效浓度和毒性等指标的评估。
附图说明
图1是HIV-1 Env提前终止形成的gp145介导的细胞-细胞融合情况；
图2是HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合系统的原理示意图；
图3是HTLV-1 Env介导的效应细胞中细胞和靶细胞的融合情况；
图4是进入抑制剂P-400基于HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合系统的抑制效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本发明披露了一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用，具体如下各实施例所示。
实施例1 pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07 HIV-1 Env的提前终止突变
HIV-1 Env的胞内区含有Tat蛋白的第二个密码子区(编码Tat的67-101片段)，为了验证HIV-1 Env的提前终止突变不会影响Tat蛋白的表达，本实施例在pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07中将HIV-1 Env中对应的gp145片段后面第一个氨基酸突变成终止密码子，该突变体表达的蛋白为胞内区提前终止突变体gp145，核苷酸序列如下，见SEQ ID NO.1。
人类免疫缺陷病毒中国重组流行株gp145(HIV-1CRF07 gp145)序列：
GAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATCCATTTCAGAATTGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGTTACTCGACAGAGGAGAGCAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATGACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATCAAAGCAGTAAGTAGTACATGTAATGCAACCTATAATAGTAGCAATAGTAGCATTAGTAGTAGCAATAATAATAGCAATAGTTGTGTGGTCCATAGTAATCATAGAATATAGGAAAATATTAAGACAAAGAAAAATAGACAGGTTAATTGATAGACTAATAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGAAGGAGAAGTATCAGCACTT
ATGGACAGGGCCAAGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCCCCAGGCCCAGGCCGTGGGCAACCTGTGGGTGACCGTGTACTACGGCGTGCCCGTGTGGAAGGGCGCCACCACCACCCTGTTCTGCGCCAGCGACGCCAAGGCCTACGACACCGAGGTGCACAACGTGTGGGCCACCCACGCCTGCGTGCCCGCCGACCCCAACCCCCAGGAGATGGTGCTGGAGAACGTGACCGAGAACTTCAACATGTGGAAGAACGAGATGGTGAACCAGATGCAGGAGGACGTCATCAGCCTGTGGGACCAGAGCCTGAAGCCCTGCGTGAAGCTGACCCCCCTGTGCGTGACCCTGGAGTGCAGGAACGTGAGCAGCAACAGCAACGACACCTACCACGAGACCTACCACGAGAGCATGAAGGAGATGAAGAACTGCAGCTTCAACGCCACCACCGTGGTGAGGGACAGGAAGCAGACCGTGTACGCCCTGTTCTACAGGCTGGACATCGTGCCCCTGACCAAGAAGAACTACAGCGAGAACAGCAGCGAGTACTACAGGCTGATCAACTGCAACACCAGCGCCATCACCCAGGCCTGCCCCAAGGTGACCTTCGACCCCATCCCCATCCACTACTGCACCCCCGCCGGCTACGCCATCCTGAAGTGCAACGACAAGATCTTCAACGGCACCGGCCCCTGCCACAACGTGAGCACCGTGCAGTGCACCCACGGCATCAAGCCCGTGGTGAGCACCCAGCTGCTGCTGAACGGCAGCCTGGCCGAGGGCGAGATCATCATCAGGAGCGAGAACCTGACCAACAACGTGAAAACCATCATCGTGCACCTGAACCAGAGCGTGGAGATCGTGTGCACCAGGCCCGGCAACAACACCAGGAAGAGCATCAGGATCGGCCCCGGCCAGACCTTCTACGCCACCGGCGACATCATCGGCGACATCAGGCAGGCCCACTGCAACATCAGCGAGGACAAGTGGAACGAGACCCTGCAGAGGGTGAGCAAGAAGCTTGCCGAGCACTTCCAGAACAAGACCATCAAGTTCGCCAGCAGCAGCGGCGGCGACCTGGAGGTGACCACCCACAGCTTCAACTGCAGGGGCGAGTTCTTCTACTGCAACACCAGCGGCCTGTTCAACGGCGCCTACACCCCCAACGGCACCAAGAGCAACAGCAGCAGCATCATCACCATCCCCTGCAGGATCAAGCAGATCATCAACATGTGGCAGGAGGTGGGCAGGGCCATGTACGCCCCTCCCATCAAGGGCAACATCACCTGCAAGAGCAACATCACCGGCCTGCTGCTGGTGAGGGACGGCGGCACCGAGCCCAACGACACCGAGACCTTCAGGCCCGGCGGCGGCGACATGAGGAACAACTGGAGGAGCGAGCTGTACAAGTACAAGGTGGTGGAGATCAAGCCCCTGGGCGTGGCCCCCACCACCACCAAGAGGAGGGTGGTGGAGAGGGAGAAGAGGGCCGTGGGCATCGGCGCCGTGTTCCTGGGCTTCCTGGGCGTGGCCGGCAGCACCATGGGCGCCGCCAGCATCACCCTGACCGTGCAGGCCAGGCAGCTGCTGAGCGGCATCGTGCAGCAGCAGAGCAACCTGCTGAGGGCCATCGAGGCCCAGCAGCACCTGCTGCAGCTGACCGTGTGGGGCATCAAGCAGCTGCAGACCAGGGTGCTGGCCATCGAGAGGTACCTGAAGGACCAGCAGCTGCTGGGCATCTGGGGCTGCAGCGGCAAGCTGATCTGCACCACCGCCGTGCCCTGGAACAGCAGCTGGAGCAACAAGAGCCAGAAGGAGATCTGGGACAACATGACCTGGATGCAGTGGGACAAGGAGATCAGCAACTACACCAACACCGTGTACAGGCTGCTGGAGGAGAGCCAGAACCAGCAGGAGAGGAACGAGAAGGACCTGCTGGCCCTGGACAGCTGGAAGAACCTGTGGAGCTGGTTCGACATCACCAACTGGGTGTGGTACATCAAGATCTTCATCATCATCGTGGGCGGCCTGATCGGCCTGAGGATCATCTTCGCCGTGCTGAGCATCGTGAACAGGGTGAGGCAGGGCTACTGA(此处为新引入的终止密码子TGA)
CCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTAGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGATTGTAACGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAGTATTGGAGTCAGGAACTAAAGAATAGTGCTGTTAACTTGCTCAATGCCACAGCCATAGCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGGGTTATAGAAGTATTACAAGCAGCTTATAGAGCTATTCGCCACATACCTAGAAGAATAAGACAGGGCTTGGAAAGGATTTTGCTATAAGATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGATTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGACGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGTATCTCGAG(第一段和第三段序列为载体上的序列，含有Tat蛋白编码区)。
利用滚环PCR技术，在PCR产物上产生碱基突变，PCR产物因为互补配对，转化到感受态细胞TOP10中之后，可以自发成环并可被感受态细胞中的酶修复缺口，产生突变后的质粒pSRHS-Tat-gp145CRF07。
以pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07为模板进行滚环PCR，滚环PCR条件如下，PCR结束后，取10μl滚环PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以与滚环PCR反应体系中模板等量的质粒作为阴性对照。若产物亮度明显强于模板，则为阳性产物，反之为阴性，需要重新进PCR反应。取8μl点突变PCR阳性产物于一个PCR管中，加入1μl 10×FastDigest Buffer和去甲基化酶DpnI处理消化掉甲基化的模板。在37℃条件下孵育消化3h后，取2μl消化产物转化质粒扩增型感受态细胞，提取质粒并进行测序验证。
其他实施例中也可以选择其他本领域现有方法实现定点突变，比如设计引物，进行PCR，扩增含有点突变的显性DNA片段，再进行连接。
滚环PCR法点突变反应体系：
滚环PCR法点突变反应条件：
点突变用到的引物为：
HIV-1 CRF07 gp145 SDM Forward，SEQ ID NO.2：CGTGAACAGGGTGAGGCAGGGCTACtGACCATTATCGTTTCAGACCCACCTC
HIV-1 CRF07 gp145 SDM Reverse，SEQ ID NO.3：GAGGTGGGTCTGAAACGATAATGGTCaGTAGCCCTGCCTCACCCTGTTCACG
实施例2 HIV-1 gp145介导的细胞-细胞融合实验
(1)第一天，铺1×105个效应细胞COS-1于12孔板中，培养24h。
(2)第二天，将野生型HIV-1 CRF07和突变型HIV-1 gp145的pSRHS-Tat-gp145CRF07表达质粒以及对照质粒转染效应细胞COS-1。
(3)第三天，待转染后的效应细胞培养24h后，将3×105个靶细胞TZM-bl加到每孔中与效应细胞共培养24h。
(4)第四天，进行萤火虫荧光素酶活性测定。
萤火虫荧光素酶活性测定(Luciferase assay)方法如下：
1)除尽12孔板中的培养基，用1×PBS清洗2-3次，加入150μl提前稀释好的1×细胞裂解液；
2)振荡摇床上室温裂解15min，期间用手轻拍2-3次，充***解细胞；
3)吸取裂解液于1.5ml管中，12,000rpm室温离心3min；
4)取5μl上清点样于96孔化学发光检测板，用化学发光检测仪测定荧光强度。
结果见图1，HIV-1 Env提前终止形成的gp145介导细胞-细胞融合的能力并未受到影响，与全长Env蛋白相比还有升高。这为后续用HTLV-1 Env替换HIV-1的gp145，以及HTLV-1介导的效应细胞和靶细胞的融合系统(见图2)的建立提供了理论支撑。
实施例3重组HTLV-1 Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建
以金唯智生物科技有限公司全基因合成的按照人的密码子偏爱性优化的HTLV-1ATK-1 Env为模板，核苷酸序列见SEQ ID NO.4，利用PCR技术，获得了HTLV-1 ATK-1 Env全长的DNA片段，将目的基因片段连接到用反向PCR方式获得的线性化pSRHS-Tat-EnvCRF07δgp145载体片段(DNA无缝克隆技术中的常用方式，HIV-1 CRF07 Env基因中的gp145片段在线性化过程中被去除)，需要指出的是无缝克隆技术中的反向PCR技术跟普通PCR技术本质上是一样的，区别仅仅在于引物设计不同，所获PCR产物均为DNA片段，所以在下面本申请并不做区分。经过菌液PCR鉴定和测序验证目的基因片段的准确性之后，通过无内毒素质粒大提试剂盒对两个目的质粒进行大量抽提以提高目的质粒的浓度和去除内毒素对转染的影响。
载体构建过程中用到的引物为(依次见SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8)：
HTLV-1 Env Forward:GAGCAGAAGACAGTGGCA ATGGGTAAGTTTCTCGCCAC
HTLV-1 Env Reverse:GGTCTGAAACGATAATGG TCAGAGGCTGCTTTCGGGCTTG
pSRHS Forward:CCATTATCGTTTCAGACC CACCTCCCAATCCCGA
pSRHS Reverse:TGCCACTGTCTTCTGCTC TTTCTATTAGTCTATC
为了得到目的片段和线性化载体需要进行PCR反应，体系如下:
反应程序如下：
PCR反应结束后，用琼脂糖核酸凝胶电泳对PCR产物进行鉴定、回收并定量。利用重组克隆试剂盒，进行重组，反应体系如下：
将10.0μl重组产物转化Top10感受态，利用菌液方法对阳性克隆进行鉴定，进一步利用DNA测序验证目的基因片段的准确性，通过无内毒素质粒大提试剂盒对构建正确用法的质粒进行大量抽提以提高目的质粒的浓度和去除内毒素对转染的影响。
实施例4 HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合实验和萤火虫荧光素酶活性测定(Luciferase assay)
将实施例2的(2)中替换为：第二天，将实施例3中获得的重组HTLV-1 Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1以及作为正对照的表达HIV-1 gp145的pSRHS-Tat-gp145CRF07质粒和负对照质粒转染效应细胞COS-1。其余步骤均相同。
结果见图3，根据萤火虫荧光酶素的测定结果，HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合能力比较强，仅仅略微低于HIV-1 Env的结果。
实施例5本发明制备的融合系统在抑制剂筛选方面的应用验证
利用已报道的抑制多肽P-400对本发明制备的融合系统进行验证。
(1)第一天，铺1×105个效应细胞COS-1于12孔板中，培养24h。
(2)第二天，将pSRHS-Tat-EnvHTLV-1和pSRHS-Tat-gp145CRF07及对照质粒转染效应细胞COS-1。
(3)第三天，待转染后的效应细胞培养24h后，加入终浓度为20μg/ml的P-400抑制肽或对照肽，对照组只加入DMSO，将3×105个靶细胞TZM-bl加到每孔中与效应细胞共培养24h。
(4)第四天，进行萤火虫荧光素酶活性测定，方法同实施例2。
所用合成肽的序列为：
P-400：CRFPNITNSH VPILQERPPL ENRVLTGWGL，SEQ ID NO.9；
对照肽：LAGPCILRQL RHLPSRVRYP HYSLIKPESS，SEQ ID NO.10。
结果见图4，已知HTLV-1的融合抑制剂P-400可以特异、高效地抑制HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合。实验结果显示，本发明制备的融合系统应用在该实验中，抑制倍数高达20多倍，展现出高度的灵敏性，说明本发明制备的融合系统可以很好地用于HTLV-1病毒进入抑制剂的筛选等工作。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 新乡医学院
<120> pSRHS-Tat-EnvHTLV-1质粒、构建方法、细胞-细胞融合体系及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3149
<212> DNA
<213> gp145
<400> 1
gaattctgca acaactgctg tttatccatt tcagaattgg gtgtcgacat agcagaatag 60
gcgttactcg acagaggaga gcaagaaatg gagccagtag atcctagact agagccctgg 120
aagcatccag gaagtcagcc taaaactgct tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc 180
tttcattgcc aagtttgttt catgacaaaa gccttaggca tctcctatgg caggaagaag 240
cggagacagc gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc atcaagcttc tctatcaaag 300
cagtaagtag tacatgtaat gcaacctata atagtagcaa tagtagcatt agtagtagca 360
ataataatag caatagttgt gtggtccata gtaatcatag aatataggaa aatattaaga 420
caaagaaaaa tagacaggtt aattgataga ctaatagaaa gagcagaaga cagtggcaat 480
gagagtgaag gagaagtatc agcacttatg gacagggcca agctgctgct gctgctgctg 540
ctgctgctgc tgccccaggc ccaggccgtg ggcaacctgt gggtgaccgt gtactacggc 600
gtgcccgtgt ggaagggcgc caccaccacc ctgttctgcg ccagcgacgc caaggcctac 660
gacaccgagg tgcacaacgt gtgggccacc cacgcctgcg tgcccgccga ccccaacccc 720
caggagatgg tgctggagaa cgtgaccgag aacttcaaca tgtggaagaa cgagatggtg 780
aaccagatgc aggaggacgt catcagcctg tgggaccaga gcctgaagcc ctgcgtgaag 840
ctgacccccc tgtgcgtgac cctggagtgc aggaacgtga gcagcaacag caacgacacc 900
taccacgaga cctaccacga gagcatgaag gagatgaaga actgcagctt caacgccacc 960
accgtggtga gggacaggaa gcagaccgtg tacgccctgt tctacaggct ggacatcgtg 1020
cccctgacca agaagaacta cagcgagaac agcagcgagt actacaggct gatcaactgc 1080
aacaccagcg ccatcaccca ggcctgcccc aaggtgacct tcgaccccat ccccatccac 1140
tactgcaccc ccgccggcta cgccatcctg aagtgcaacg acaagatctt caacggcacc 1200
ggcccctgcc acaacgtgag caccgtgcag tgcacccacg gcatcaagcc cgtggtgagc 1260
acccagctgc tgctgaacgg cagcctggcc gagggcgaga tcatcatcag gagcgagaac 1320
ctgaccaaca acgtgaaaac catcatcgtg cacctgaacc agagcgtgga gatcgtgtgc 1380
accaggcccg gcaacaacac caggaagagc atcaggatcg gccccggcca gaccttctac 1440
gccaccggcg acatcatcgg cgacatcagg caggcccact gcaacatcag cgaggacaag 1500
tggaacgaga ccctgcagag ggtgagcaag aagcttgccg agcacttcca gaacaagacc 1560
atcaagttcg ccagcagcag cggcggcgac ctggaggtga ccacccacag cttcaactgc 1620
aggggcgagt tcttctactg caacaccagc ggcctgttca acggcgccta cacccccaac 1680
ggcaccaaga gcaacagcag cagcatcatc accatcccct gcaggatcaa gcagatcatc 1740
aacatgtggc aggaggtggg cagggccatg tacgcccctc ccatcaaggg caacatcacc 1800
tgcaagagca acatcaccgg cctgctgctg gtgagggacg gcggcaccga gcccaacgac 1860
accgagacct tcaggcccgg cggcggcgac atgaggaaca actggaggag cgagctgtac 1920
aagtacaagg tggtggagat caagcccctg ggcgtggccc ccaccaccac caagaggagg 1980
gtggtggaga gggagaagag ggccgtgggc atcggcgccg tgttcctggg cttcctgggc 2040
gtggccggca gcaccatggg cgccgccagc atcaccctga ccgtgcaggc caggcagctg 2100
ctgagcggca tcgtgcagca gcagagcaac ctgctgaggg ccatcgaggc ccagcagcac 2160
ctgctgcagc tgaccgtgtg gggcatcaag cagctgcaga ccagggtgct ggccatcgag 2220
aggtacctga aggaccagca gctgctgggc atctggggct gcagcggcaa gctgatctgc 2280
accaccgccg tgccctggaa cagcagctgg agcaacaaga gccagaagga gatctgggac 2340
aacatgacct ggatgcagtg ggacaaggag atcagcaact acaccaacac cgtgtacagg 2400
ctgctggagg agagccagaa ccagcaggag aggaacgaga aggacctgct ggccctggac 2460
agctggaaga acctgtggag ctggttcgac atcaccaact gggtgtggta catcaagatc 2520
ttcatcatca tcgtgggcgg cctgatcggc ctgaggatca tcttcgccgt gctgagcatc 2580
gtgaacaggg tgaggcaggg ctactgatga ccattatcgt ttcagaccca cctcccaatc 2640
ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag gtggagagag agacagagac 2700
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tgcctcttca gctaccaccg cttgagagac ttactcttga ttgtaacgag gattgtggaa 2820
cttctgggac gcagggggtg ggaagccctc aaatattggt ggaatctcct acagtattgg 2880
agtcaggaac taaagaatag tgctgttaac ttgctcaatg ccacagccat agcagtagct 2940
gaggggacag atagggttat agaagtatta caagcagctt atagagctat tcgccacata 3000
cctagaagaa taagacaggg cttggaaagg attttgctat aagatgggtg gcaagtggtc 3060
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agcagatggg gtgggagcag tatctcgag 3149
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtgaacagg gtgaggcagg gctactgacc attatcgttt cagacccacc tc 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<212> DNA
<213> ATK-1
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tactccccta acgtgagcgt cccttccagc tcctccaccc ctttactgta tccctcttta 780
gctctccccg ctcctcattt aacactcccc ttcaactgga cccactgctt tgacccccag 840
attcaagcta ttgtgtcctc tccttgtcac aactccctca ttttaccccc cttctcttta 900
agccccgttc ctactttagg ctcccgttct cgtagggccg tgcccgttgc cgtgtggctg 960
gtgagcgctc tggctatggg cgctggagtg gccggaggaa tcactggttc tatgtcttta 1020
gccagcggca aatctttact gcacgaggtg gacaaggata tcagccagct gacccaagct 1080
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cgtttcccca acatcaccaa cagccacgtg cccatcctcc aagaaagacc tcctttagaa 1260
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<212> PRT
<213> control petide
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