通过性状堆叠提高作物产量的组合物和方法
阅读说明：本技术 通过性状堆叠提高作物产量的组合物和方法 (Compositions and methods for increasing crop yield through trait stacking ) 是由 L·阿尔维斯-朱尼尔 W·B·布鲁斯 J·齐托尔 C·R·迪特里希 N·伊夫勒瓦 李宏 于 2019-02-15 设计创作，主要内容包括：本公开提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物,所述玉米植物相对于对照植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状,例如穗直径、穗鲜重、和单粒重和产量的增加。所述经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物包含编码一种或多种钼辅因子(Moco)生物合成多肽的转基因,并且具有一种或多种GA20或GA3氧化酶基因的表达降低。还提供了用于产生所述经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的方法。(The present disclosure provides modified, transgenic, or genome-edited/mutant maize plants that are semi-dwarf and have one or more improved ear traits, such as ear diameter, fresh ear weight, and increased grain weight and yield, relative to control plants. The modified, transgenic, or genome edited/mutant maize plant comprises a transgene encoding one or more molybdenum cofactor (Moco) biosynthetic polypeptides and has reduced expression of one or more GA20 or GA3 oxidase genes. Also provided are methods for producing the modified, transgenic, or genome editing/mutation maize plants.)
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年2月15日提交的美国临时申请第62/631,321号的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
序列表的并入
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技术领域
本公开涉及经修饰的、转基因的和/或基因组编辑的或突变的玉米植物，所述玉米植物相对于对照植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状，以及通过堆叠产生转基因的和/或基因组编辑的或突变的玉米植物的方法。
背景技术
由于改善的农艺实践和性状，谷类作物产量在过去几十年中一直稳定增长。然而，本领域中仍然需要通过固有的产量增加和/或由于改善的抗倒伏性、胁迫耐受性和其它性状而减少的产量损失来提高玉米产量。
附图说明
图1示出两个转化事件中包含编码用于抑制GA20氧化酶的miRNA的DNA序列的玉米植物(“GA20Ox_SUP单株”)相对于对照玉米植物的植株高度。
图2示出包含编码用于抑制GA20氧化酶基因的miRNA的DNA序列和编码大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(大肠杆菌(E.coli))MoaD多肽的转基因的堆叠转基因玉米植物(“GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株”)以及GA20Ox_SUP单株玉米植物和MoaD单株玉米植物的植株高度，每一者都相对于对照玉米植物。
图3示出在限氮条件下包含编码大肠杆菌MoaD多肽的转基因的转基因玉米植物(“MoaD单株”)相对于对照玉米植物的穗部性状。
图4示出在田间的标准农艺条件下三个转基因事件中的包含编码大肠杆菌MoaD多肽的转基因的玉米植物相对于对照玉米植物的产量。
图5示出在田间的标准农艺条件下四个转化事件中的GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株玉米植物、两个转化事件中的GA20Ox_SUP单株玉米植物和两个转化事件中的MoaD单株玉米植物相对于对照玉米植物的穗部性状，包括穗鲜重、穗直径和单粒重。
图6示出在田间的标准农艺条件下GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株玉米植物和GA20Ox_SUP单株玉米植物相对于对照玉米植物的产量。
图7示出GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株玉米植物、GA20Ox_SUP单株玉米植物和MoaD单株玉米植物相对于对照玉米植物的谷粒产量估计值。
图8示出GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株玉米植物、GA20Ox_SUP单株玉米植物和MoaD单株玉米植物相对于对照玉米植物的穗体积、穗直径、穗长、穗尖空隙、每穗粒数和单粒重。
图9示出五个转化事件中的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠玉米植物相对于对照玉米植物的广亩产量。
图10示出由三种不同载体制得的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠玉米植物相对于GA20Ox_SUP单株玉米植物的穗鲜重。
图11示出五个转化事件中的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠玉米植物和四个转化事件中的GA20Ox_SUP单株玉米植物在R2或V12发育阶段相对于对照玉米植物的叶片氮百分比。
发明内容
本说明书提供了一种经修饰的玉米植物或其植物部分，所述经修饰的玉米植物或其植物部分包含：1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种赤霉酸20(GA20)氧化酶基因和/或一种或多种赤霉酸3(GA3)氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码钼辅因子(Moco)生物合成多肽的DNA序列。
本说明书还提供了田间的多个经修饰的玉米植物，每个经修饰的玉米植物包含：1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种赤霉酸20(GA20)氧化酶基因和/或一种或多种赤霉酸3(GA3)氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列。
本说明书还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述玉米细胞包含第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列；以及b)从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
本说明书还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，其中所述玉米细胞包含第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及b)从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
在一个方面，本说明书提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)向玉米细胞中引入1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及b)从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
在另一方面，本说明书提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列；b)向步骤(a)的所述玉米细胞中引入第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，以产生经修饰的玉米细胞；以及c)从步骤(b)的所述经修饰的玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
在另一方面，本说明书提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；b)向步骤(a)的所述玉米细胞中引入第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，以产生经修饰的玉米细胞；以及c)从步骤(b)的所述经修饰的玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
在另一方面，本说明书提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)使第一经修饰的玉米植物与第二经修饰的玉米植物杂交，其中一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因在所述第一经修饰的玉米植物中的表达或活性相对于野生型对照有所降低，并且其中所述第二经修饰的玉米植物包含重组表达盒，所述重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及b)产生包含所述重组表达盒并且具有所述一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的表达降低的后代玉米植物。
本说明书提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)向玉米细胞中引入包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中所述玉米细胞在一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因中包含一个或多个突变和/或编辑；以及b)从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述重组表达盒和所述一个或多个突变和/或编辑，并且其中所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因在所述经修饰的玉米植物中的表达或活性水平相对于不具有所述一个或多个突变和/或编辑的对照植物有所降低。
本说明书还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：a)在玉米细胞中突变或编辑一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因，其中所述玉米细胞包含编码Moco生物合成多肽的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接；以及b)从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述重组表达盒和所述一个或多个突变和/或编辑，并且其中所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因在所述经修饰的玉米植物中的表达或活性水平相对于不具有所述一个或多个突变和/或编辑的对照植物有所降低。
本说明书还提供了一种经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物包含：1)一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因处或附近的一个或多个突变或编辑，其中所述一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达或活性相对于野生型对照植物有所降低，和2)包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
本说明书进一步提供了田间的多个经修饰的玉米植物，每个经修饰的玉米植物包含：1)一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因处或附近的一个或多个突变或编辑，其中所述一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达相对于野生型对照植物有所降低，和2)包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在一个方面，本说明书提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：1)第一表达盒，所述第一表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA20氧化酶或一种或多种GA3氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二表达盒，所述第二表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在另一方面，本说明书提供了一种用于将***序列定点整合到玉米植物基因组中的重组DNA供体模板分子，所述分子包含***序列和至少一个同源序列，其中所述同源序列与玉米植物细胞的基因组中的靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性，并且其中所述***序列包括包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在一个方面，本说明书提供了一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:170具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQID NO:170的序列；c)SEQ ID NO:170的功能部分，其中所述功能部分具有基因调控活性；和d)与c)中的所述功能部分具有至少85％序列同一性的序列；其中所述序列与异源可转录DNA序列可操作地连接。
具体实施方式
定义
除非本文另外定义，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。描述本文中使用的许多与分子生物学有关的术语的资源实例可见于Alberts等,Molecular Biology of The Cell,第5版,Garland Science Publishing,Inc.:New York,2007；Rieger等,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,第5版,Springer-Verlag:New York,1991；King等,A Dictionary of Genetics,第6版,Oxford UniversityPress:New York,2002；以及Lewin,Genes IX,Oxford University Press:New York,2007。
本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物，均通过引用整体并入。为了便于理解本公开，如本文所用的若干术语和缩写在下文定义如下：
当在两个或更多个项目的列表中使用时，术语“和/或”表示所列出的项目中的任何一个可以单独使用或与所列出的项目中的任何一个或多个结合使用。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B中的任一者或两者，即单独的A，单独的B或组合的A和B。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A，单独的B，单独的C，组合的A和B，组合的A和C，组合的B和C，或者组合的A、B和C。
如本文所用，术语“约”旨在限定其所修饰的数值，将这样的值表示为在误差容限内是可变的。当没有列出具体的误差容限，例如平均值的标准偏差时，术语“约”应理解为意指将涵盖所列出的值的范围和考虑到有效数字通过该数字的向上或向下舍入而将包括的范围。
如本文所用，“植物”包括处于再生或发育的任何阶段的外植体、植物部分、秧苗、幼苗或整株植物。如本文所用的术语“谷类植物”是指在禾草的禾本科(Poaceae)或早熟禾科(Gramineae)中并且通常收获其种子的单子叶的(单子叶)作物植物，包括例如小麦、玉米、水稻、粟米、大麦、高粱、燕麦和黑麦。如通常所理解的，“玉米植物”或“玉蜀黍植物”是指玉米(Zea mays)种的任何植物，并且包括可用玉米育种的所有植物品种，包括野生玉蜀黍种。
如本文所用，“植物部分”可以指植物的任何器官或完整组织，例如分生组织，枝条器官/结构(例如，叶、茎或结节)，根，花或花器官/结构(例如，苞片、花萼、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)，种子(例如胚、胚乳和种皮)，果实(例如成熟子房)，繁殖体或其它植物组织(例如维管组织、表皮组织、基本组织等)或其任何部分。本公开的植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。“繁殖体”可包括能够生长成整株植物的任何植物部分。
如本文所用，“转基因植物”是指已通过整合或***重组DNA分子、构建体、盒或序列以在植物中表达非编码RNA分子、mRNA和/或蛋白质而改变其基因组的植物。转基因植物包括从原始转化的植物细胞发育或再生的R0植物，以及来自包含重组DNA分子、构建体、盒或序列的R0转基因植物的后代或杂交的后代转基因植物。具有整合或***的重组DNA分子、构建体、盒或序列的植物被认为是转基因植物，即使该植物还具有本身不会被视为转基因的其它突变或编辑。
植物细胞是植物的生物细胞，取自植物或通过从取自植物的细胞培养得到。如本文所用，“转基因植物细胞”是指用稳定整合的重组DNA分子、构建体、盒或序列转化的任何植物细胞。转基因植物细胞可包括原始转化的植物细胞，再生或发育的R0植物的转基因植物细胞，从另一种转基因植物细胞培养的转基因植物细胞，或来自转化的R0植物的任何后代植物或子代的转基因植物细胞，包括植物种子或胚的细胞、或培养的植物细胞、愈伤组织细胞等。
如本文所用，术语“可转录DNA序列”是指可被转录成RNA分子的DNA序列。所述RNA分子可以是编码的或非编码的，并且可以与或可以不与启动子和/或其它调控序列可操作地连接。
出于本公开的目的，“非编码RNA分子”是不编码蛋白质的RNA分子。非编码RNA分子的非限制性实例包括微RNA(miRNA)，miRNA前体，小干扰RNA(siRNA)，siRNA前体，小RNA(长度为18-26nt)和编码其的前体，异染色质siRNA(hc-siRNA)，Piwi相互作用RNA(piRNA)，发夹双链RNA(发夹dsRNA)，反式作用siRNA(ta-siRNA)，天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)，CRISPR RNA(crRNA)，示踪RNA(tracrRNA)，指导RNA(gRNA)和单指导RNA(sgRNA)。
当关于基因使用时，术语“抑制”或“减少”是指与在一个或多个植物发育阶段的野生型或对照植物、细胞或组织中靶mRNA和/或蛋白质的表达水平和/或编码蛋白质的活性相比，在植物、植物细胞或植物组织中在相同植物发育阶段，由所述基因编码的mRNA和/或蛋白质的表达水平的降低、减少或消除，和/或由所述基因编码的蛋白质的活性降低、减少或消除。
如本文所用，关于多核苷酸或蛋白质序列的术语“连续的”是指序列中没有缺失或空位。
如本领域中通常理解的，“突变”是指基因组、染色体外DNA或生物体的其它遗传元件(例如，基因或与植物中的基因可操作地连接的调控元件)的核苷酸序列的任何改变，例如核苷酸***、缺失、倒位、取代、复制等。
如本文关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列所用的术语“同一性百分比”或“同一百分比”是通过以下方式计算的：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定两个序列中出现相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)的位置数，以得到匹配位置数；(iii)将所述匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，然后(iv)将该商乘以100％以得到同一性百分比。为了计算DNA和RNA序列之间的“同一性百分比”，RNA序列的尿嘧啶(U)被认为与DNA序列的胸腺嘧啶(T)相同。如果将比较窗口定义为两个或更多个序列之间的比对区域(即，不包括在所比较序列之间不相同的所比对的多核苷酸序列的5'端和3'端的核苷酸，或所比对的蛋白质序列的N末端和C末端的氨基酸)，则“同一性百分比”也可称为“比对同一性百分比”。如果在没有指定具体比较窗口的情况下相对于参考序列计算“同一性百分比”，则通过将比对区域上的匹配位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询序列和目标序列)被最佳地比对(在其比对中允许空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于两个序列之间的相同位置数除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的位置总数，然后乘以100％。
已经认识到，不相同的蛋白质的残基位置的差别往往在于保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似大小和化学特性(例如电荷、疏水性、极性等)的其它氨基酸残基取代，因此可能不会改变分子的功能特性。当序列差别在于保守取代时，可上调序列相似性百分比以校正一个或多个非相同取代的保守性质。差别在于此类保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。因此，如本文关于两个或更多个蛋白质序列所用的“相似性百分比”或“相似百分比”是通过以下方式计算的：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的蛋白质序列，(ii)确定两个序列中出现相同或相似氨基酸残基的位置数，以得到匹配位置数；(iii)将所述匹配位置数除以比较窗口(或如果未指定比较窗口的话，则为参考或查询蛋白质的总长度)中的位置总数，然后(iv)将该商乘以100％以得到相似性百分比。蛋白质的保守氨基酸取代是本领域已知的。
为了序列的最佳比对以计算其同一性或相似性百分比，本领域已知各种成对或多个序列比对算法和程序，例如ClustalW或Basic Local Alignment Search
如本文关于两个核苷酸序列所用的术语“互补性百分比”或“互补百分比”类似于同一性百分比的概念，但是是指当查询序列和目标序列线性排列并且最佳碱基配对而没有二级折叠结构(例如环、茎或发夹)时，与目标序列的核苷酸最佳碱基配对或杂交的查询序列的核苷酸百分比。这样的互补性百分比可以在两条DNA链、两条RNA链或者一条DNA链与一条RNA链之间。“互补性百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗口上以线性且完全延伸的排列(即，没有折叠或二级结构)对两个核苷酸序列进行最佳碱基配对或杂交，(ii)确定在比较窗口上两个序列之间碱基配对的位置数，以得到互补位置数；(iii)将所述互补位置数除以比较窗口中的位置总数，以及(iv)将该商乘以100％以得到两个序列的互补性百分比。两个序列的最佳碱基配对可基于通过氢键合实现的核苷酸碱基的已知配对(例如G-C、A-T和A-U)来确定。如果在没有指定具体比较窗口的情况下相对于参考序列计算“互补性百分比”，则通过将两个线性序列之间的互补位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询序列和目标序列)进行最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸但没有折叠或二级结构)时，查询序列的“互补性百分比”等于两个序列之间的碱基配对位置数除以查询序列在其长度上的位置总数(或除以查询序列中在比较窗口上的位置数)，然后乘以100％。
术语“可操作地连接”是指启动子或其它调控元件与相关联的可转录DNA序列或基因(或转基因)的编码序列之间的功能性连接，使得启动子等操作或起作用以至少在某些一个或多个细胞、组织、发育阶段和/或条件中引发、辅助、影响、导致和/或促进相关联的可转录DNA序列或编码序列的转录和表达。
如本领域中通常理解的，术语“启动子”可通常是指含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒并帮助或促进相关联的可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可以合成产生，变化或衍生自已知或天然存在的启动子序列或其它启动子序列。启动子还可包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本公开的启动子可包括与本文已知或提供的一个或多个其它启动子序列在组成上相似但不相同的启动子序列的变体。可根据与可操作地连接至启动子的相关编码或可转录序列或基因(包括转基因)的表达模式有关的多种标准对启动子进行分类，例如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。在植物的所有或大部分组织中驱动表达的启动子被称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段驱动表达的启动子被称为“发育型”启动子。相对于其它植物组织，在植物的某些组织中驱动增强表达的启动子被称为“组织增强的”或“组织优选的”启动子。因此，“组织优选的”启动子在植物的一个或多个特定组织中导致相对较高或优先的表达，但在植物的一个或多个其它组织中具有较低的表达水平。在植物的一个或多个特定组织中表达而在其它植物组织中很少或没有表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激例如寒冷、干旱或光照、或其它刺激例如伤害或化学品施加而引发转录的启动子。启动子也可以按照其来源进行分类，例如异源、同源、嵌合、合成等。
如本文所用，“植物可表达启动子”是指可引发、辅助、影响、导致和/或促进其相关联的可转录DNA序列、编码序列或基因在玉米植物细胞或组织中的转录和表达的启动子。
如本文所用，“异源植物可表达启动子”是指在其自然环境中不是自然地与参照基因或核酸序列相邻或与其相关联而是通过实验室操作来定位的植物可表达启动子。
如本文所用，“维管启动子”是指一种植物可表达启动子，其驱动、导致或引发与这种启动子可操作地连接的可转录DNA序列或转基因在植物的一个或多个维管组织中的表达，即使所述启动子也在一个或多个其它非维管植物细胞或组织中表达。此类一个或多个维管组织可包括植物的韧皮部、维管薄壁组织、和/或一个或多个束鞘细胞或组织中的一者或多者。“维管启动子”与组成型启动子的区别在于它具有受调控且相对更有限的表达模式，包括植物的一个或多个维管组织。维管启动子包括维管特异性启动子和维管优选启动子。
如本文所用，“叶启动子”是指一种植物可表达启动子，其驱动、导致或引发与这种启动子可操作地连接的可转录DNA序列或转基因在植物的一个或多个叶组织中的表达，即使所述启动子也在一个或多个其它非叶植物细胞或组织中表达。叶启动子包括叶特异性启动子和叶优选启动子。“叶启动子”与维管启动子的区别在于，相对于其它植物组织，它更主要地或仅在植物的一个或多个叶组织中表达，而维管启动子更通常在植物的包括叶外部的一个或多个维管组织的一个或多个维管组织(例如茎的一个或多个维管组织，或茎和叶)中表达。
关于与相关联的多核苷酸序列(例如，可转录DNA序列或编码序列或基因)有关的启动子或其它调控序列，术语“异源”是不与自然界中的这种相关联的多核苷酸序列可操作地连接的启动子或调控序列，例如，启动子或调控序列相对于相关联的多核苷酸序列具有不同的来源，和/或启动子或调控序列并非天然存在于有待用启动子或调控序列转化的植物物种中。
如本文所用，启动子序列的“功能部分”是指启动子序列的一部分，其提供与完整启动子序列基本上相同或相似的可操作地连接的编码序列或基因的表达模式。对于该定义，“基本上相同或相似”是指可操作地连接至启动子序列的功能部分的编码序列的表达模式和水平与可操作地连接至完整启动子序列的相同编码序列的表达模式和水平非常相似。
关于多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体、载体等的术语“重组”是指人造的并且在自然界中通常不存在的，和/或在通常不存在于自然界中的情形中存在的多核苷酸或蛋白质分子或序列，包括多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体等，其包含在没有人工干预的情况下将不以相同方式天然地一起存在的两个或更多个多核苷酸或蛋白质序列的组合，例如包含可操作地连接但相对于彼此异源的至少两个多核苷酸或蛋白质序列的多核苷酸分子、蛋白质、构建体等。例如，术语“重组”可以指同一分子(例如，质粒、构建体、载体、染色体、蛋白质等)中两个或更多个DNA或蛋白质序列的任何组合，其中这样的组合是人造的并且是自然界中通常不存在的。如在该定义中所使用的，短语“自然界中通常不存在的”意指在没有人工引入的情况下在自然界中不存在。重组多核苷酸或蛋白质分子、构建体等可包含一个或多个多核苷酸或蛋白质序列，所述序列(i)与在自然界中彼此邻近存在的其它一个或多个多核苷酸或蛋白质序列分开，和/或(ii)与天然彼此不邻近的其它一个或多个多核苷酸或蛋白质序列相邻(或邻接)。这种重组多核苷酸分子、蛋白质、构建体等也可以指已经在细胞外部遗传工程改造和/或构建的多核苷酸或蛋白质分子或序列。例如，重组DNA分子可包含任何工程改造或人造质粒、载体等，并且可包括线性或环状DNA分子。此类质粒、载体等可含有各种维持元件，包括原核复制起点和选择标记，以及可能除植物选择标记基因之外的一个或多个转基因或表达盒等。
如本文所用，术语“分离的”是指将分子与在其天然状态中通常与其相关联的其它分子至少部分地分开。在一个方面，术语“分离的”是指与在其天然状态中通常位于DNA分子侧翼的核酸分开的DNA分子。例如，天然存在于细菌中的编码蛋白质的DNA分子如果不在天然存在编码蛋白质的DNA分子的细菌的DNA内，则将是分离的DNA分子。因此，例如由于重组DNA或植物转化技术而与在自然界中与其不相关联的一个或多个其它DNA分子融合或可操作地连接的DNA分子在本文被视为分离的。即使在整合到宿主细胞的染色体中或与其它DNA分子一起存在于核酸溶液中时，此类分子也被视为分离的。
如本文所用，“编码区”或“编码区域”是指编码功能单元或分子(例如但不限于mRNA、蛋白质、或非编码RNA序列或分子)的多核苷酸的一部分。
如本文所用，在植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组的上下文中，“经修饰的”是指例如经由通过转基因事件或基因组编辑事件或影响一个或多个基因的表达水平或活性的突变，相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，包含一个或多个基因的表达水平和/或编码序列的工程改造改变的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。经修饰的植物、植物部分、种子等可通过诱变、基因组编辑或定点整合(例如但不限于经由使用位点特异性核酸酶的方法)、遗传转化(例如但不限于经由农杆菌(Agrobacterium)转化或微粒轰击的方法)或它们的组合进行或产生。这种“经修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞包括这样的植物、植物种子、植物部分和植物细胞，其作为保留了一个或多个基因的分子变化(例如，表达水平和/或活性的变化)的“经修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞的子代或由其衍生。本文提供的经修饰的种子可产生本文提供的经修饰的植物。本文提供的经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞或植物基因组可包含如本文所提供的重组DNA构建体或载体或基因组编辑。“经修饰的植物产品”可以是由本文提供的经修饰的植物、植物部分、植物细胞或植物染色体或其任何部分或组分制成的任何产品。
如本文所用，术语“对照植物”(或同样地“对照”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指这样的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)，其用于与经修饰的植物(或经修饰的植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)进行比较，并且除了影响一个或多个基因的转基因、表达盒、突变和/或基因组编辑之外具有与经修饰的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)相同或相似的遗传背景(例如，相同的亲本系、杂种杂交、近交系、测试种等)。为了与经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组进行比较，“野生型植物”(或同样地“野生型”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指非转基因、非突变和非基因组编辑的对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。或者，如本文可指定，这样的“对照植物”(或同样地“对照”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)可以指这样的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)，其(i)用于与具有两个或更多个转基因、表达盒、突变和/或基因组编辑的堆叠的经修饰的植物(或经修饰的植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)进行比较，(ii)与经修饰的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)具有相同或相似的遗传背景(例如，相同的亲本系、杂种杂交、近交系、测试种等))，但(iii)缺少经修饰的植物的两个或更多个转基因、表达盒、突变和/或基因组编辑中的至少一者(例如，与堆叠成员之一的单株相比的堆叠株)。如本文所用，这样的“对照”植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组也可以是与经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有相似(但不是相同或同一)的遗传背景的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，如果认为足够相似则比较待分析的特征或性状。
如本文所用，“杂交的”或“杂交”是指经由受精(例如，细胞、种子或植物)产生后代，并且包括植物之间的杂交(有性)和自体受精(自交)。
如本文所用，玉米植物的“穗部性状”是指玉米植物的穗的特征。在一个方面，穗部性状可包括但不限于：穗直径、单粒重、穗鲜重和/或产量。在另一方面，穗部性状可包括但不限于穗面积、穗体积、穗长、每穗粒数、穗尖空隙、穗空隙、粒数、行粒数、每农田面积粒数、籽粒等级、籽粒行数、籽粒重量、小花数量和/或谷粒产量估计值。在另一方面，穗部性状可包括但不限于：穗位置、穗轴颜色、穗轴直径、穗轴强度、穗干壳颜色、穗鲜壳颜色、穗壳苞片、穗壳覆盖物、穗壳开口、每秆穗数、穗柄长度、穗脱壳率、穗丝颜色、穗锥度、穗重、穗腐度、籽粒糊粉颜色、籽粒帽颜色、籽粒胚乳颜色、籽粒胚乳类型、籽粒等级、籽粒长度、籽粒果皮颜色、籽粒行方向、籽粒侧面颜色、籽粒厚度、籽粒类型、籽粒宽度、穗轴重量和/或多穗性。与对照玉米植物相比，本公开的经修饰的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出一种或多种改善的穗部性状。在一个方面，经修饰的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的穗直径。在一个方面，经修饰的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的单粒重。在一个方面，经修饰的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的穗鲜重。在一个方面，经修饰的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的产量。
如本文所用，“产量”是指如本领域中所理解的每单位土地耕种面积(例如，作物植物的田地)从多个作物植物生产或收获的农产品(例如，种子、果实等)的总量。可在温室中、田地中或在特定环境、处理和/或胁迫条件下测量或估计产量。例如，如本领域中已知和理解的，产量可以千克/公顷、蒲式耳/英亩等为单位来计量。实际上，如本领域中已知和理解的，产量可以“广亩产量”或“BAY”来计量。
如本文所用，“叶片氮百分比”是指氮(“N”)含量除以叶冲压样品的总干重的百分比[氮％＝100*(氮的重量)/(干燥样品的总重量)]。样品的叶片氮百分比可使用本领域技术人员已知的各种方法来测量。这些方法可包括但不限于：组织分析(凯氏消化(Kjeldahldigestion)或杜马斯燃烧(Dumas combustion))、叶级光学计(透射或荧光)、冠层级光学计(基于地面的或卫星安装的)，以及液位计和电量计(硝酸盐试纸、硝酸盐离子选择电极或电阻抗光谱法)。例如，可使用元素分析仪测量氮含量并使用各种方法如K因子法进行计算。
如本文所用，植物的“可比较条件”是指用于在两种或更多种植物基因型之间生长和进行有意义的比较的相同或相似的环境条件和农艺实践，使得环境条件和农艺实践均不会显著地促进或解释两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。环境条件包括例如光照、温度、水、湿度、土壤和营养(例如氮和磷)。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许对植物基因组中的特定位置进行精确和/或靶向编辑的任何方法、方案或技术(即，该编辑在很大程度上或完全是非随机的)，其使用位点特异性核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶(例如CRISPR/Cas9系统)、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶。
如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指使用靶向基因组编辑技术产生内源植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少2500、至少5000、至少10,000或至少25,000个核苷酸的靶向突变、缺失、倒位或取代。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”还涵盖使用靶向基因组编辑技术将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少10,000或至少25,000个核苷酸靶向***或定点整合到植物的内源基因组中。
如本文所用，用于基因组编辑的“靶位点”是指植物基因组内多核苷酸序列的位置，该多核苷酸序列被位点特异性核酸酶靶向并切割，从而将双链断裂(或单链切口)引入多核苷酸序列的核酸主链和/或其互补DNA链中。位点特异性核酸酶可例如经由非编码指导RNA(例如但不限于如下文进一步描述的CRISPR RNA(crRNA)或单指导RNA(sgRNA))结合至靶位点。本文提供的非编码指导RNA可与靶位点互补(例如，与双链核酸分子的链或靶位点的染色体互补)。“靶位点”还指植物基因组中被另一位点特异性核酸酶结合和切割的多核苷酸序列的位置，该位点特异性核酸酶可能不受非编码RNA分子的指导，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，以将双链断裂(或单链切口)引入多核苷酸序列和/或其互补DNA链中。如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧翼为两个或更多个靶位点的多核苷酸序列或区域。不受限制地，在一些方面，靶区域可经历突变、缺失、***或倒位。如本文所用，“侧翼的”当用于描述多核苷酸序列或分子的靶区域时，是指围绕靶区域的多核苷酸序列或分子的两个或更多个靶位点，在靶区域的每一侧上具有一个靶位点。
除基因组编辑外，术语“靶位点”在基因抑制的情形下还可用于指与由抑制构建体编码的非编码RNA分子(例如，miRNA、siRNA等)的至少一部分互补的mRNA分子的一部分(例如“识别位点”)。如本文所用，RNA指导的核酸酶的“靶位点”可包含靶位点处的双链核酸(DNA)分子或染色体的任一互补链的序列。应当理解，非编码指导RNA结合或杂交至靶位点可能不需要完全的同一性或互补性。例如，靶位点与非编码RNA之间可容许至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个错配(或更多个)。
如本文所用，可以是重组DNA供体模板的“供体分子”、“供体模板”或“供体模板分子”(统称为“供体模板”)被定义为具有用于经由植物细胞基因组中的切口或双链DNA断裂的修复而定点、靶向***或重组到植物细胞的基因组中的核酸模板或***序列的核酸分子。例如，“供体模板”可用于转基因或抑制构建体的定点整合，或用作将突变如***、缺失等引入到植物基因组内的靶位点的模板。本文提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个供体分子或模板。供体模板可以是单链或双链DNA或RNA分子或质粒。供体模板还可具有至少一个同源序列或同源臂，例如两个同源臂，以引导经由同源重组将突变或***序列整合到植物基因组内的靶位点中，其中同源序列或同源臂与植物基因组内靶位点处或附近的序列相同或互补，或具有同一性百分比或互补性百分比。当供体模板包含一个或多个同源臂和***序列时，所述同源臂将侧接或围绕所述供体模板的所述***序列。此外，供体模板可以是线性或圆形的，并且可以是单链或双链的。供体模板可作为裸核酸(例如，经由粒子轰击)，作为与一种或多种递送剂(例如，脂质体、蛋白质、泊洛沙姆、包裹有蛋白质的T链等)的复合物，或分别包含在细菌或病毒递送媒介物(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或双生病毒(geminivirus))中，递送至细胞。
供体模板的***序列可包含一个或多个基因或序列，每个基因或序列编码转录的非编码RNA或mRNA序列和/或翻译的蛋白质序列。供体模板的转录序列或基因可编码蛋白质或非编码RNA分子。供体模板的***序列可包含不包含功能基因或完整基因序列的多核苷酸序列(例如，供体模板可仅包含调控序列，例如启动子序列，或仅包含基因或编码序列的一部分)，或者可能不含任何可识别的基因表达元件或任何有效转录的基因序列。本文提供的供体模板的***序列可包含可转录DNA序列，其可以被转录成RNA分子，该RNA分子可以是非编码的并且可以与或可以不与启动子和/或其它调控序列可操作地连接。
如本文所用，术语“指导RNA”或“gRNA”是短RNA序列，其包含(1)与RNA指导的核酸酶和/或与其它RNA分子(例如，tracrRNA)结合或相互作用所需的结构或支架RNA序列，和(2)与靶序列或靶位点相同或互补的RNA序列(在本文中称为“指导序列”)。“单链指导RNA”(或“sgRNA”)是包含通过接头序列共价连接tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可以表达为单个RNA转录物或分子。指导RNA包含与植物基因组内的靶位点相同或互补的指导或靶向序列(“指导序列”)，例如在GA氧化酶基因处或附近。前间区序列邻近基序(PAM)可存在于紧邻与指导RNA的靶向序列互补的基因组靶位点序列的5'端并在其上游的基因组中，即如本领域已知紧邻基因组靶位点的有义(+)链的下游(3')(相对于指导RNA的靶向序列)。与靶位点相邻的有义(+)链上的基因组PAM序列(相对于指导RNA的靶向序列)可包含5'-NGG-3'。然而，指导RNA的相应序列(即，紧邻指导RNA的靶向序列的下游(3'))通常不与基因组PAM序列互补。指导RNA通常可以是不编码蛋白质的非编码RNA分子。
如本文所用，“RNA指导的核酸酶”是指与CRISPR系统相关联的RNA指导的DNA核酸内切酶。RNA指导的核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，其同源物或其修饰形式。在一个方面，RNA指导的核酸酶是Cas9。在一个方面，RNA指导的核酸酶包含N末端和C末端核定位序列(NLS)。
描述
本公开提供了玉米植物、植物部分等中的转基因和/或突变或编辑的某些堆叠组合，其除了通过抑制、突变和/或编辑GA氧化酶基因来降低一种或多种GA20和/或GA3氧化酶基因的表达水平之外，还包含编码一种或多种钼辅因子(Moco)生物合成多肽例如大肠杆菌MoaD的转基因，其中所述玉米植物具有半矮秆表型，并且具有一种或多种改善的与产量、抗倒伏性和/或胁迫耐受性有关的性状。如共同未决的PCT申请第PCT/US2017/047405号中所述，所述文献的全部内容和公开内容通过引用并入本文，例如通过抑制、突变或编辑一种或多种GA20和/或GA3氧化酶基因来降低玉米或其它谷类植物中活性GA的水平，可导致具有改善的农艺性状(例如抗倒伏性和/或增加的产量)的半矮秆表型。然而，本文提出较低的活性GA水平可与编码Moco生物合成蛋白例如MoaD的表达盒或转基因结合，以产生具有正面穗部性状的半矮秆玉米植物，从而导致产量进一步增加，因此与仅Moco生物合成基因表达或较低的活性GA水平相比，提供了更大的农艺益处。
赤霉素(赤霉酸或GA)是调控许多主要植物生长和发育过程的植物激素。在20世纪对半矮秆小麦、水稻和高粱植物品种中GA水平的操纵导致了这些谷类作物的产量增加和倒伏减少，这在很大程度上导致了绿色革命。然而，尚未通过操纵GA途径实现其它谷类作物(例如玉米)的成功增产。玉米或玉蜀黍在谷粒生产禾草中的独特之处在于它形成分开的雄性(雄穗)和雌性(穗)花序，并且玉米中GA途径的突变已显示出对生殖发育产生负面影响。实际上，玉米中GA途径基因的一些突变与和产量不相容的各种异型相关联，这导致研究人员无法经由操纵GA途径找到半矮秆高产玉米品种。
尽管通过操纵GA途径在实现玉米中更高谷粒产量方面存在这些先前的困难，但共同未决的PCT申请第PCT/US2017/047405号描述了一种以降低总体植株高度和茎节间长以及增加抗倒伏性但不会导致先前与玉米中GA途径突变相关的生殖异型的方式来操纵玉米植物中的活性GA水平的方法。进一步的证据表明，这些GA水平降低的矮株型或半矮秆玉米植物还可具有一种或多种其它的产量和/或胁迫耐受性状，包括茎直径增加，未成熟折断减少，根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，水利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中花色素苷含量和面积减少，穗重增加，籽粒数量增加，籽粒重量增加，产量增加和/或收获指数提高。
对于给定的植物物种，活性或生物活性的赤霉酸(即“活性赤霉素”或“活性GA”)是本领域已知的，与无活性GA不同。例如，玉米和高等植物中的活性GA包括以下：GA1、GA3、GA4和GA7。因此，“产生活性GA的组织”是产生一种或多种活性GA的植物组织。
GA途径中的某些生物合成酶(例如GA20氧化酶和GA3氧化酶)和分解代谢酶(例如GA2氧化酶)分别参与GA合成和降解，从而影响植物组织中活性GA的水平。因此，除了抑制某些GA20氧化酶基因外，进一步提出以组成型或组织特异性或组织优选的方式抑制GA3氧化酶基因也可以产生具有矮株型表型和增加的抗倒伏性，产量可能提高，但穗中没有异型的玉米植物。
不受理论的束缚，提出一种或多种GA20或GA3氧化酶基因的不完全抑制和/或一种或多种GA氧化酶基因的子集的靶向可以有效地实现矮株型、半矮秆表型与增加的抗倒伏性，但在穗中没有生殖异型。不受理论的限制，进一步提出将一种或多种GA20和/或GA3氧化酶基因的抑制限制在某些产生活性GA的组织如植物的维管和/或叶组织中，就能够足以产生具有提高的抗倒伏性但在生殖组织中没有明显异型的矮株型植物。以组织特异性或组织优选的方式表达GA20或GA3氧化酶抑制元件可充分且有效地产生具有矮株型表型的植物，同时避免以前在玉米中的GA突变体中观察到的生殖组织中的潜在异型(例如，通过避免或限制那些生殖组织中一种或多种GA20氧化酶基因的抑制)。例如，一种或多种GA20和/或GA3氧化酶基因可使用驱动在植物维管组织中表达的维管启动子(例如水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus，RTBV)启动子)靶向抑制。相对于非维管组织，RTBV启动子的表达模式在玉米植物的维管组织中富集，当与靶向一种或多种GA20和GA3氧化酶基因的抑制元件可操作地连接时，足以在玉米植物中产生半矮秆表型。降低产生活性GA的玉米植物的一个或多个组织中活性GA的水平可降低植株高度并增加抗倒伏性，并且如果活性GA的水平在生殖组织(例如植物的发育雌性器官或穗)中也没有显著影响或降低，则可以避免这些植物中出现异型。如果可降低玉米或谷类植物的秆、茎或一个或多个节间的活性GA水平，而不会显著影响生殖组织(例如雌性或雄性生殖器官或花序)中的GA水平，则具有降低的植株高度和增加的抗倒伏性的玉米或谷类植物可在植物生殖组织中没有异型的情况下产生。
不受理论的限制，进一步提出玉米植物中矮株型、半矮秆表型可由在植物的一个或多个活性GA产生组织中靶向某些GA氧化酶基因的抑制构建体的足够水平的表达引起。对于玉米中某些GA20氧化酶基因的靶向抑制，为避免发育中的穗出现生殖异型，限制表达模式以避免生殖穗组织可能不是必需的。然而，GA20氧化酶抑制构建体在低水平和/或有限数量的植物组织中的表达可能不足以引起明显的矮株型、半矮秆表型。鉴于观察到的具有靶向GA20氧化酶抑制作用的半矮秆表型是缩短植物茎节间的结果，令人惊讶地发现，至少在某些茎组织中抑制GA20氧化酶基因不足以引起节间缩短并降低植株高度。不受理论的束缚，提出了在产生活性GA的植物的一个或多个组织和/或一个或多个细胞中(不一定在茎或一个或多个节间组织中)抑制某些GA氧化酶基因可能足以产生半矮秆植物，即使矮株型性状是由于茎节间的缩短。鉴于GA可通过植物的脉管系统迁移，操纵产生活性GA的一个或多个植物组织中的GA氧化酶基因可导致矮株型、半矮秆植物，即使这可在很大程度上通过抑制非茎组织中产生的活性GA的水平来实现(即，远离茎中的作用位点，其中节间伸长的减少导致半矮秆表型)。实际上，抑制叶片组织中某些GA20氧化酶基因会在玉米植物中导致中度半矮秆表型。鉴于利用若干不同的“茎”启动子表达GA20氧化酶抑制构建体不在玉米中产生半矮秆表型，值得注意的是，利用维管启动子表达相同的GA20氧化酶抑制构建体在持续产生半矮秆表型方面是有效的，在事件和种质间具有高外显度。在使用其它维管启动子和各种组成型启动子表达相同的GA20氧化酶抑制构建体的情况下也观察到这种半矮秆表型，而没有观察到任何异型。
通过靶向一种或多种内源GA3或GA20氧化酶基因的子集以在植物中进行抑制，可使用更普遍的表达模式(例如，使用组成型启动子)来产生半矮秆植物，而植物中没有明显的生殖异型和/或其它不良性状，即使抑制构建体在一个或多个生殖组织中表达也是如此。实际上，本文提供了选择性靶向GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因以进行抑制的抑制元件和构建体，其可以可操作地连接至维管、叶片和/或组成型启动子。
因此，本文提供了重组DNA构建体和经修饰的玉米植物，其包含与植物可表达启动子可操作地连接的GA20或GA3氧化酶抑制元件或序列，所述植物可表达启动子可以是组成型或组织特异性或组织优选的启动子。这种组织特异性或组织优选的启动子可驱动其相关联的GA氧化酶抑制元件或序列在植物的一种或多种产生活性GA的组织中的表达，以抑制或降低那些组织中产生的活性GA的水平。这种组织特异性或组织优选的启动子可在一个或多个营养发育阶段中驱动其相关联的GA氧化酶抑制构建体或转基因的表达。这样的组织特异性或组织优选的启动子在植物的发育中的雌性器官或穗的一个或多个细胞或组织中也可以很少表达或不表达，从而避免了这些生殖组织中的异型的可能性。根据一个方面，组织特异性或组织优选的启动子是维管启动子，例如RTBV启动子。RTBV启动子的序列在本文中以SEQ ID NO:65提供，并且RTBV启动子的截短形式在本文中以SEQ ID NO:66进一步提供。然而，其它类型的组织特异性或组织优选的启动子可能潜在地用于玉米或谷类植物的活性GA产生组织中的GA3氧化酶抑制，以产生半矮秆表型而没有明显异型。如上所述，代替抑制一种或多种GA氧化酶基因，还可通过突变或编辑一种或多种GA20和/或GA3氧化酶基因来降低玉米植物中的活性GA水平。
玉米具有至少9个GA20氧化酶基因的家族，包括GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8和GA20氧化酶_9。然而，玉米中只有两种GA3氧化酶，即GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2。表1提供了这些GA20氧化酶基因各自的SEQ ID NO的DNA和蛋白质序列，并且表2提供了这些GA3氧化酶基因各自的SEQ ID NO的DNA和蛋白质序列。
表1.通过序列标识符给出的玉米中GA20氧化酶基因的DNA和蛋白质序列。
表2.通过序列标识符给出的玉米中GA3氧化酶基因的DNA和蛋白质序列。
除了通过抑制、突变或编辑一种或多种GA氧化酶基因来降低玉米植物中的活性GA水平外，如本文所提供的这些玉米植物还可包含表达一种或多种钼辅因子(Moco)生物合成多肽的异位表达的转基因。
过渡元素钼(Mo)是微生物、植物和动物必需的微量营养素。已知超过50种酶具有钼依赖性。然而，钼本身在生物系统中没有催化活性，直到它与称为钼蝶呤(molybdopterin，MPT)的独特三环蝶呤复合，并且Mo与MPT的复合物被称为钼辅因子(Moco)。Moco由三磷酸鸟苷(GTP)合成，由与MPT的两个硫原子共价结合的钼组成，并且构成所有真核含Mo酶的活性位点的一部分。含Moco的酶在全球碳、硫和氮循环中催化重要的氧化还原反应。在细菌中发现了超过50种已知的含Moco酶中的绝大多数，而在真核生物中仅鉴定出7种。这些酶可分为多个家族，例如硝酸盐还原酶、亚硫酸盐氧化酶、醛氧化酶和黄嘌呤脱氢酶。
在细菌和高等生物中，Moco是通过保守的生物合成途径合成的，该途径可分为四个步骤。参见例如Mendel,J.Biol.Chem.,288:13165-13172(2013)，其内容和公开内容通过引用并入。不受任何理论的束缚，在该途径的第一步骤中，可将5'鸟苷三磷酸(5'-GTP)转化为环状吡喃蝶呤单磷酸(cPMP)。该反应通常由两种蛋白质催化，例如大肠埃希氏菌(大肠杆菌)中的钼辅因子生物合成蛋白(MoaA和MoaC)，植物中的硝酸盐还原酶和黄嘌呤脱氢酶蛋白辅因子(Cnx2和Cnx3)，以及动物中的钼辅因子合成蛋白(MOCS1A和MOCS1B)。
不受任何理论的束缚，在Moco生物合成途径的第二步骤中，可将两个硫转移到cPMP到一般钼蝶呤(MPT)。该反应可由MPT合酶催化，MPT合酶是由两个小亚基和两个大亚基组成的异四聚体复合物。MPT合酶的小亚基包括但不限于大肠杆菌中的MoaD，植物中的Cnx7和动物中的MOCS2B。MPT合酶的大亚基包括但不限于大肠杆菌中的MoaE，植物中的Cnx6和动物中的MOCS2A。参见例如US 2014/0223605和US 2011/0277179，其内容和公开内容通过引用并入。
在MPT合酶将两个硫转移到cPMP后，必须在第三步骤中用MPT合酶硫化酶将其重新硫化，以在下一cPMP到MPT反应周期中重新激活该酶。MPT合酶硫化酶包括但不限于大肠杆菌中的MoeB，植物中的Cnx5和动物中的MOCS3。不受任何理论的束缚，可通过用单磷酸腺苷(AMP)进行腺苷酸化来激活MPT酶以生成MPT-AMP，该MPT-AMP可被大肠杆菌中的MogA、植物中的Cnx1的G结构域或动物中的桥尾蛋白(gephyrin)的G结构域催化。该反应可以Mg2+和ATP依赖性方式进行。MPT-AMP可用作后续Mo***反应的底物。
不受任何理论的束缚，在第四步骤中，MPT-AMP的AMP部分可被裂解并且可将钼酸盐***到MPT的二硫烯基团中，从而产生生理活性的Moco。该反应可由大肠杆菌中的MoeA、植物中的Cnx1的E结构域或动物中的桥尾蛋白的E结构域催化。不受任何理论的束缚，Moco结合蛋白(MoBP)随后可与Moco结合，并引导其转移到同源靶酶(例如，上面介绍的酶家族之一)。MoBP通过形成能够容纳四个Moco分子的均四聚体而结合并保护Moco免受氧化。不受任何理论的束缚，Moco的Mo原子需要添加末端无机硫以向靶酶提供酶活性。该最后的步骤由酶Moco硫化酶(例如植物中的ABA3和动物中的HMCS)催化。
如本文所用，钼辅因子(Moco)生物合成多核苷酸是指编码Moco生物合成多肽(例如钼蝶呤合酶基因)的多核苷酸、基因或编码序列，其可包含参与钼辅因子(Moco)的生物合成的钼蝶呤合酶基因(例如，来自大肠杆菌的MoaD基因，来自植物的Cnx7基因，或来自动物的MOCS2B基因，或其同源物)的小亚基，及其同工型、同源物、旁系同源物和直系同源物。在一个方面，Moco生物合成多核苷酸包含如SEQ ID NO:168所示的氨基酸序列，其功能片段，其同工型，其同源物，其旁系同源物或其直系同源物。在另一方面，Moco生物合成多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:174-177组成的组的氨基酸序列，其功能片段，其同工型，其同源物，其旁系同源物和其直系同源物。
根据另一方面，提供了一种经修饰的玉米植物或其植物部分，其包含：1)第一重组表达盒(或构建体)，所述第一表达盒(或构建体)包含编码用于抑制一种或多种赤霉酸20(GA20)氧化酶基因和/或一种或多种赤霉酸3(GA3)氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二重组表达盒(或构建体)，所述第二重组表达盒(或构建体)包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列。
根据另一方面，田间的多个经修饰的玉米植物，每个经修饰的玉米植物包含：1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种赤霉酸20(GA20)氧化酶基因和/或一种或多种赤霉酸3(GA3)氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列。在一个方面，经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物具有增加的产量。在另一方面，经修饰的玉米植物相比于对照玉米植物的产量增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％或至少25％。
相对于不具有第一表达盒和第二表达盒或者Moco生物合成转基因和一种或多种编辑的/突变的GA氧化酶基因的组合的一种或多种对照玉米植物，这些经修饰的玉米植物除了具有如本文进一步描述的一种或多种改善的产量相关性状之外，还可以具有半矮秆植株高度。包含第一表达盒和第二表达盒的组合或者包含Moco生物合成转基因和一种或多种突变的或编辑的GA氧化酶基因的表达盒的组合的经修饰的玉米植物，可各自称为“堆叠”或“堆叠的”组合。用于降低活性GA水平和Moco生物合成转基因表达的这些堆叠组合可通过以下方式集合在同一玉米植物或玉米植物群体中：(1)使包含一个或多个GA氧化酶抑制元件、一个或多个编辑和/或一个或多个突变的第一植物与包含Moco生物合成转基因的第二植物杂交，(2)将植物或植物部分与一个或多个GA氧化酶抑制元件和Moco生物合成转基因共转化，(3)用Moco生物合成转基因转化已经具有一个或多个GA氧化酶抑制元件、一个或多个编辑和/或一个或多个突变的植物或植物部分，(4)用一个或多个GA氧化酶抑制元件转化已经具有Moco生物合成转基因的植物或植物部分，或(5)在已经具有Moco生物合成转基因的植物或植物部分中编辑或突变一个或多个GA氧化酶基因，其中的每一者可以接着进行进一步的杂交以获得期望的基因型，可以使植物部分再生、生长或发育为植物，并且植物部分可取自任何上述植物。
如上文所提供，玉米植物或植物部分可包含第一表达盒，所述第一表达盒包含编码靶向一种或多种用于抑制的GA20或GA3氧化酶基因的非编码RNA分子的第一序列。在一个方面，非编码RNA分子可靶向一种或多种用于抑制的GA20氧化酶基因，例如GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因、GA20氧化酶_5基因或其任何组合。根据一个方面，所述第一表达盒包含编码靶向用于抑制的GA20氧化酶_3基因的非编码RNA的第一可转录DNA序列。根据另一方面，所述第一表达盒包含编码靶向用于抑制的GA20氧化酶_5基因的非编码RNA的第一可转录DNA序列。根据另一方面，所述第一表达盒包含编码靶向用于抑制的GA20氧化酶_3基因和GA20氧化酶_5基因两者的非编码RNA的第一可转录DNA序列。除了靶向成熟的mRNA序列(包括非翻译或外显子序列中的任一者或两者)以外，非编码RNA分子还可靶向GA20氧化酶基因或转录物的内含子序列。
SEQ ID NO:34提供了GA20氧化酶_3的基因组DNA序列，并且SEQ ID NO:35提供了GA20氧化酶_5的基因组DNA序列。对于GA20氧化酶_3基因，SEQ ID NO:34提供了GA20氧化酶_3 5'-UTR上游的3000个核苷酸；核苷酸3001-3096对应于5'-UTR；核苷酸3097-3665对应于第一外显子；核苷酸3666-3775对应于第一内含子；核苷酸3776-4097对应于第二外显子；核苷酸4098-5314对应于第二内含子；核苷酸5315-5584对应于第三外显子；并且5585-5800核苷酸对应3'-UTR。SEQ ID NO:34还提供了3'-UTR末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5801-8800)。对于GA20氧化酶_5基因，SEQ ID NO:35提供了GA20氧化酶_5起始密码子上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；核苷酸3001-3791对应于第一外显子；核苷酸3792-3906对应于第一内含子；核苷酸3907-4475对应于第二外显子；核苷酸4476-5197对应于第二内含子；核苷酸5198-5473对应于第三外显子；并且核苷酸5474-5859对应于3'-UTR。SEQ ID NO:35还提供了3'-UTR末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5860-8859)。
SEQ ID NO:38提供了GA20氧化酶_4的基因组DNA序列。对于GA氧化酶_4基因，SEQID NO:38提供了5'-UTR上游的核苷酸1-1416；SEQ ID NO:38的核苷酸1417-1543对应于5'-UTR；SEQ ID NO:38的核苷酸1544-1995对应于第一外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸1996-2083对应于第一内含子；SEQ ID NO:38的核苷酸2084-2411对应于第二外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸2412-2516对应于第二内含子；SEQ ID NO:38的核苷酸2517-2852对应于第三外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸2853-3066对应于3'-UTR；并且SEQ ID NO:38的核苷酸3067-4465对应于3'-UTR下游的基因组序列。
对于GA20氧化酶_5基因，SEQ ID NO:35提供了GA20氧化酶_5起始密码子上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；核苷酸3001-3791对应于第一外显子；核苷酸3792-3906对应于第一内含子；核苷酸3907-4475对应于第二外显子；核苷酸4476-5197对应于第二内含子；核苷酸5198-5473对应于第三外显子；并且核苷酸5474-5859对应于3'-UTR。SEQ ID NO:35还提供了3'-UTR末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5860-8859)。
为了抑制GA20氧化酶_3基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:7和8所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶_4基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:10和11所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶_5基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:13和14所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶_3基因和GA20氧化酶_5基因，可转录DNA序列包含与以SEQID NO:7和8所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列；并且所述可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:13和14所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
在一个方面，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含(i)与SEQ ID NO:39、41、43或45具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，和/或(ii)编码非编码RNA分子的序列或抑制元件，其包含与SEQ ID NO:40、42、44或46具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。根据一个方面，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可包含相对于靶向GA20氧化酶基因mRNA的靶标或识别位点的序列具有一个或多个错配，例如1、2、3、4、5个或更多个互补错配的序列，例如与SEQ ID NO:40几乎互补但相对于SEQ ID NO:40具有一个或多个互补错配的序列。根据一个特定方面，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:40具有100％同一性的序列，该序列与cDNA和GA20氧化酶_3的编码序列内的靶序列(即分别为SEQ ID NO:7和8)具100％互补性，和/或与由内源GA20氧化酶_3基因编码的mRNA的相应序列具100％互补性。然而，与SEQ ID NO:40、42、44或46具有100％同一性的由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子的序列可能与cDNA中的靶序列和GA20氧化酶_5基因的编码序列(即分别为SEQ ID NO:13和14)并不完全互补，和/或与由内源GA20氧化酶_5基因编码的mRNA的相应序列并不完全互补。例如，SEQ ID NO:40中非编码RNA分子或miRNA序列与GA20氧化酶_5基因的cDNA和编码序列之间最紧密的互补匹配可在SEQ ID NO:39的第一位置包含一个错配(即，将SEQ ID NO:39的第一位置处的“C”替换为“G”；即GTCCATCATGCGGTGCAACTA)。然而，尽管有这种轻微的错配，但SEQ ID NO:40中的非编码RNA分子或miRNA序列仍可与由内源GA20氧化酶_5基因编码的mRNA结合并杂交。
为了抑制GA20氧化酶_1基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:1和2所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶_2基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:4和5所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶6，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:16和17所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶7基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:19和20所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶_8基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:22和23所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
为了抑制GA20氧化酶_9基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:25和26所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
代替或除了GA20氧化酶基因的外显子、5'UTR或3'UTR，非编码RNA可靶向GA20氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向用于抑制的GA20氧化酶_3基因的非编码RNA可包含与SEQID NO:34的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸和/或SEQ ID NO:34的核苷酸3666-3775或4098-5314具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在另一方面，靶向用于抑制的GA20氧化酶_5基因的非编码RNA分子可包含与SEQID NO:35的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸和/或SEQ ID NO:35的核苷酸3792-3906或4476-5197具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在另一方面，靶向用于抑制的GA20氧化酶_4基因的非编码RNA分子可包含与SEQID NO:38的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸和/或SEQ ID NO:38的核苷酸1996-2083或2412-2516具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在另一方面，第一表达盒包含第一可转录DNA序列，该第一可转录DNA序列编码玉米中靶向用于抑制的一种或多种GA3氧化酶基因(例如GA3氧化酶_1基因或GA3氧化酶_2基因)的非编码RNA。在另一方面，编码非编码RNA的第一可转录DNA序列靶向用于抑制的GA3氧化酶_1基因和GA3氧化酶_2基因两者。除了靶向成熟的mRNA序列(包括非翻译或外显子序列中的任一者或两者)以外，非编码RNA分子还可靶向GA3氧化酶基因或转录物的内含子序列。
SEQ ID NO:36提供了GA3氧化酶_1的基因组DNA序列，并且SEQ ID NO:37提供了GA3氧化酶_2的基因组DNA序列。对于GA3氧化酶_1基因，SEQ ID NO:36的核苷酸1-29对应于5'-UTR；SEQ ID NO:36的核苷酸30-514对应于第一外显子；SEQ ID NO:36的核苷酸515-879对应于第一内含子；SEQ ID NO:36的核苷酸880-1038对应于第二外显子；SEQ ID NO:36的核苷酸1039-1158对应于第二内含子；SEQ ID NO:36的核苷酸1159-1663对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:36的核苷酸1664-1788对应于3'-UTR。对于GA3氧化酶_2基因，SEQ IDNO:37的核苷酸1-38对应于5-UTR；SEQ ID NO:37的核苷酸39-532对应于第一外显子；SEQID NO:37的核苷酸533-692对应于第一内含子；SEQ ID NO:37的核苷酸693-851对应于第二外显子；SEQ ID NO:37的核苷酸852-982对应于第二内含子；SEQ ID NO:37的核苷酸983-1445对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:37的核苷酸1446-1698对应于3'-UTR。
为了抑制GA3氧化酶_1基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:28和29所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
如上所述，代替或除了GA氧化酶基因的外显子、5'UTR或3'UTR，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向用于抑制的GA3氧化酶_1基因的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:36的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸和/或SEQ ID NO:36的核苷酸515-879或1039-1158具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
为了抑制GA3氧化酶_2基因，第一可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:31和32所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
如上所述，代替或除了GA3氧化酶基因的外显子、5'UTR或3'UTR，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向用于抑制的GA3氧化酶_2基因的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:37的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸和/或SEQ ID NO:37的核苷酸533-692或852-982具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
为了抑制GA3氧化酶_1基因和GA3氧化酶_2基因，可转录DNA序列包含与以SEQ IDNO:28和29所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列；并且所述可转录DNA序列包含与以SEQ ID NO:31和32所示的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59或至少60个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
在一个方面，用于抑制GA20氧化酶基因和/或GA3氧化酶的可转录DNA序列包含选自由SEQ ID NO:47、49、51、53、55、57、59、61和63组成的组的序列。在另一方面，用于抑制GA20氧化酶基因和/或GA3氧化酶的可转录DNA序列编码非编码RNA序列，其中所述非编码RNA序列包含选自由SEQ ID NO:48、50、52、54、56、58、60、62和64组成的组的序列。
在一个方面，提供了包含编码Moco生物合成多肽的第二DNA序列的表达盒。在另一方面，第二DNA序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与由SEQ ID NO:174-177组成的组的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。编码Moco生物合成多肽的第二DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。在一个方面，这种植物可表达启动子是根启动子或胁迫诱导型启动子。在一个方面，这种根启动子可以是根优选或根特异性启动子。在一个方面，这种胁迫诱导型启动子可以是低氮或氮胁迫诱导型或响应型启动子。在另一方面，这种胁迫诱导型启动子可以是干旱诱导型或响应型启动子。在另一方面，植物可表达启动子可包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
在一个方面，提供了包含编码MoaD的第二DNA序列的表达盒。在另一方面，第二DNA序列包含与选自由SEQ ID NO:169组成的组的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。在另一方面，第二DNA序列包含编码与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的多肽的序列。在一个方面，这种植物可表达启动子是如本文所提供的根启动子或胁迫诱导型启动子。在一个方面，这种根启动子可以是根优选或根特异性启动子。在一个方面，这种胁迫诱导型启动子可以是低氮或氮胁迫诱导型或响应型启动子。在另一方面，这种胁迫诱导型启动子可以是干旱诱导型或响应型启动子。在另一方面，植物可表达启动子可包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。除了靶向成熟的mRNA序列外，非编码RNA分子也可以替代地靶向GA氧化酶基因或mRNA转录物的内含子序列，或与编码和非编码序列重叠的GA氧化酶mRNA序列。根据其它方面，提供了重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA(前体)分子的可转录DNA序列，该非编码RNA(前体)分子被切割或加工成与植物细胞中的靶mRNA结合或杂交的成熟非编码RNA分子，其中所述靶mRNA分子编码GA20或GA3氧化酶蛋白，并且其中所述可转录DNA序列与组成型或组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接。
根据本公开的方面，本领域已知的用于抑制靶基因的任何方法都可用于抑制一种或多种GA氧化酶基因，包括反义RNA、双链RNA(dsRNA)或反向重复RNA序列的表达，或经由通过小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)或微RNA(miRNA)的表达来进行共抑制或RNA干扰(RNAi)。此外，可以使用靶向基因内或附近的非编码基因组序列或区域以引起基因沉默的有义和/或反义RNA分子。因此，这些方法中的任何一种都可用于以组织特异性或组织优选的方式靶向抑制内源GA氧化酶基因。参见例如美国专利申请公开第2009/0070898号、第2011/0296555号和第2011/0035839号，所述美国专利申请公开的内容和公开内容通过引用并入本文。
在一个方面，在经修饰的玉米植物中降低或消除一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达水平，从而抑制所述一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因。
根据一个方面，提供了一种经修饰的或转基因的植物，其与对照植物相比在至少一个植物组织中的一种或多种GA20氧化酶基因的表达水平降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据一个方面，提供了一种经修饰的或转基因的植物，其与对照植物相比在至少一个植物组织中的一种或多种GA3氧化酶基因的表达水平降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据一个方面，提供了一种经修饰的或转基因的植物，其与对照植物相比在至少一个植物组织中的一种或多种GA20氧化酶基因的表达水平降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％。
根据一个方面，提供了一种经修饰的或转基因的植物，其与对照植物相比在至少一个植物组织中的一种或多种GA3氧化酶基因的表达水平降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％。
根据一个方面，在一个或多个营养发育阶段中，具有降低的一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达水平的经修饰的或转基因的植物的至少一个组织包括所述植物的一个或多个产生活性GA的组织，例如植物的一个或多个维管和/或叶组织。
在一个方面，非编码RNA是能够被加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
在一个方面，内源GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的抑制是组织特异性的(例如，仅在叶和/或维管组织中)。GA20氧化酶基因的抑制可以是组成型的和/或维管或叶组织特异性的或优选的。在其它方面，GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的抑制是组成型的而不是组织特异性的。根据一个方面，与对照植物的一个或多个相同组织相比，内源GA20氧化酶基因和/或GA3氧化酶基因的表达在经修饰的或转基因的植物的一种或多种组织类型中(例如在一个或多个叶和/或维管组织中)降低。
工程改造的miRNA可用于特异性增强的靶向基因抑制。参见例如Parizotto等,Genes Dev.18:2237-2242(2004)；以及美国专利申请公开第2004/0053411号、第2004/0268441号、第2005/0144669号和第2005/0037988号，所述文献的内容和公开内容通过引用并入本文。miRNA是非蛋白质编码RNA。当切割miRNA前体分子时，形成成熟的miRNA，其长度通常为约19至约25个核苷酸(在植物中长度通常为约20至约24个核苷酸)，例如长度为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，并具有对应于靶向用于抑制的基因和/或其互补序列的序列。成熟的miRNA与靶mRNA转录物杂交，并指导蛋白质复合物与靶转录物的结合，这可以起到抑制翻译和/或导致转录物降解的作用，从而负面调节或抑制靶向基因的表达。在需要RNA依赖性RNA聚合酶引起靶基因抑制的过程中，miRNA前体也可用于植物中以指导siRNA、反式作用siRNA(ta-siRNA)的同相产生。参见例如Allen等,Cell,121:207-221(2005)；Vaucheret,Science STKE,2005:pe43(2005)；和Yoshikawa等,Genes Dev.,19:2164-2175(2005)，所述文献的内容和公开内容通过引用并入本文。
不受任何科学理论的限制，植物miRNA通过识别并结合靶mRNA转录物中的互补或近乎完全互补的序列(miRNA识别位点)，接着通过RNA酶III酶例如ARGONAUTE1切割所述转录物来调控其靶基因。在植物中，通常不容许给定的miRNA识别位点与相应的成熟miRNA之间存在某些错配，特别是在成熟miRNA的10位和11位上错配的核苷酸。成熟miRNA内的位置是以5'至3'方向给出。给定的miRNA识别位点与相应的成熟miRNA之间通常需要在成熟miRNA的10位和11位上实现完全互补性。参见例如Franco-Zorrilla等,(2007)NatureGenetics,39:1033-1037；和Axtell等,(2006)Cell,127:565-577。
许多微RNA基因(MIR基因)已被鉴定并在数据库中公开可用(“miRBase”，可在microrna.sanger.ac.uk/sequences上在线获得；也参见Griffiths-Jones等,(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)。据报道，MIR基因存在于基因间区域中，在基因组中是分开的和成簇的，但也可能完全或部分位于其它基因(蛋白质编码和非蛋白质编码)的内含子中。关于miRNA生物发生的综述，参见Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell.Biol.,6:376-385。MIR基因的转录至少在一些情况下可受MIR基因自身启动子的促进控制。被称为“pri-miRNA”的主要转录物可能相当大(若干千碱基)并且可以是多顺反子的，其含有一个或多个pre-miRNA(含有茎-环排列的折回结构，其被加工成成熟miRNA)以及mRNA常见的5'“帽”和聚腺苷酸化尾。参见例如Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell.Biol.,6:376-385中的图1。
miRNA(无论是天然存在的序列还是人工序列)的转基因表达可用于调控miRNA的一个或多个靶基因的表达。已经在mRNA的所有区域(包括5'非翻译区、编码区、内含子区和3'非翻译区)中验证了miRNA的识别位点，表明miRNA靶标或识别位点相对于编码序列的位置可能不一定影响抑制(参见例如Jones-Rhoades和Bartel(2004).Mol.Cell,14:787-799；Rhoades等,(2002)Cell,110:513-520；Allen等,(2004)Nat.Genet.,36:1282-1290；Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell,16:2001-2019)。miRNA是真核生物中的重要调控元件，并且使用miRNA进行转基因抑制是操纵生物学途径和应答的有用工具。在美国专利申请公开第2006/0200878号中提供了对天然miRNA、其前体、识别位点和启动子的描述，所述美国专利申请公开的内容和公开内容通过引用并入本文。
设计人工miRNA序列可通过用与预期靶标互补的序列取代miRNA前体茎区域中的核苷酸来实现，如例如Zeng等,(2002)Mol.Cell,9:1327-1333所述。根据许多方面，靶标可以是GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的序列。用于确定天然miRNA序列中的核苷酸变化以产生用于所关注靶标的工程改造miRNA前体的通用方法的一个非限制性实例包括以下步骤：(a)选择对靶基因具特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，例如通过使用序列比对工具例如BLAST(参见例如Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410；Altschul等,(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)；cDNA和/或基因组DNA序列可用于鉴定目标转录物直系同源物以及与无关基因的任何潜在匹配，从而避免非靶序列的无意沉默或抑制；(b)分析靶基因是否存在不希望的序列(例如，与非靶物种的序列匹配)，并针对GC含量、雷诺分数(参见Reynolds等,(2004)Nature Biotechnol.,22:326-330)，以及通过自由能的负差(“ΔΔG”)表征的功能性不对称(参见Khvorova等,(2003)Cell,115:209-216)对每个潜在靶序列进行评分。优选地，可选择具有全部或大多数以下特征的靶序列(例如19聚体)：(1)雷诺分数>4，(2)GC含量在约40％至约60％之间，(3)负ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)缺乏4个或更多个相同核苷酸的连续延伸；(6)位置接近靶基因3'末端；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。在一个方面，此处用于抑制靶基因(例如，GA20或GA3氧化酶基因)的非编码RNA分子被设计成具有表现出一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个上述特征的靶序列。抑制元件的每隔两个核苷酸的位置对于影响RNAi功效可能是重要的；例如，算法“siExplorer”在rna.chem.t.u-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm上公开可用(参见Katoh和Suzuki(2007)Nucleic Acids Res.,10.1093/nar/gkl1120)；(c)确定所选靶序列(例如19聚体)的反向互补序列以用于制备经修饰的成熟miRNA。相对于19聚体序列，可将20位的其它核苷酸与选定的靶标或识别序列匹配，并且可将21位的核苷酸选择为非配对以防止靶转录物上沉默的扩散或选择为与靶序列配对以促进靶转录物上沉默的扩散；以及(d)将人工miRNA转化到植物中。
可将超过一个的GA氧化酶靶标的多个有义和/或反义抑制元件串联连续排列或排列成串联区段或重复序列(例如串联反向重复序列)，其也可被一个或多个间隔序列中断，并且每个抑制元件的序列可靶向一种或多种GA氧化酶基因。此外，取决于抑制元件的序列和长度，抑制元件的有义或反义序列可与靶向GA氧化酶基因序列不完全匹配或互补。长度为约19个核苷酸至约27个核苷酸的甚至更短的RNAi抑制元件可具有一个或多个错配或非互补碱基，但仍有效抑制靶GA氧化酶基因。因此，有义或反义抑制元件序列可分别与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的相应序列或其互补序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
为了使用反向重复序列或转录的dsRNA抑制一种或多种GA氧化酶基因，可转录DNA序列或抑制元件可包括包含靶向GA氧化酶基因的区段或部分的有义序列和与靶向GA氧化酶基因的区段或部分互补的反义序列，其中所述有义和反义DNA序列串联排列。有义和/或反义序列分别可各自与如上所述的靶向GA氧化酶基因的区段或部分具有小于100％同一性或互补性。有义序列和反义序列可通过间隔序列分开，以使由抑制元件转录的RNA分子在有义序列与反义序列之间形成茎、环或茎-环结构。抑制元件可替代地包括串联排列的多个有义序列和反义序列，所述有义序列和反义序列也可通过一个或多个间隔序列分开。包含多个有义序列和反义序列的此类抑制元件可被排列为一系列有义序列，接着是一系列反义序列，或被排列为一系列串联排列的有义序列和反义序列。或者，一个或多个有义DNA序列可与一个或多个反义序列分开表达(即，一个或多个有义DNA序列可从第一可转录DNA序列表达，并且一个或多个反义DNA序列可从第二可转录DNA序列表达，其中第一可转录DNA序列和第二可转录DNA序列被表达为单独的转录物)。
为了使用微RNA(miRNA)抑制一种或多种GA氧化酶基因，可转录DNA序列或抑制元件可包含来源于病毒或真核生物(例如动物或植物)的天然miRNA序列或从这种天然miRNA序列修饰或衍生的DNA序列。这样的天然或天然来源的miRNA序列可形成折回结构并用作前体miRNA(pre-miRNA)的支架，并且可对应于天然miRNA前体序列的茎区域，例如来自天然(或天然来源的)初级miRNA(pri-miRNA)或pre-miRNA序列。然而，除了这些天然或天然来源的miRNA支架或预加工的序列之外，本发明方面的工程改造的或合成的miRNA还包含与一种或多种靶向GA氧化酶基因的区段或部分相对应的序列。因此，除了预加工的或支架miRNA序列外，抑制元件还可包含与靶向GA氧化酶基因的区段或部分和/或与其互补的序列相对应的有义和/或反义序列，但是可容许一个或多个序列错配。
也可使用一种或多种小干扰RNA(siRNA)来抑制一种或多种GA氧化酶基因。siRNA途径涉及将较长的双链RNA中间体(“RNA双链体”)非阶段性切割成小干扰RNA(siRNA)。siRNA的大小或长度范围为约19至约25个核苷酸或碱基对，但常见的siRNA类包括含有21或24个碱基对的siRNA。因此，可转录DNA序列或抑制元件可编码长度为至少约19至约25个核苷酸(或更多个)的RNA分子，例如长度为至少19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。对于siRNA抑制，可提供重组DNA分子、构建体或载体，其包含可转录DNA序列和编码用于靶向抑制一种或多种GA氧化酶基因的siRNA分子的抑制元件。可转录DNA序列和抑制元件的长度可以是至少19个核苷酸，并具有对应于一种或多种GA氧化酶基因的序列，和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列。
还可使用一种或多种反式作用小干扰RNA(ta-siRNA)来抑制一种或多种GA氧化酶基因。在ta-siRNA途径中，miRNA用于在需要RNA依赖性RNA聚合酶来产生双链RNA前体的过程中引导siRNA初级转录物的同相加工。ta-siRNA的定义是缺乏二级结构，缺乏引发双链RNA产生的miRNA靶位点，需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)并产生具有含2-核苷酸3'悬端的精确匹配双链体的多个精确定相的约21-nt小RNA(参见Allen等,(2005)Cell,121:207-221)。ta-siRNA的大小或长度在约20至约22个核苷酸或碱基对的范围内，但最通常为21个碱基对。因此，本发明的可转录DNA序列或抑制元件可编码长度为至少约20至约22个核苷酸的RNA分子，例如长度为20、21或22个核苷酸。对于ta-siRNA抑制，因此提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含编码用于一种或多种GA氧化酶基因的靶向抑制的ta-siRNA分子的可转录DNA序列或抑制元件。这种可转录DNA序列和抑制元件的长度可为至少20个核苷酸并且具有与一种或多种GA氧化酶基因和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列相对应的序列。对于构建合适的ta-siRNA支架的方法，参见例如美国专利第9,309,512号，其通过引用整体并入本文。
根据本公开的一个方面，产生了经修饰的玉米植物的种子，其中所述种子包含第一表达盒和编码非编码RNA的DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因，或一种或多种突变的或编辑的GA20和/或GA3氧化酶基因，以及第二表达盒和编码一种或多种Moco生物合成多肽的DNA序列。在一个方面，相对于不具有抑制元件、突变或编辑以及Moco生物合成转基因的对照玉米植物，从种子生长的后代植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。在另一方面，从经修饰的玉米植物的种子产生商品或商业产品，其包含第一可转录DNA序列，所述第一可转录DNA序列编码用于抑制一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因或一个或多个突变的或编辑的GA20和/或GA3氧化酶基因的非编码RNA；以及第二DNA序列，所述第二DNA序列编码一种或多种Moco生物合成多肽。
可通过如本文提供的任何合适的转化方法来产生转基因植物，以产生转基因R0植物，然后可将其自交或与其它植物杂交以产生R1种子和以及通过另外的杂交产生的后续子代和种子等等。本公开的方面还包括植物细胞、组织、外植体、植物部分等，其包含一种或多种转基因细胞，所述转基因细胞具有包含编码靶向内源GA3或GA20氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列和编码Moco生物合成多肽的转基因的重组DNA或多核苷酸序列的转化事件或基因组***。
本公开的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分对于转基因事件或在其至少一种植物细胞中的***或靶向基因组编辑事件或突变可以是纯合的或半合的，并且本公开的植物、植物细胞、种子和植物部分可含有这种转基因事件、***突变和/或编辑的任何数量的拷贝。转基因或可转录DNA序列的表达剂量或表达量可通过其接合性和/或拷贝数来改变，这可能会影响转基因植物中表型变化的程度或范围等。
本文提供的转基因植物可包括多种单子叶谷类植物，包括作物植物，例如玉米、小麦、水稻和高粱。实际上，仅使用转基因事件、***或构建体的单个拷贝，本公开的重组DNA分子或构建体可用于在谷类植物如玉米中产生有益性状而没有异型。
本公开的方面还包括用于制备或产生转基因植物的方法，例如通过转化、杂交等，其中所述方法包括将重组DNA分子、构建体或序列引入植物细胞中，然后从转化或编辑的植物细胞再生或发育转基因植物，其可以在有利于转基因事件的选择压力下进行。
本公开提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：向玉米细胞中引入包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的第一重组表达盒，其中所述玉米细胞包含第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列；以及从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
本公开还提供了一种用于产生转基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a)向第一玉米细胞中引入编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因以产生转基因玉米细胞，其中所述第一玉米细胞包含编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因；以及(b)从所述转基因玉米细胞产生转基因玉米植物。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的转基因玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述转基因又不具有所述DNA序列的对照玉米植物，所鉴定的转基因玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
本公开还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，其中所述玉米细胞包含第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
本公开还提供了一种用于产生转基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a)向第一玉米细胞中引入编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因，以产生转基因玉米细胞，其中所述第一玉米细胞包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因；以及(b)从所述转基因玉米细胞产生转基因玉米植物。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的转基因玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述转基因又不具有所述DNA序列的对照玉米植物，所鉴定的转基因玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
本公开还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括向玉米细胞中引入1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因，和2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
本公开还提供了一种用于产生转基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a)向第一玉米细胞中引入1)编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因，和2)编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因，以产生转基因玉米细胞；以及(b)从所述转基因玉米细胞产生转基因玉米植物。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的转基因玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述转基因又不具有所述DNA序列的对照玉米植物，所鉴定的转基因玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
本公开还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因；向步骤(a)的所述玉米细胞中引入第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列以产生经修饰的玉米细胞；以及从步骤(b)的所述经修饰的玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
本公开还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；向步骤(a)的所述玉米细胞中引入第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因，以产生经修饰的玉米细胞；以及从步骤(b)的所述经修饰的玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
本公开还提供了一种用于产生转基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a)向第一玉米细胞中引入编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因，以产生转基因玉米细胞，其中所述第一玉米细胞是基因组编辑的或突变的，并包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因；以及(b)从所述转基因玉米细胞产生转基因玉米植物。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的转基因玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述DNA序列又不具有所述转基因的对照玉米植物，所鉴定的转基因玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
本公开还提供了一种用于产生转基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a)向第一玉米细胞中引入编码一种或多种Moco生物合成多肽的DNA序列，以产生转基因玉米细胞，其中所述第一玉米细胞是基因组编辑的或突变的，并且具有一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因的表达降低；以及(b)从所述转基因玉米细胞产生转基因玉米植物。在一个方面，所述第一玉米细胞在一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因处或附近包含一个或多个突变或编辑(例如，两个或更多个内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因中的突变或编辑)，其中相对于野生型对照，所述内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达降低。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的转基因玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述DNA序列又不具有所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的表达降低的对照玉米植物，所鉴定的转基因玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
本公开还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：使第一经修饰的玉米植物与第二经修饰的玉米植物杂交，其中一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因在所述第一经修饰的玉米植物中的表达或活性相对于野生型对照有所降低，并且其中所述第二经修饰的玉米植物包含重组表达盒，所述重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及产生包含所述重组表达盒并且具有所述一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的表达降低的后代玉米植物。
本公开还提供了一种用于产生转基因玉米植物的方法，所述方法包括(a)将第一玉米植物与第二玉米植物杂交以产生经修饰的玉米植物，其中一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因在所述第一玉米植物中的表达相对于野生型对照有所降低，并且其中所述第二玉米植物包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因；以及(b)产生步骤(a)的所述转基因玉米植物的子代。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的经修饰的玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述转基因又不具有所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的表达降低的对照玉米植物，所鉴定的经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
根据本公开的一个方面，提供了用重组DNA分子或构建体转化细胞、组织或外植体的方法，所述重组DNA分子或构建体包含可操作地连接至一个或多个启动子的DNA序列或转基因，以产生转基因或基因组编辑的细胞。根据本公开的其它方面，提供了用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法，所述重组DNA分子或构建体包含可操作地连接至一个或多个植物可表达启动子的可转录DNA序列或转基因，以产生转基因或基因组编辑的植物或植物细胞。
用重组DNA分子或构建体在植物细胞中转化染色体或质体的多种方法是本领域已知的，其可以根据本公开的方法用于产生转基因植物细胞和植物。根据本方法，可使用本领域已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。
用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化，例如农杆菌介导或根瘤菌(Rhizobium)介导的转化以及微粒轰击介导的转化。在本领域中已知多种方法用于经由细菌介导的转化或微粒轰击用转化载体转化外植体，然后随后培养等，以使这些外植体再生或发育转基因植物。
在一个方面，本公开中所公开的用于产生转基因或经修饰的玉米植物的方法包括经由农杆菌介导的转化获得第一玉米细胞和转基因玉米细胞。
在另一方面，本公开中公开的用于产生转基因或经修饰的玉米植物的方法包括经由微粒轰击介导的转化获得第一玉米细胞和转基因玉米细胞。
在另一方面，本公开中公开的用于产生转基因玉米植物的方法包括：(1)经由定点整合向第一玉米细胞中引入转基因以产生经修饰的或突变的玉米细胞，其中所述转基因编码一种或多种Moco生物合成多肽，以及(2)经由转化向所述经修饰的或突变的玉米细胞中引入可转录DNA序列，以产生转基因玉米细胞，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因的非编码RNA。在一个方面，所述转化可以是农杆菌介导的转化或微粒轰击介导的转化。
在另一方面，本公开中公开的用于产生转基因玉米植物的方法包括：(1)经由基因组编辑获得经修饰的玉米细胞，其中所述经修饰的玉米细胞具有一种或多种GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因的表达降低；以及(2)经由转化向所述经修饰的玉米细胞中引入转基因以产生转基因玉米细胞，其中所述转基因编码一种或多种Moco生物合成多肽。在一个方面，所述转化可以是农杆菌介导的转化或微粒轰击介导的转化。
用于植物转化的其它方法，例如显微注射、电穿孔、真空渗透、压力、超声处理、碳化硅纤维搅动、PEG介导的转化等，也是本领域已知的。通过这些转化方法产生的转基因植物对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的，这取决于所使用的方法和外植体。
转化植物细胞的方法是本领域普通技术人员众所周知的。例如，通过用重组DNA包被的粒子通过微粒轰击来转化植物细胞的具体说明见于美国专利第5,550,318号；第5,538,880号；第6,160,208号；第6,399,861号；和第6,153,812号，并且农杆菌介导的转化描述于美国专利第5,159,135号；第5,824,877号；第5,591,616号；第6,384,301号；第5,750,871号；第5,463,174号；以及第5,188,958号中，所述文献都通过引用并入本文。用于转化植物的其它方法可见于例如《转基因作物植物纲要》(Compendium of Transgenic CropPlants)(2009)Blackwell Publishing。可使用本领域技术人员已知的任何适当方法来用本文提供的任何核酸分子转化植物细胞。
在一个方面，本文描述了经由定点整合将编码一种或多种Moco生物合成多肽的***序列整合到植物细胞的基因组中的方法。这样的方法包括在植物细胞的基因组中产生双链断裂(DSB)，使得***序列整合在DSB的位点处。在一个方面，编码一种或多种Moco生物合成多肽的***/供体序列可以靶向方式整合到DSB位置的细胞基因组中。DSB可在基于CRISPR的基因组编辑系统中通过任何机制产生，包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、重组酶、转座酶和RNA指导的核酸酶(例如Cas9和Cpf1)。
当Cas9切割靶向DNA时，内源双链断裂(DSB)修复机制被激活。DSB可经由非同源末端连接(NHEJ)进行修复，所述方法可将***或缺失(***缺失)并入到靶向基因座中。如果产生了一个靶区域侧翼的两个DSB，则可通过逆转靶向DNA的方向来修复断裂。或者，如果提供了与靶DNA序列具有同源性的供体模板的***序列，则可经由同源性定向修复或同源重组(HR)来修复DSB。这种修复机制允许将***序列精确整合到靶向DNA序列中。
如本文所用，供体模板的“***序列”是设计用于靶向***到植物细胞基因组中的序列，其可以具有任何合适的长度。例如，***序列的长度可以是2至50,000个、2至10,000个、2至5000个、2至1000个、2至500个、2至250个、2至100个、2至50个、2至30个、15至50个、15至100个、15至500个、15至1000个、15至5000个、18至30个、18至26个、20至26个、20至50个、20至100个、20至250个、20至500个、20至1000个、20至5000个、20至10,000个、50至250个、50至500个、50至1000个、50至5000个、50至10,000个、100至250个、100至500个、100至1000个、100至5000个、100至10,000个、250至500个、250至1000个、250至5000个、或250至10,000个核苷酸或碱基对。
根据一些方面，供体模板可以不包含用于***基因组中的序列，而是包含一个或多个同源序列，所述同源序列相对于在植物基因组内靶位点的基因组序列包括一个或多个突变，例如***、缺失、取代等。或者，供体模板可包含不包含编码或可转录DNA序列的序列，其中***序列用于将一个或多个突变引入植物基因组内的靶位点中。
本文提供的供体模板可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个基因或可转录DNA序列。或者，供体模板可以不包含基因。不加限制地，供体模板的基因或可转录DNA序列可包括例如杀虫抗性基因、除草剂耐受基因、氮利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、选择标记基因、RNAi或抑制构建体、位点特异性基因组修饰酶基因、CRISPR/Cas9系统的单指导RNA、基于双生病毒的表达盒或植物病毒表达载体系统。供体模板可包含启动子，例如组织特异性或组织优选的启动子、组成型启动子或诱导型启动子。供体模板可包含前导序列、增强子、启动子、转录起始位点、5'-UTR、一个或多个外显子、一个或多个内含子、转录终止位点、区域或序列、3'-UTR，和/或聚腺苷酸化信号。所述前导序列、增强子和/或启动子可以可操作地连接至编码非编码RNA、指导RNA、mRNA和/或蛋白质的基因或可转录DNA序列。
在一个方面，本公开的供体模板的***序列包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述Moco生物合成多肽与选自由SEQ ID NO:174-177组成的组的序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在一个方面，本公开的供体模板的***序列包含编码大肠杆菌MoaD多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在一个方面，根据本公开中公开的方法产生的“一种或多种经修饰的植物”、“一种或多种经修饰的玉米植物”、“一种或多种转基因植物”或“一种或多种转基因玉米植物”包含：(1)编码用于抑制一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因的非编码RNA的第一可转录DNA序列，和(2)编码一种或多种Moco生物合成多肽的第二DNA序列。
在另一方面，根据本公开中公开的方法产生的“一种或多种经修饰的植物”、“一种或多种经修饰的玉米植物”、“一种或多种转基因植物”或“一种或多种转基因玉米植物”包含：(1)编码一种或多种Moco生物合成多肽的DNA序列，以及(2)相对于野生型对照，一种或多种内源GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因的表达降低。在一个方面，一种或多种内源GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的表达降低是由于在一种或多种内源GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因处或附近的突变或编辑引起的。
通过转化方法产生的转基因或经修饰的植物对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的，这取决于所使用的方法和外植体。还提供了用于表达靶向内源GA氧化酶基因的非编码RNA分子的方法，所述内源GA氧化酶基因用于在一个或多个植物细胞或组织中在植物可表达启动子(例如如本文所提供的组成型、组织特异性、组织优选的、维管和/或叶启动子)的控制下进行抑制。这样的方法可用于产生具有较矮的半矮株型、节间长度减小、秆/茎直径增加和/或改善的抗倒伏性的转基因谷类或玉米植物。相对于野生型或对照植物，这样的转基因谷类或玉米植物还可具有其它有益于产量的性状，例如未成熟折断减少，根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，耐旱性改善，氮利用效率提高，水利用效率提高，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中花色素苷含量和/或面积减少，穗重增加，种子或籽粒数量增加，种子或籽粒重量增加，产量增加和/或收获指数提高。如本文所用，“收获指数”是指收获谷粒的质量除以收获面积上植物的地上生物量的总质量。
或者，可以将本公开的核苷酸序列引入生物体中，并使其与生物体基因组的同源区域进行重组。这样的同源重组方法是本领域普通技术人员众所周知的，并且可用于将本公开的序列稳定地并入生物体中。在一个方面，本公开的核苷酸序列可用于将“敲除突变”引入与本公开的序列共有实质同源性的生物体的特定基因中。敲除突变是基因序列中消除或基本上降低由所述基因编码的产物的功能或水平的任何突变。本公开涵盖涉及转化生物体，接着进行同源重组以将本公开的序列稳定整合到基因组生物体中的方法。本公开特别涉及其中利用本公开的序列改变生物体生长的方法。这样的方法涵盖使用本公开的序列来干扰一种或多种GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的功能。在一个方面，可经由重组将一种或多种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的敲除突变引入玉米细胞中，以减少玉米细胞中一种或多种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的表达。
可按照常规方式使已转化的细胞生长成植物。参见例如McCormick等,(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以使这些植物生长，并用相同的转化株或不同株进行授粉，并鉴定出具有期望表型特征的组成型表达的所得杂种。可以生长两代或更多代，以确保稳定地维持和继承期望表型特征的组成型表达，然后收获种子以确保实现期望表型特征的组成型表达。
在一个方面，用于产生转基因或经修饰的玉米植物的方法还包括在选择剂存在下培养步骤(b)的转基因玉米植物或其植物部分。在另一方面，所述选择剂是卡那霉素。
用于转化的受体细胞或外植体靶标包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、嫩枝细胞、干细胞、荚细胞、花细胞、花序细胞、秆细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、花萼细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、苞芽细胞或维管组织细胞。在另一方面，本公开提供了一种植物叶绿体。在另一方面，本发明提供了一种表皮细胞、气孔细胞、毛状体细胞、根毛细胞、贮藏根细胞或块茎细胞。在另一方面，本公开提供了一种原生质体。在另一方面，本公开提供了一种植物愈伤组织细胞。
靶植物材料或外植体的转化可在营养培养基上的组织培养物中实践，所述培养基例如允许细胞体外生长或细胞培养的营养物的混合物。如本领域中已知，已转化的外植体、细胞或组织可进行另外的培养步骤，例如愈伤组织诱导、选择、再生等。也可在不产生或不使用愈伤组织的情况下进行转化。可根据本领域已知的方法，将含有重组DNA序列***或事件的已转化的细胞、组织或外植体在培养物、插条或土壤中生长、发育或再生成转基因植物。转基因植物可与自身或其它植物进一步杂交，以产生转基因种子和后代。也可通过使包含重组DNA序列或转化事件的第一植物与缺乏***的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将重组DNA构建体或序列引入适合转化的第一植物品系中，然后可将其与第二植物品系杂交以将重组DNA构建体或序列渐渗到第二植物品系中。这些杂交的后代可进一步多次回交成更理想的品系，例如经过6至8代或回交，以产生具有与原始亲本系基本相同的基因型但引入了重组DNA构建体或序列的后代植物。
可再生出可育植物的任何细胞都被认为是用于实施本公开的有用的受体细胞。愈伤组织可从各种组织来源起始，包括但不限于未成熟的胚或胚部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的那些细胞可用作用于转化的受体细胞。用于制备本公开的转基因植物的实用转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚的转化，以及可育转基因植物的随后再生)公开于例如美国专利第6,194,636号和第6,232,526号以及美国专利申请公开2004/0216189，所述文献全部通过引用并入本文。
如本领域已知，已转化的外植体、细胞或组织可进行另外的培养步骤，例如愈伤组织诱导、选择、再生等。含有重组DNA***的已转化细胞、组织或外植体可根据本领域已知的方法在培养物、插条或土壤中生长、发育或再生为转基因植物。在一个方面，本公开提供了并非生殖材料并且不介导植物的自然繁殖的植物细胞。在另一方面，本公开还提供了作为生殖材料并介导植物的自然繁殖的植物细胞。在另一方面，本公开提供了不能经由光合作用维持其自身的植物细胞。在另一方面，本公开提供了体植物细胞。与种系细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
转基因植物可与自身或其它植物进一步杂交，以产生转基因种子和后代。也可通过使包含重组DNA序列或转化事件的第一植物与缺乏***的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将重组DNA构建体或序列引入适合转化的第一植物系中，然后可将其与第二植物系杂交以将重组DNA构建体或序列渐渗到第二植物系中。这些杂交的后代可进一步多次回交成更理想的品系，例如经过6至8代或回交，以产生具有与原始亲本系基本相同的基因型但是引入了重组DNA构建体或序列的后代植物。
本文提供的植物、细胞或外植体可以是优良品种或优良品系。优良品种或优良品系是指因优良农艺性能而进行育种和选择所产生的任何品种。本文提供的植物、细胞或外植体可以是杂种植物、细胞或外植体。如本文所用，“杂种”是通过使来自不同品种、品系或物种的两种植物杂交而产生的，使得后代包含来自每个亲本的遗传材料。技术人员认识到也可以生成更高级的杂种。例如，可通过将品种C与品种D杂交以产生C x D杂种来制备第一杂种，并且可通过将品种E与品种F杂交以产生E x F杂种来制备第二杂种。所述第一杂种和所述第二杂种可进一步杂交以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的更高级的杂种(C x D)x(E x F)。
对于农杆菌介导的转化，转化载体可包含工程改造的转移DNA(或T-DNA)区段或区域，其在至少可转录DNA序列或转基因侧翼具有两个边界序列，即左边界(LB)和右边界(RB)，以使T-DNA***在植物基因组中将产生可转录DNA序列、转基因或表达盒的转化事件。换句话说，转基因、可转录DNA序列、编码位点特异性核酸酶的转基因或表达盒和/或sgRNA或crRNA将位于T-DNA的左边界和右边界之间，可能连同一种或多种其它转基因或表达盒一起，例如植物选择标记转基因和/或可赋予植物以农艺意义的性状或表型的具有农艺意义的一种或多种其它基因。
由于存在选择剂，例如抗生素或除草剂，本公开的转化载体或构建体中的植物选择标记转基因可用于辅助选择已转化的细胞或组织，其中所述植物选择标记转基因提供对选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可偏向或有利于表达植物选择标记基因的转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，例如以增加R0植物中转化细胞或组织的比例。
由于存在选择剂，例如抗生素或除草剂，本公开的转化载体或构建体中的植物选择标记转基因可用于辅助选择已转化的细胞或组织，其中所述植物选择标记转基因提供对选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可偏向或有利于表达植物选择标记基因的转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，例如以增加R0植物中转化细胞或组织的比例。常用的植物选择标记基因包括例如赋予抗生素如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或壮观霉素(aadA)和庆大霉素(aac3和aacC4)以耐受性或抗性的基因，或赋予对除草剂如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或EPSPS)以耐受性或抗性的基因。也可使用植物可筛选标记基因，其提供通过视觉筛选转化体的能力，例如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)，或表达β葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)(其各种显色底物是已知的)的基因。在一些方面，本文提供的载体或多核苷酸包含选自由nptII、aph IV、aadA、aac3、aacC4、bar、pat、DMO、EPSPS、aroA、GFP和GUS组成的组的至少一种选择标记基因。植物转化也可在培养、发育或再生转化的外植体、组织、植物和/或植物部分的一个或多个步骤或阶段中在不存在选择的情况下进行。
本公开的一个方面涉及针对突变、靶向编辑或转基因筛选细胞、组织或植物，以及选择包含靶向编辑或转基因的细胞或植物。可使用本领域常规技术分离核酸。例如，可使用任何方法分离核酸，包括但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链反应(PCR)。常规PCR技术描述于例如PCR Primer:A Laboratory Manual,Dieffenbach和Dveksler编,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1995。重组核酸技术包括例如限制性酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可作为单个核酸分子或作为一系列寡核苷酸化学合成。可通过已知方法，例如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟磷灰石色谱法，从天然来源(例如，生物样品)中纯化多肽。多肽还可例如通过在表达载体中表达核酸来纯化。另外，可通过化学合成获得纯化的多肽。可使用任何适当的方法，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量多肽的纯度。
在一个方面，本公开提供了检测植物细胞中的重组核酸和多肽的方法。不受限制地，还可使用杂交来检测核酸。核酸之间的杂交在Sambrook等,(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY)中详细讨论。
可使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可使用本领域熟知的方法产生对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可使用本领域已知的方法将本文提供的抗体连接至固体支持物，例如微量滴定板。
可使用可检测标记完成(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽的)检测。术语“标记”旨在涵盖直接标记以及间接标记的使用。可检测的标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
可通过本领域普通技术人员已知的任何方法来筛选和选择经修饰的或转基因的植物或植物细胞。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析，用于检测多核苷酸的PCR扩增，Northern印迹，RNA酶保护，引物延伸，用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增，Sanger测序，下一代测序技术(例如，Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)，用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶法测定，标记基因分型，以及蛋白质凝胶电泳，Western印迹，免疫沉淀和酶联免疫测定以检测多肽。其它技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有提及技术的方法是已知的。
相对于野生型或对照植物，具有降低的植株高度和改善的穗部性状的本公开的经修饰的玉米植物可包含通过其它植物诱变技术或基因组编辑引入的突变(例如，***、缺失、取代等)，其中一种或多种GA20或GA3氧化酶基因的表达在经修饰植物的一种或多种组织中降低或消除。相对于野生型或对照植物，具有降低的植株高度和改善的穗部性状的本公开的经修饰的玉米植物可包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因。可通过其它植物诱变技术或基因组编辑来引入转基因。
植物诱变技术(不包括基因组编辑)可包括化学诱变(即，用化学诱变剂处理，例如叠氮化物、羟胺、亚硝酸、吖啶、核苷酸碱基类似物或烷基化剂，例如EMS(甲烷磺酸乙酯)、MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)等)，物理诱变(例如，γ射线、X射线、UV、离子束、其它形式的辐射等)和***诱变(例如，转座子或T-DNA***)。可对植物或各种植物部分、植物组织或植物细胞进行诱变。可再生处理过的植物以收集种子或产生后代植物，并且可将处理过的植物部分、植物组织或植物细胞发育或再生为植物或其它植物组织。用化学或物理诱变技术产生的突变可包括移码、错义或无义突变，导致功能丧失或靶向基因(例如GA3或GA20氧化酶基因)的表达。
一种基因诱变方法称为“TILLING”(用于靶向基因组中的诱导局部损害)，其中在植物细胞或组织中，优选在植物的种子、生殖组织或种系中产生突变，例如，使用诱变剂，例如EMS处理。所得植物生长并自体受精，并且后代用于制备DNA样品。GA20或GA3氧化酶基因的核酸序列的PCR扩增和测序可用于鉴定突变的植物在GA氧化酶基因中是否具有突变。然后可测试GA20或GA3氧化酶基因中具有突变的植物的性状改变，例如植株高度降低。或者，可测试诱变植物的性状改变，例如植株高度降低，然后可使用PCR扩增和GA20或GA3氧化酶基因的核酸序列测序来确定具有改变性状的植物是否也在GA氧化酶基因中具有突变。参见例如Colbert等,2001,Plant Physiol 126:480-484；和McCallum等,2000,Nat.Biotechnol.,18:455-457。TILLING可用于鉴定改变基因表达或由基因编码的蛋白质活性的突变，其可用于在玉米或谷类植物的GA20或GA3氧化酶基因中引入和选择靶向突变。
本公开提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：1)第一表达盒，所述第一表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA20氧化酶或一种或多种GA3氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二表达盒，所述第二表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。在一个方面，所述第一表达盒和所述第二表达盒在转化载体的单个T-DNA区段中。在另一方面，所述第一表达盒和所述第二表达盒在转化载体的两个不同的T-DNA区段中。
在一个方面，可转录DNA序列编码用于抑制GA3氧化酶_1基因、GA3氧化酶_2基因或两者的非编码RNA。在另一方面，可转录DNA序列包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。在另一方面，可转录DNA序列编码非编码RNA，其包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15个连续核苷酸具有80％互补性的序列。
在另一方面，可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因、GA20氧化酶_5基因或它们的组合的非编码RNA。在另一方面，可转录DNA序列包含与SEQID NO:39、53或55的至少15个连续核苷酸具有至少80％互补性的序列。在另一方面，可转录DNA序列编码与SEQ ID NO:40、54或56的至少15个连续核苷酸具有至少80％互补性的序列。
在一个方面，非编码RNA包含与编码玉米植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在另一方面，非编码RNA包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在一个方面，第二表达盒中包含的DNA序列包含编码蛋白质的序列，所述蛋白质具有与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，第二表达盒中包含的DNA序列编码大肠杆菌MoaD多肽。在另一方面，Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％同一性的氨基酸序列。在另一方面，DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％同一性的序列。
本文还提供了一种重组DNA构建体，其包含1)编码用于抑制一种或多种GA20氧化酶或一种或多种GA3氧化酶基因的非编码RNA的第一可转录DNA序列，和2)编码一种或多种Moco生物合成多肽的第二DNA序列。
在一个方面，本公开的重组DNA构建体包含编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA20氧化酶或一种或多种GA3氧化酶基因，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。这种重组DNA构建体可用于转化表达编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因的玉米植物细胞，以产生具有期望性状的转基因玉米植物。在另一方面，与不具有所述转基因和所述DNA序列的对照玉米植物相比，期望性状包括半矮秆和改善的穗部性状。
在一个方面，本公开的重组DNA构建体包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。这样的重组DNA构建体可用于转化具有一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因的表达降低的玉米植物细胞，以产生具有期望性状的转基因玉米植物。在另一方面，与不具有所述DNA序列和一种或多种GA20氧化酶基因和/或GA3氧化酶基因的表达降低的对照玉米植物相比，期望性状包括半矮秆和改善的穗部性状。
本公开还提供了包含重组DNA构建体的转基因玉米植物。在一个方面，第一DNA序列和第二DNA序列在单个T-DNA分子中。在另一方面，第一DNA序列和第二DNA序列在两个不同的T-DNA分子中。在一个方面，第一可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在一个方面，本公开的重组DNA构建体包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA包含与编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。在另一方面，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在另一方面，所述非编码RNA包含与编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。在另一方面，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在另一方面，所述非编码RNA分子包含这样的序列，其(i)与编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQID NO:9具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性；和/或(ii)与编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在另一方面，所述非编码RNA分子包含这样的序列，其(i)与SEQ ID NO:7或8的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性；和/或(ii)与SEQ ID NO:13或14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性。
在另一方面，所述非编码RNA包含与编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在另一方面，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:10或11的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在另一方面，所述非编码RNA包含与编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30或33具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在另一方面，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在一个方面，所述非编码RNA包含与编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30和33中的一者或多者具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在另一方面，所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31和32中的一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
在一个方面，提供了用于抑制玉米或谷类植物中的内源GA氧化酶(或GA氧化酶样)基因的重组DNA分子、载体或构建体，所述重组DNA分子、载体或构建体包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含这样的序列，其(i)与SEQ ID NO:84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、98、99、100、102、103、105、106、107、109、110、111、113、114、115、117、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135和/或137中的任何一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性，和/或(ii)与编码谷类植物中的蛋白质的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性，所述蛋白质与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133和/或136中的任何一者或多者具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。同样，非编码RNA分子可靶向谷类植物中的内源GA氧化酶(或GA氧化酶样)基因，该基因与显示影响玉米植株高度的一种或多种GA氧化酶基因具有同一性百分比。因此，还提供一种非编码RNA分子，其包含与编码谷类植物中的内源蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30和/或33中的任何一者或多者具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。如上所述，所述非编码RNA分子可靶向GA氧化酶(或GA氧化酶样)基因的外显子、内含子和/或UTR序列。
本公开的重组DNA构建体可包含或被包括在用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体中。除了至少一种选择标记基因、至少一种表达盒和/或编码一种或多种位点特异性核酸酶的可转录DNA序列以及任选地一种或多种sgRNA或crRNA以外，本公开的这种转化载体通常还可包含有效转化所必需或有益的序列或元件。
根据本公开的一个方面，合适的组织特异性或组织优选的启动子可包括那些至少在玉米或谷类植物的一个或多个维管和/或叶组织或可能其它组织中驱动或引起其相关联的抑制元件或序列的表达的启动子。
具有组织特异性或组织优选启动子的GA氧化酶抑制元件或构建体的表达也可发生在谷类或玉米植物的维管组织和叶组织之外的其它组织中，但在植物的发育中的生殖组织中(特别是在雌性生殖器官或穗中)的活性GA水平优选不显著降低或受到影响(相对于野生型或对照植物)，使得雌性器官或穗的发育可在转基因植物中正常进行而在穗中没有异型且产量潜力没有损失。
根据一些方面，提供了包含第一可转录DNA序列和第二DNA序列的构建体和转基因，所述第一可转录DNA序列和所述第二DNA序列可操作地连接至组成型或组织特异性或组织优选的启动子，例如维管或叶启动子。
在一个方面，植物可表达启动子是维管启动子。本领域已知的任何维管启动子都可以潜在地用作组织特异性或组织优选的启动子。维管启动子的实例包括RTBV启动子，已知的蔗糖合酶基因启动子，例如玉米蔗糖合酶-1(Sus1或Sh1)启动子，玉米Sh1基因旁系同源物启动子，大麦蔗糖合酶启动子(Ss1)启动子，水稻蔗糖合酶-1(RSs1)启动子或水稻蔗糖合酶-2(RSs2)启动子，已知的蔗糖转运蛋白基因启动子，例如水稻蔗糖转运蛋白启动子(SUT1)，或各种已知的病毒启动子，例如鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子，小麦矮秆双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子，玉蜀黍条纹双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子或水稻黄条纹1(YS1)样或OsYSL2启动子，以及具有类似表达模式的任何上述启动子的任何功能序列部分或截短部分，例如截短的RTBV启动子。
在另一方面，维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQID NO:70或SEQ ID NO:71中的一者或多者或其功能部分具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
在另一方面，所述植物可表达启动子是水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子。在一个方面，所述RTBV启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一者或多者或其功能部分具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
在另一方面，所述植物可表达启动子是叶启动子。本领域已知的任何叶启动子可以潜在地用作组织特异性或组织优选的启动子。叶启动子的实例包括玉米丙酮酸磷酸酯二激酶或PPDK启动子，玉米果糖1,6双磷酸醛缩酶或FDA启动子，和水稻Nadh-Gogat启动子，以及具有类似表达模式的任何上述启动子的任何功能序列部分或截短部分。来自单子叶植物基因的叶启动子的其它实例包括核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCO)或RuBisCO小亚基(RBCS)启动子，叶绿素a/b结合蛋白基因启动子，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子和Myb基因启动子，以及具有类似表达模式的任何这些启动子的任何功能序列部分或截短部分。
在另一方面，叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一者或多者或其功能部分具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
在另一方面，所述植物可表达启动子是组成型启动子。可在单子叶植物例如谷类或玉米植物中使用的组成型启动子的实例包括例如各种肌动蛋白基因启动子，例如水稻肌动蛋白1启动子(参见例如美国专利第5,641,876号)和水稻肌动蛋白2启动子(参见例如美国专利第6,429,357号)，CaMV 35S或19S启动子(参见例如美国专利第5,352,605号)，玉蜀黍泛素启动子(参见例如美国专利第5,510,474号)，薏苡(Coix lacryma-jobi)多聚泛素启动子，水稻或玉蜀黍Gos2启动子(参见例如Pater等,Plant J.,2(6):837-44 1992)，FMV35S启动子(参见例如美国专利第6,372,211号)，双重增强的CMV启动子(参见例如美国专利第5,322,938号)，MMV启动子(参见例如美国专利第6,420,547号)，PCLSV启动子(参见例如美国专利第5,850,019号)，Emu启动子(参见例如Last等,Theor.Appl.Genet.,81:581(1991)；和Mcelroy等,Mol.Gen.Genet.,231:150(1991))，来自玉蜀黍、水稻或其它物种的微管蛋白启动子，胭脂碱合酶(nos)启动子，章鱼碱合酶(ocs)启动子，甘露碱合酶(mas)启动子或植物醇脱氢酶(例如玉蜀黍Adh1)启动子，用以在谷类或玉米植物中提供组成型表达的本领域已知或后期鉴定的任何其它启动子(包括病毒启动子)，可用于单子叶植物或谷类植物的本领域已知的任何其它组成型启动子，以及任何前述启动子的任何功能序列部分或截短部分。
在另一方面，所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ IDNO:83中的一者或多者或其功能部分具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
在植物的一个或多个活性GA产生组织中驱动等其相关联的可转录DNA序列的中度或强烈水平的表达的组织特异性和组织优选的启动子可以是优选的。此外，此类组织特异性和组织优选的启动子应在植物正在生长和/或伸长时的植物发育的一个或多个营养阶段期间驱动等其相关联的可转录DNA序列的表达，所述营养阶段包括以下营养阶段中的一者或多者：VE、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13、V14、Vn、VT，例如至少在V3-V12、V4-V12、V5-V12、V6-V12、V7-V12、V8-V12、V3-V14、V5-V14、V6-V14、V7-V14、V8-V14、V9-V14、V10-V14等期间，或在正发生植物生长和/或伸长时的营养阶段的任何其它范围期间的表达。
根据一个方面，所述植物可表达启动子可优选组成型地或在植物的维管和/或叶组织的至少一部分中驱动表达。驱动靶向玉米中的内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、GA20氧化酶_4基因、GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因或者其它谷类植物中的类似基因和同源物的抑制元件的表达的不同启动子可有效地在不同程度上降低植株高度并提高抗倒伏性，这取决于它们在植物中的具体表达模式和表达强度。然而，由于植物发育期间启动子表达的时空模式，和/或启动子的表达量或强度太低或太弱，在植物中驱动GA20或GA3氧化酶抑制元件表达的一些组织特异性启动子和组织优选启动子可能不会产生矮株型或抗倒伏表型。此外，一些抑制构建体当在植物中表达时可能仅减少而不消除一种或多种靶向GA20或GA3氧化酶基因的表达，因此取决于利用给定启动子的表达模式和强度，利用这种启动子实现的GA20或GA3氧化酶抑制构建体的表达模式和水平可能不足以在植物中产生可观察到的植株高度和抗倒伏性表型。
也可以使用本领域已知的任何其它维管和/或叶启动子，包括来自具有类似表达模式的相同或不同植物物种或病毒的相关基因的启动子序列(例如，蔗糖合酶、蔗糖转运蛋白和病毒基因启动子序列)。还提供了与任何前述序列具高度同源性的启动子序列。维管和/或叶启动子的实例还可包括显示出在谷类或玉米植物的一个或多个维管和/或叶组织中具有表达模式的其它已知的、工程改造的和/或后期鉴定的启动子序列。此外，任何已知的或后期鉴定的组成型启动子也可用于表达GA20氧化酶或GA3氧化酶抑制元件。
根据一些方面，提供了重组表达盒、构建体、转基因和重组DNA供体模板分子，其包含编码可操作地连接至根启动子或胁迫诱导型启动子的Moco生物合成多肽的DNA序列。关于本领域中可用的一些启动子类型和实例的综述或资源，参见例如Lagrimini,L.M.(编辑),Maize:Methods and Protocols(Humana Press),第4章:A Brief History ofPromoter Development for Use in Transgenic Maize Applications,第1676卷,第61-93页(2017)；和Maize Cell Genomics Database(http://maize.jcvi.org/cellgenomics/index.php)，其全部内容和公开内容通过引用并入本文。
在一个方面，将编码Moco生物合成多肽的DNA序列可操作地连接至胁迫诱导型启动子，以在胁迫条件下驱动基因表达。在非胁迫条件(例如充分浇水的条件)下，这些启动子将基因表达驱动至非常低或不可检测的水平。胁迫诱导型启动子可用于指导基因或核苷酸序列(例如编码Moco生物合成多肽的DNA序列)的表达，以在胁迫例如缺水、营养素或其它环境胁迫的条件下表达。胁迫诱导型启动子是指响应于一种或多种胁迫条件(例如缺水胁迫、营养素或氮缺乏胁迫或其它环境胁迫)而在玉米或玉蜀黍植物的一个或多个组织中引起或驱动与启动子可操作地连接的基因(或转基因)的表达或者增加与启动子可操作地连接的基因(或转基因)的表达的启动子。胁迫诱导型启动子包括任何低氮或氮胁迫启动子和任何低水或干旱诱导型启动子。胁迫诱导型启动子包括响应于胁迫条件(例如缺水胁迫、营养素或氮缺乏胁迫或其它环境胁迫)而在玉米或玉蜀黍种子中引起、驱动或增加或者可以引起、驱动或增加与启动子可操作地连接的基因或转基因的表达的任何启动子，包括来自单子叶植物或禾本科植物例如玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、粟米、高粱、水稻等的任何此类启动子。在一个方面，胁迫诱导型启动子是低氮或氮胁迫诱导型或响应型启动子。低氮或氮胁迫诱导型或响应型启动子可在氮缺乏和/或饥饿下赋予转录。在另一方面，胁迫诱导型启动子是干旱诱导型或响应型启动子。这种启动子可响应于缺水或干旱时期而赋予转录。
根据本发明的实施方案，胁迫诱导型启动子可包括本领域已知的任何响应于胁迫条件(例如缺水胁迫或营养素或氮缺乏胁迫)而在玉米或玉蜀黍植物的一个或多个组织中引起、驱动或增加基因(或转基因)表达的启动子，例如来自以下的启动子：水稻或玉蜀黍RAB17、CA4H、HVA22、HSP17.5、HSP22或HSP16.9基因(参见例如美国专利第8,395,024号和第7,674,952号)，或Dhn基因(参见例如Xiao和Xue,Plant Cell Rep.20:667-673(2001)；和美国专利公开第2017/0318840号)，DREB1或DREB2或ABF3基因(参见例如Liu等,Plant Cell10:1391-1406(1998)；Plant Physiol.138(1):341-351(2005)；和美国专利第7,314,757号)，或HVA1或HVA2基因(参见例如Plant Molecular Biology,26(2):617-630(1994)；和Shen等,Plant Cell,7:295-307(1995))，或任何前述已知的胁迫诱导型启动子的功能部分，或与任何前述已知的种子启动子或其任何功能部分具有至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的启动子序列。所有以上引用的参考文献均通过引用整体并入本文。在另一方面，胁迫诱导型启动子可包含与SEQ ID NO:182-185或其功能部分具有至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。在另一方面，胁迫诱导型启动子来自玉米基因和/或包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。
在一个方面，编码Moco生物合成多肽的DNA序列可操作地连接至根启动子，例如根特异性启动子或根优选启动子。这样的根启动子可在根组织例如根内胚层、根表皮和/或根维管组织中赋予转录。根优选启动子是指在玉米或玉蜀黍植物的一个或多个根组织(例如根内胚层、根表皮、根维管组织等)中优先或主要引起或驱动与所述启动子可操作地连接的基因(或转基因)的表达的启动子，但根优选启动子也可在其它组织中引起或驱动与所述启动子可操作地连接的基因(或转基因)的表达。根特异性启动子是指在玉米植物的一个或多个根组织(例如根内胚层、根表皮、根维管组织等)中特异性地引起或驱动与所述启动子可操作地连接的基因(或转基因)的表达的启动子。如本文所用，“根启动子”是指任何根优选启动子或根特异性启动子。根启动子包括在玉米或玉蜀黍种子中引起或驱动或可以引起或驱动与所述启动子可操作地连接的基因或转基因的根特异性或根优选表达的任何启动子，包括来自单子叶植物或禾本科植物例如玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、粟米、高粱、水稻等的任何此类启动子。
根据本发明的实施方案，根启动子可包括本领域已知的在玉米或玉蜀黍植物的一个或多个根组织中引起或驱动基因(或转基因)表达的任何根启动子，例如CaMV 35S启动子的根特异性亚结构域(例如参见Lam等,PNAS USA,86:7890-7894(1989))或其它根细胞特异性启动子(例如参见Plant Physiol.,93:1203-1211(1990))，YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683、PT0758、PT0613、PT0672、PT0678、PT0688和PT0837启动子之一(参见例如美国专利公开第2008/0131581号)，GL5启动子(参见例如美国专利公开第2007/174938号)，或来自酸性几丁质酶基因、RCc2或RCc3基因的启动子(参见例如美国专利第7,547,774号(水稻)；PCT公开第WO 2009/126470号(粟米)；和Plant Mol Biol.27(2):237-48(1995))，或Zm.PIIG基因(参见例如美国专利第7,491,813号)，或任何前述已知根启动子的功能部分，或与任何前述已知根启动子或其任何功能部分具有至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的启动子序列。在另一方面，根启动子包含与SEQ ID NO:178-181或其功能部分具有至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。
以下是本说明书的示例性启动子。
表3.示例性启动子
除了其相关联的启动子外，可转录DNA序列或转基因还可与一个或多个其它调控元件(例如一个或多个增强子、前导序列、转录起始位点(TSS)、接头、一个或多个5'和3'非翻译区(UTR)、一个或多个内含子、聚腺苷酸化信号、终止区或序列等)可操作地连接，所述调控元件对于加强、调控或允许可转录DNA序列在植物细胞中的表达是合适、必需或优选的。这样一种或多种另外的调控元件可以是任选的和/或用于增强或优化转基因或可转录DNA序列的表达。如本文所提供，“增强子”与“启动子”的区别可在于增强子通常缺乏转录起始位点、TATA盒或等同序列，因此单独不足以驱动转录。如本文所用，“前导序列”通常可定义为处于可转录DNA序列或转基因的蛋白质编码序列起始位点的转录起始位点(TSS)与5'端之间的该基因(或转基因)的5'-UTR的DNA序列。
在一个方面，编码包含在本申请的重组DNA构建体中的一种或多种Moco生物合成多肽的第二DNA序列与植物可表达启动子(例如组成型或组织特异性启动子)可操作地连接。根据一个方面，所述植物可表达启动子是中或高组成型启动子，其中高组成型启动子具有相对更稳固或强烈的组成型表达。在一个方面，所述植物可表达启动子是组成型启动子，其可选自由以下组成的组：肌动蛋白启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子、花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒(PCLSV)启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子或玉蜀黍醇脱氢酶、其功能部分和它们的组合。
在一个方面，产生了包含重组DNA构建体的转化载体。在另一方面，产生了包含重组DNA构建体的转基因玉米植物或其植物部分。在另一方面，相对于既不具有第一可转录DNA序列又不具有第二DNA序列的对照玉米植物，转基因玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
本公开的重组DNA分子或构建体可包含或被包括在用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体中。除了至少一个转基因、表达盒和/或可转录DNA序列之外，这种转化载体通常可包含有效转化所必需或有益的序列或元件。
对于农杆菌介导的、根瘤菌介导的或其它细菌介导的转化，转化载体可包含工程改造的转移DNA(或T-DNA)区段或区域，其在至少可转录DNA序列或转基因侧翼具有两个边界序列，即左边界(LB)和右边界(RB)，以使T-DNA***在植物基因组中将产生可转录DNA序列、转基因或表达盒的转化事件。因此，可转录DNA序列、转基因或表达盒可位于T-DNA的左边界和右边界之间，可能连同一种或多种其它转基因或表达盒一起，例如植物选择标记转基因和/或可赋予植物以农艺意义的性状或表型的具有农艺意义的一种或多种其它基因。根据替代方面，编码靶向用于抑制的内源GA氧化酶基因和植物选择标记转基因(或具有农艺意义的其它基因)的非编码RNA分子的可转录DNA序列、转基因或表达盒可存在于一个或多个相同或不同重组DNA分子上的分开的T-DNA区段中，例如用于共转化。转化载体或构建体还可包含原核维持元件，其可位于载体中T-DNA区域之外。
本公开提供了一种经修饰的玉米植物，其相对于对照植物具有半矮秆表型和一种或多种改善的穗部性状。所述经修饰的玉米植物具有一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因的降低表达，并且包含表达一种或多种Moco生物合成多肽的转基因。在一个方面，一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因的表达降低是由于经由基因组编辑引入的一种或多种GA20氧化酶基因和/或GA3氧化酶基因处或附近的突变或编辑引起的。在另一方面，一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因的表达降低是由于编码非编码RNA的可转录DNA序列的定点整合引起的，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因。在一个方面，定点整合由基因组编辑介导。在一个方面，表达一种或多种Moco生物合成多肽的转基因的引入是由包含转基因的序列的定点整合引起的。在另一方面，定点整合由基因组编辑介导。
在一个方面，本文提供的基因组编辑系统包括CRISPR系统。所述CRISPR系统是基于RNA指导的工程改造核酸酶，该核酸酶使用互补碱基配对来识别靶位点的DNA序列。在一个方面，本文提供的载体可包含编码RNA指导的核酸酶的核酸序列的任何组合。
在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cas9核酸酶。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cas9核酸酶的多核苷酸。在另一方面，本文提供的Cas9核酸酶能够产生靶向的DSB。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cpf1核酸酶。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cpf1核酸酶的多核苷酸。在另一方面，本文提供的Cpf1核酸酶能够产生靶向的DSB。
在一个方面，本文提供的载体或构建体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种位点特异性核酸酶的多核苷酸。在另一方面，本文提供的细胞已包含位点特异性核酸酶。在一个方面，将本文提供的编码位点特异性核酸酶的多核苷酸稳定地转化到细胞中。在另一方面，将本文提供的编码位点特异性核酸酶的多核苷酸瞬时转化到细胞中。在另一方面，编码位点特异性核酸酶的多核苷酸在可调控的启动子、组成型启动子、组织特异性启动子或可用于表达位点特异性核酸酶的任何启动子的控制下。
在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸以及任选地一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个sgRNA的载体提供给植物细胞。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码Cas9核酸酶的多核苷酸以及任选地一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个sgRNA的载体提供给植物细胞。在另一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码Cpf1的多核苷酸以及任选地一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个crRNA的多核苷酸的载体提供给细胞。
在一个方面，载体顺式包含编码位点特异性核酸酶和***序列的盒，使得当与细胞的基因组接触时，所述位点特异性核酸酶能够实现所述***序列的位点特异性整合。在一个方面，第一载体包含编码位点特异性核酸酶的盒，并且第二载体包含***序列，使得当与细胞的基因组接触时，反式提供的位点特异性核酸酶能够实现***序列的位点特异性整合。
本文提供的位点特异性核酸酶可用作靶向编辑技术的一部分。本文提供的方法和/或组合物中使用的位点特异性核酸酶的非限制性实例包括大范围核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，RNA指导的核酸酶(例如Cas9和Cpf1)，重组酶(不限于例如与DNA识别基序连接的丝氨酸重组酶，与DNA识别基序连接的酪氨酸重组酶)，转座酶(不限于例如与DNA结合结构域连接的DNA转座酶)，或其任何组合。在一个方面，本文提供的方法包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种位点特异性核酸酶来诱导在一个、两个、三个、四个、五个或更多个靶位点的一个、两个、三个、四个、五个或更多个DSB。
在一个方面，本文提供的基因组编辑系统(例如，大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、重组酶、转座酶)或本文提供的基因组编辑系统的组合用于向细胞中的基因座引入一个或多个***、缺失、取代或倒位的方法中以引入突变或产生显性负等位基因或显性正等位基因。
位点特异性核酸酶，例如大范围核酸酶，ZFN，TALEN，Argonaute蛋白(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute(TtAgo)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)Argonaute(NgAgo)、其同源物或其修饰形式)，Cas9核酸酶(RNA指导的核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、其同源物或其修饰形式)在基因组序列的靶位点诱导双链DNA断裂，然后通过自然过程修复HR或NHEJ。然后在切割位点发生序列修饰，这可包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的倒位、缺失或***，或通过HR整合核酸序列。
在一个方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、RNA指导的核酸酶、TALE核酸酶、重组酶、转座酶或其任何组合。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。
在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、其同源物或其修饰形式。在另一方面，本文提供的RNA指导的核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。
在另一方面，本文提供的RNA指导的核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、其同源物或其修饰形式。
在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种位点特异性核酸酶。在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种位点特异性核酸酶的多核苷酸。
在一个方面，本文提供的RNA指导的核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、其同源物或其修饰形式，Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、激烈热球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)、其同源物、其修饰形式)，Argonaute蛋白的DNA指导及其任何组合。在另一方面，本文提供的RNA指导的核酸酶选自由Cas9和Cpf1组成的组。
在另一方面，本文提供的RNA指导的核酸酶包含Cas9。在一个方面，本文提供的RNA指导的核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、其同源物或其修饰形式。在一个方面，位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、TtAgo、PfAgo和NgAgo。在另一方面，RNA指导的核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、TtAgo、PfAgo和NgAgo。
靶位点可位于编码前导序列、增强子、转录起始位点、启动子、5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR、聚腺苷酸化位点或终止序列的多核苷酸序列中。应当理解，靶位点也可位于编码前导序列、增强子、转录起始位点、启动子、5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR、聚腺苷酸化位点或终止序列的序列的上游或下游。在一个方面，靶位点位于编码前导序列、增强子、转录起始位点、启动子、5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR、聚腺苷酸化位点、基因或终止序列的多核苷酸的10个核苷酸内、20个核苷酸内、30个核苷酸内、40个核苷酸内、50个核苷酸内、75个核苷酸内、100个核苷酸内、125个核苷酸内、150个核苷酸内、200个核苷酸内、250个核苷酸内、300个核苷酸内、400个核苷酸内、500个核苷酸内、600个核苷酸内、700个核苷酸内、800个核苷酸内、900个核苷酸内、1000个核苷酸内、1250个核苷酸内、1500个核苷酸内、2000个核苷酸内、2500个核苷酸内、5000个核苷酸内、10,000个核苷酸内或25,000个核苷酸内。
在一个方面，被RNA指导的核酸酶结合的靶位点与SEQ ID NO:34、35、36、37或38或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性。
在一个方面，本文所述的靶向基因组编辑技术可包括重组酶的使用。在一个方面，连接至DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一个方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶被栓系于锌指DNA结合结构域。Flp-FRT定点重组系统来自面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的2μ质粒。在该系统中，Flp重组酶(翻转酶)将翻转酶识别靶标(FRT)位点之间的序列重组。FRT位点包含34个核苷酸。Flp结合FRT位点的“臂”(一个臂处于反向)，并在居间核酸序列的任一端切割FRT位点。切割后，Flp将两个FRT位点之间的核酸序列重组。Cre-lox是源自噬菌体P1的定点重组系统，与Flp-FRT重组系统类似。Cre-lox可用于将核酸序列倒位，使核酸序列缺失或将核酸序列易位。在该系统中，Cre重组酶将一对lox核酸序列重组。Lox位点包含34个核苷酸，其中前13个和后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组过程中，Cre重组酶蛋白与不同核酸上的两个lox位点结合，并在lox位点切割。切割的核酸被剪接在一起(相互易位)，并完成重组。在另一方面，本文提供的lox位点是loxP、lox 2272、loxN、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、M2、M3、M7或M11位点。
在另一方面，连接至本文提供的DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶组成的组。在另一方面，连接至本文提供的DNA结合结构域的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组。
几种位点特异性核酸酶(例如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN)不是RNA指导的，而是依靠它们的蛋白质结构来确定其引起DSB或切口的靶位点，或者将它们融合、拴系或附接至DNA结合蛋白结构域或基序。
ZFN是由融合到FokI限制性核酸酶的切割结构域的工程改造锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白。ZFN可被设计成通过锌指DNA结合结构域的修饰来切割双链DNA的几乎任何链段。ZFN从由FokI核酸酶的非特异性DNA切割结构域组成的单体形成二聚体，所述结构域融合到被工程改造以结合靶DNA序列的锌指阵列。
ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列组成。相对于促成与靶DNA的位点特异性结合的锌指∞-螺旋起点的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸可被改变和定制以适应特定靶序列。其它氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。选择ZFN的靶序列的规则是本领域已知的。
FokI核酸酶结构域需要二聚化来切割DNA，因此需要两个带有C末端区域的ZFN来结合切割位点的相反DNA链(分开5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可切割靶位点。如本文所用，术语ZFN是广义的并且包括可在没有另一ZFN帮助的情况下切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN也用于指被工程改造成共同作用以在同一位点切割DNA的一对ZFN的一个或两个成员。
不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性可使用各种方法中的一种重新工程改造，因此定制的ZFN在理论上可被构建成靶向几乎任何靶序列(例如，在植物基因组中的GA氧化酶基因处或附近)。用于工程改造的锌指结构域的公开可用方法包括上下文依赖组装(Context-dependent Assembly，CoDA)、寡聚化库工程(OligomerizedPool Engineering，OPEN)和模块化组装。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一方面，本文提供的ZFN能够产生靶向的DSB或切口。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸的载体提供给细胞。ZFN可作为ZFN蛋白、作为编码ZFN蛋白的多核苷酸和/或作为蛋白质和蛋白质编码多核苷酸的组合引入。
在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一方面，本文提供的ZFN能够产生靶向的DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸的载体提供给细胞。
通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶，例如归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族，是具有高活性和导致靶DNA的位点特异性消化的长识别序列(>14bp)的独特酶。天然存在的大范围核酸酶的工程改造形式通常具有延长的DNA识别序列(例如14至40bp)。根据一些方面，大范围核酸酶可包含选自由I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI组成的组的支架或碱基酶。大范围核酸酶的工程改造可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能交织在单个结构域中。专门的诱变和高通量筛选方法已用于产生识别独特序列并具有改善的核酸酶活性的新型大范围核酸酶变体。因此，大范围核酸酶可经选择或工程改造以结合至植物中的基因组靶序列，例如在GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶。在另一方面，本文提供的大范围核酸酶能够产生靶向的DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶的多核苷酸的载体提供给细胞。
TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。当TALEN对中的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在所述靶位点造成双链DNA断裂。除了野生型FokI切割结构域之外，还设计了具有突变的FokI切割结构域的变体，以提高切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当方向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数以及两个单独TALEN结合位点之间的碱基数都是实现高水平活性的参数。
TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。在一些方面，核酸酶选自由PvuII、MutH、TevI和FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051、Pept071组成的组。当TALEN对中的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在靶位点处造成双链DNA断裂。
如本文所用，术语TALEN是广义的并且包括可在没有另一TALEN帮助的情况下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也用于指共同作用以在同一位点切割DNA的一对TALEN的一个或两个成员。
转录激活因子样效应物(TALE)可以被工程改造为实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白是来源于黄单胞菌属(Xanthomonas)的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。X病原体在感染过程中将TALE分泌到宿主植物细胞中。TALE移至细胞核，在其中识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区域中特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有由33-34个氨基酸的13-28个重复单体组成的中央DNA结合结构域。除了在位置12和13处的高变氨基酸残基外，每个单体的氨基酸都是高度保守的。这两个可变氨基酸被称为重复可变二残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且对RVD的调节可识别连续的DNA碱基。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择包含适当RVD的重复区段的组合来设计特定的DNA结合结构域。
除了野生型FokI切割结构域之外，还设计了具有突变的FokI切割结构域的变体，以提高切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当方向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数以及两个单独TALEN结合位点之间的碱基数都是实现高水平活性的参数。PvuII、MutH和TevI切割结构域是用于TALE的FokI和FokI变体的有用替代物。当与TALE偶联时，PvuII充当高度特异性的切割结构域(参见Yank等,2013.PLoSOne.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等,2013.NucleicAcids Research.41:e83)。TevI在DNA中在靶向位点处引入双链断裂(参见Beurdeley等,2013.Nature Communications.4:1762)。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计蛋白质。例如DNAWorks的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其它方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等,NucleicAcids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。
在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN。在另一方面，本文提供的TALEN能够产生靶向的DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN的多核苷酸的载体提供给细胞。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许对植物基因组中的特定位置进行精确和/或靶向编辑的任何方法、方案或技术(即，该编辑在很大程度上或完全是非随机的)，其使用位点特异性核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶(例如CRISPR/Cas9系统)、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶。
本公开提供了一种经修饰的玉米植物，其包含1)一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因处或附近的一个或多个突变或编辑，其中所述一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达或活性相对于野生型对照植物有所降低，和2)包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。在一个方面，相对于既不包含所述一个或多个突变或编辑又不包含所述重组表达盒的对照玉米植物，经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。在另一方面，一个或多个突变或编辑选自由以下组成的组：***、取代、倒位、缺失、复制和它们的组合。在另一方面，使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶引入一个或多个突变或编辑。
还提供了田间的多个经修饰的玉米植物，每个经修饰的玉米植物在一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因处或附近包含一个或多个突变或编辑，其中一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达相对于野生型对照植物有所降低，以及包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。在一个方面，经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物具有增加的产量。在另一方面，经修饰的玉米植物相比于对照玉米植物的产量增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％或至少25％。在一个方面，这种植物可表达启动子是根启动子，例如根特异性或根优选的启动子。在另一方面，这种植物可表达启动子是胁迫诱导型启动子，例如低氮或氮胁迫诱导型或响应型启动子或者干旱诱导型或响应型启动子。在另一方面，植物可表达启动子包含与SEQID NO:170或其功能部分具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
还提供了一种基因组编辑的或突变的玉米植物，其包含(1)内源GA20氧化酶或GA3氧化酶基因处或附近的突变或编辑，其中相对于野生型对照，所述内源GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的表达降低，和(2)编码Moco生物合成多肽的异源DNA序列。在一个方面，相对于既不包含所述突变又不包含所述异源DNA序列的对照玉米植物，基因组编辑的或突变的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。在一个方面，经由基于CRISPR的基因组编辑系统获得基因组编辑的或突变的玉米细胞。
本公开的方面还包括用于制备或产生经修饰的植物的方法，例如通过基因组编辑、杂交等，其中所述方法包括编辑内源GA3或GA20氧化酶基因的基因组基因座并引入编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因，然后从编辑的植物细胞再生或发育经修饰的植物。
在一个方面，一种方法包括在一种或多种内源GA3或GA20氧化酶基因处或附近经由基于CRISPR的基因组编辑引入突变或编辑，以减少一种或多种内源GA3或GA20氧化酶基因的表达。所述方法包括在植物细胞的基因组中产生双链断裂(DSB)，其中将突变或编辑引入其中，从而减少一种或多种内源GA3或GA20氧化酶基因的表达。在一个方面，可经由RNA指导的核酸酶(例如，Cas9和Cpf1)以靶向方式将突变或编辑产生(或与供体模板整合)到DSB位置的细胞基因组中。在另一方面，指导RNA识别靶位点并与在靶位点处产生DSB的RNA指导的核酸酶结合起作用，其中在靶位点中产生突变或编辑(或与供体模板整合)。在另一方面，靶位点在一种或多种内源GA3或GA20氧化酶基因附近或基因处。
在一个方面，一种方法包括经由定点整合将编码一种或多种Moco生物合成多肽的***序列引入植物细胞的基因组中。这样的方法包括在植物细胞的基因组中产生DSB，使得***序列整合在DSB的位点处。在一个方面，编码一种或多种Moco生物合成多肽的***序列可在基于CRISPR的基因组编辑系统中以靶向方式经由RNA指导的核酸酶(例如，Cas9和Cpf1)***或整合到细胞基因组中的DSB位置。在另一方面，指导RNA识别靶位点并与在靶位点处产生双链断裂的RNA指导的核酸酶结合起作用，其中编码一种或多种Moco生物合成多肽的***序列***或整合到靶位点中。
在一个方面，本公开的供体模板的***序列包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述Moco生物合成多肽序列与选自由SEQ ID NO:174-177组成的组的序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在一个方面，本公开的供体模板的***序列包含编码MoaD多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。在另一方面，本公开的***序列包含编码多肽的DNA序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:168组成的组的多肽或氨基酸序列或其功能片段具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
本公开提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：向玉米细胞中引入包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中所述玉米细胞在一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因中包含一个或多个突变和/或编辑；以及从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述重组表达盒和所述一个或多个突变和/或编辑，并且其中一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因在经修饰的玉米植物中的表达或活性水平相对于不具有所述一个或多个突变和/或编辑的对照植物有所降低。在一个方面，所述方法还包括引入编码靶向一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的指导RNA的重组DNA构建体。在一个方面，这种植物可表达启动子是根启动子，例如根特异性或根优选的启动子。在另一方面，这种植物可表达启动子是胁迫诱导型启动子，例如低氮或氮胁迫诱导型或响应型启动子或者干旱诱导型或响应型启动子。在另一方面，植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
在另一方面，指导RNA包含与一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。在另一方面，在另一方面，指导RNA包含与SEQ ID NO:34、35、36、37或38或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。在一个方面，指导RNA是CRISPR RNA(crRNA)或单链指导RNA(sgRNA)，或指导RNA包含与在一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列紧邻的玉米细胞基因组中存在的前间区序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
还提供了一种用于产生基因组编辑的或突变的玉米植物的方法，所述方法包括：(a)向第一玉米细胞中引入编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因以产生基因组编辑的或突变的玉米细胞，其中所述第一玉米细胞的一种或多种内源GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因的表达相对于野生型对照有所降低；以及(b)从所述基因组编辑的或突变的玉米细胞产生基因组编辑的或突变的玉米植物。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的基因组编辑的或突变的玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述转基因又不具有一种或多种内源GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因的表达降低的对照玉米植物，所鉴定的基因组编辑的或突变的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
在另一方面，步骤(a)的第一玉米细胞是通过提供有第一指导RNA和第一RNA指导的核酸酶而获得，并且其中步骤(b)的基因组编辑的或突变的玉米细胞是通过提供有第二指导RNA、***序列和第二RNA指导的核酸酶而获得。
在另一方面，第一指导RNA识别GA20氧化酶中的靶位点，其中第一指导RNA与在靶位点处产生双链断裂的第一RNA指导的核酸酶结合起作用，并且因此内源GA20氧化酶的表达降低。
在另一方面，所述方法还包括将至少一个***、至少一个取代、至少一个倒位、至少一个缺失、至少一个复制或它们的组合整合到双链断裂中。
在另一方面，第二指导RNA识别靶位点并与第二RNA指导的核酸酶结合起作用，所述第二RNA指导的核酸酶在靶位点处产生双链断裂，其中***序列整合到靶位点中，并且其中供体/***序列编码Moco生物合成多肽，例如MoaD多肽。
本公开提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：在玉米细胞中突变或编辑一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因，其中所述玉米细胞包含编码Moco生物合成多肽的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接；以及从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述重组表达盒和所述一个或多个突变和/或编辑，并且其中一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因在经修饰的玉米植物中的表达或活性水平相对于不具有一个或多个突变和/或编辑的对照植物有所降低。
在一个方面，通过使用选自由RNA指导的核酸内切酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶和转座酶组成的组的位点特异性核酸酶获得突变或编辑。在另一方面，一种方法还包括引入重组DNA构建体，其编码靶向一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的指导RNA。在另一方面，指导RNA包含与一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。
在另一方面，指导RNA包含与SEQ ID NO:34、35、36、37或38或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。在另一方面，指导RNA是CRISPR RNA(crRNA)或单链指导RNA(sgRNA)。在另一方面，指导RNA包含与在一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列紧邻的玉米细胞基因组中存在的前间区序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
还提供了一种用于产生基因组编辑的或突变的玉米植物的方法，所述方法包括：(a)降低一种或多种内源GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因在第一玉米细胞中的表达以产生基因组编辑的或突变的玉米细胞，其中所述第一玉米细胞包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因；以及(b)从所述基因组编辑的或突变的玉米细胞产生基因组编辑的或突变的玉米植物。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的基因组编辑的或突变的玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述转基因又不具有一种或多种内源GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因的表达降低的对照玉米植物，所鉴定的基因组编辑的或突变的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
在一个方面，步骤(a)的第一玉米细胞通过提供有第一指导RNA、***序列和第一RNA指导的核酸酶而获得，并且其中步骤(b)的基因组编辑的或突变的玉米细胞通过提供有第二指导RNA和第二RNA指导的核酸酶而获得。
在另一方面，第一指导RNA识别靶位点并与在靶位点处产生双链断裂的第一RNA指导的核酸酶结合起作用，其中***序列整合到靶位点中，并且其中***序列编码MoaD多肽。
在另一方面，第二指导RNA识别GA20氧化酶中的靶位点，其中第二指导RNA与第二RNA指导的核酸酶结合起作用，所述第二RNA指导的核酸酶在靶位点处产生双链断裂，并且由此内源GA20氧化酶的表达水平降低。
可将gRNA作为gRNA分子或作为包含编码可操作地连接至植物可表达启动子的指导RNA的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体转化或引入到植物细胞或组织中(可能与核酸酶或编码核酸酶的DNA分子、构建体或载体一起)。指导RNA的指导序列的长度可以是至少10个核苷酸，例如长度为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸、或17-25个核苷酸，或者长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。指导序列可与基因组靶位点的DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
为了用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_3基因处或附近进行基因组编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:34或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸(例如SEQ ID NO:34或其互补序列的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
为了用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_4基因处或附近进行基因组编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:38或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸(例如SEQ ID NO:38或其互补序列的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
为了用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_5基因处或附近进行基因组编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:35或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸(例如SEQ ID NO:35或其互补序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
在一个方面，提供了用于靶向内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的指导RNA，其包含与SEQ ID NO:138-167中的任何一者或多者的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。
为了用RNA指导的核酸内切酶在GA3氧化酶_1基因处或附近进行基因组编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:36或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸(例如SEQ ID NO:36或其互补序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
为了用RNA指导的核酸内切酶在GA3氧化酶_2基因处或附近进行基因组编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:37或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸(例如SEQ ID NO:37或其互补序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
在一个方面，指导RNA包含指导序列，所述指导序列与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性。
在一个方面，指导RNA包含与一种或多种内源GA20或GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列紧邻的玉米细胞基因组中存在的前间区序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
除了指导序列之外，指导RNA还可包含一种或多种其它结构或支架序列，其可与RNA指导的核酸内切酶结合或相互作用。这样的支架或结构序列可进一步与其它RNA分子(例如tracrRNA)相互作用。用于设计靶向构建体和指导RNA以用于基因组编辑和使用RNA指导的核酸内切酶在植物基因组内的靶位点处定点整合的方法和技术是本领域已知的。
例如缺失、***、倒位和/或取代的突变可经由DSB或切口的不完全修复而引入靶位点处，以产生GA氧化酶基因的敲除或敲低。即使不使用供体模板分子，也可通过靶向基因座的不完全修复来产生此类突变。GA氧化酶基因的“敲除”可通过在GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口来实现，从而导致GA氧化酶蛋白的不表达或无功能蛋白的表达，而GA氧化酶基因的“敲低”可通过以消除编码的GA氧化酶蛋白功能的方式在不影响GA氧化酶基因的编码序列的位点不完全修复的GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口而以类似方式实现。
例如，内源基因座内的DSB或切口的位点可在GA氧化酶基因的上游或5′区域(例如，启动子和/或增强子序列)，以影响或降低其表达水平。类似地，可用供体模板分子产生GA氧化酶基因的这种靶向的敲除或敲低突变，以经由DSB或切口的修复在靶位点处或附近指导特定或期望的突变。
相对于DSB或切口位点处或附近的靶向基因组序列，供体模板分子可包含同源序列，其具有或不具有***序列并包含一个或多个突变，例如一个或多个缺失、***、倒位和/或取代。例如，可通过使基因的至少一部分缺失或倒位或通过将移码或提前终止密码子引入基因的编码序列中来实现GA氧化酶基因的靶向敲除突变。还可通过在两个靶位点处产生DSB或切口并造成侧翼为靶位点的居间靶区域的缺失来引入GA氧化酶基因的一部分的缺失。
本文提供了用于将***序列定点整合到玉米植物基因组中的重组DNA供体模板分子，其包含***序列和至少一个同源序列，其中所述同源序列与玉米植物细胞基因组中的靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性，并且其中所述***序列包含表达盒，所述表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在一个方面，DNA供体模板分子包含两个同源序列，其中所述两个同源序列在***序列侧翼。在另一方面，所述***序列包含重组DNA构建体或表达盒，其包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，Moco生物合成多肽包括大肠杆菌MoaD多肽。在另一方面，表达盒中包含的DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。在另一方面，Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168或其功能片段具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在另一方面，一种重组DNA构建体或表达盒，其包含编码可操作地连接至植物可表达启动子的Moco生物合成多肽的DNA序列。植物可表达启动子可包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
在另一方面，DNA供体模板分子还包含编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接至启动子。
在一个方面，一种供体模板，其包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性，其中所述靶DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
在另一方面，所述至少一个同源序列与SEQ ID NO:34、35、36、37或38或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性。
在一个方面，一种供体模板，其包括两个同源臂，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含与第一侧翼DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，其中所述第二同源臂包含与第二侧翼DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，并且其中所述第一侧翼DNA序列和所述第二侧翼DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
在另一方面，两个同源臂中的每一者与SEQ ID NO:34、35、36、37或38或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性。
在另一方面，所述方法还包括将至少一个***、至少一个取代、至少一个倒位、至少一个缺失、至少一个复制或它们的组合整合到双链断裂中。
在另一方面，供体模板的***序列包含编码蛋白质的序列，所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:168和174-177组成的组的序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
还提供了一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：(a)将第一玉米植物与第二玉米植物杂交以产生经修饰的玉米植物，其中一种或多种内源GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因在所述第一玉米植物中的表达相对于野生型对照有所降低，并且其中所述第二玉米植物包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因；以及(b)产生步骤(a)的经修饰的玉米植物的子代。在一个方面，所述方法还包括鉴定具有期望性状的经修饰的玉米植物。在另一方面，相对于既不具有所述转基因又不具有一种或多种内源GA3氧化酶基因或GA20氧化酶基因的表达降低的对照玉米植物，所鉴定的经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
在一个方面，靶位点可包含至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少29或至少30个连续核苷酸。
在一个方面，靶位点是GA3氧化酶_1基因。在另一方面，靶位点是GA3氧化酶_2基因。在另一方面，靶位点是GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2基因的组合。在另一方面，靶位点在GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的开放阅读框内。在另一方面，靶位点在GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的启动子/增强子内。在另一方面，靶位点在GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的内含子内。在另一方面，靶位点在GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的5'UTR内。在另一方面，靶位点在GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的3'UTR内。
在一个方面，靶位点是GA20氧化酶_3基因。在另一方面，靶位点是GA20氧化酶_4基因。在另一方面，靶位点是GA20氧化酶_5基因。在另一方面，靶位点是GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因和GA20氧化酶_5基因的组合。在另一方面，靶位点在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4或GA20氧化酶_5基因的开放阅读框内。在另一方面，靶位点在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4或GA20氧化酶_5基因的启动子/增强子内。在另一方面，靶位点在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4或GA20氧化酶_5基因的内含子内。在另一方面，靶位点在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4或GA20氧化酶_5基因的5'UTR内。在另一方面，靶位点在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4或GA20氧化酶_5基因的3'UTR内。
在一个方面，靶位点包含选自由SEQ ID NO:34、35和38组成的组的核苷酸序列。
本文提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个供体分子或模板。“供体模板”可以是单链或双链DNA或RNA分子或质粒。
根据其它方面，供体模板的***序列可包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，所述非编码RNA分子靶向一种或多种GA氧化酶基因，例如GA3氧化酶或GA20氧化酶基因，以进行抑制。在一个方面，编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列选自由SEQ ID NO:35-38组成的组。在另一方面，供体模板的***序列可包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列编码与选自由SEQ ID NO:168和174-177组成的组的序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的蛋白质。在另一方面，供体模板的***序列可包含第一可转录DNA序列，其编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的非编码RNA分子，其中所述第一可转录DNA序列选自由SEQ ID NO:35-38组成的组；并且供体模板的***序列可包含编码一种或多种Moco生物合成多肽的第二DNA序列，其中所述第二DNA序列编码与选自由SEQ ID NO:168和174-177组成的组的序列或其功能片段具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的蛋白质。
本文提供的***序列可具有任何长度。例如，本文提供的供体或***序列的长度为2至50,000个、2至10,000个、2至5000个、2至1000个、2至500个、2至250个、2至100个、2至50个、2至30个、15至50个、15至100个、15至500个、15至1000个、15至5000个、18至30个、18至26个、20至26个、20至50个、20至100个、20至250个、20至500个、20至1000个、20至5000个或20至10,000个核苷酸。
在一个方面，可在不存在供体模板的情况下将序列***由基于CRISPR的基因组编辑系统产生的双链断裂中。在一个方面，可经由不存在供体模板的非同源末端连接(NHEJ)将至少一个***、至少一个取代、至少一个缺失、至少一个复制和/或至少一个倒位***/引入由基于CRISPR的基因组编辑系统产生的双链断裂中。在一个方面，可经由存在供体模板的同源重组(HR)将至少一个***、至少一个取代、至少一个缺失、至少一个复制和/或至少一个倒位***/引入由基于CRISPR的基因组编辑系统产生的双链断裂中。
根据其它方面，至少一个***被整合到GA3氧化酶或GA20氧化酶基因座的双链断裂中，并在其中引入提前终止密码子，其导致GA3氧化酶或GA20氧化酶蛋白的截短并随后抑制了GA3氧化酶或GA20氧化酶基因。在一个方面，至少一个***是单个核碱基***。在另一方面，单个核碱基***选自由鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的组。在一个方面，至少一个***被***到GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的开放阅读框内。在另一方面，至少一个***被***到启动子/增强子、内含子、5′UTR、3′UTR或它们的组合内。
在另一方面，在GA3氧化酶或GA20氧化酶基因座的至少一个***包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少一个8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸或至少20个核苷酸。
根据一个方面，至少一个取代被整合到GA3氧化酶或GA20氧化酶基因座的双链断裂中，其导致GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的抑制。在一个方面，至少一个取代被整合在GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的开放阅读框内。在另一方面，至少一个取代被整合在启动子/增强子、内含子、5′UTR、3′UTR或它们的组合内。
根据一个方面，至少一个缺失被引入GA3氧化酶或GA20氧化酶基因座的双链断裂中，其导致GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的抑制。在一个方面，至少一个缺失被引入GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的开放阅读框内。在另一方面，至少一个缺失被引入启动子/增强子、内含子、5′UTR、3′UTR或它们的组合内。
根据一个方面，至少一个复制被引入GA3氧化酶或GA20氧化酶基因座的双链断裂中，其导致GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的抑制。在一个方面，至少一个复制被引入GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的开放阅读框内。在另一方面，至少一个复制被引入启动子/增强子、内含子、5'UTR、3'UTR或它们的组合内。
根据一个方面，至少一个倒位被整合到GA3氧化酶或GA20氧化酶基因座的双链断裂中，其导致GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的抑制。在一个方面，至少一个倒位被整合到GA3氧化酶或GA20氧化酶基因的开放阅读框内。在另一方面，至少一个倒位被整合到启动子/增强子、内含子、5′UTR、3′UTR或它们的组合内。
根据一个方面，重组DNA构建体或载体可包含编码位点特异性核酸酶的第一多核苷酸序列和编码可经由植物转化技术一起引入植物细胞中的指导RNA的第二多核苷酸序列。或者，可提供两个重组DNA构建体或载体，包括第一重组DNA构建体或载体和第二DNA构建体或载体，其可经由植物转化技术一起或依序引入植物细胞中，其中所述第一重组DNA构建体或载体包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列，并且所述第二重组DNA构建体或载体包含编码指导RNA的多核苷酸序列。
根据一个方面，可经由植物转化技术将包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入植物细胞中，所述植物细胞已经包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用其转化)。或者，可经由植物转化技术将包含编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入植物细胞中，所述植物细胞已经包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用其转化)。根据其它方面，可将包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用其转化)的第一植物与包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用其转化)的第二植物杂交。这样的重组DNA构建体或载体可瞬时转化到植物细胞中或者稳定地转化或整合到植物细胞的基因组中。
在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸以及任选地一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个gRNA的载体提供给植物细胞。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码Cas9核酸酶的多核苷酸以及任选地一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个gRNA的载体提供给植物细胞。在另一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)将包含编码Cpf1的多核苷酸以及任选地一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个crRNA的载体提供给植物细胞。
本文公开的矮秆或半矮秆玉米可具有使其适于谷粒和牧草生产的特性，尤其是在短季节环境中的生产。特别是，在短季节环境中有限的热量单位会降低谷粒产量，并降低给定年份中作物达到生理成熟的可能性。所公开的矮秆或半矮秆玉米植物需要比常规杂种更少的热量单位(例如，需要10％)来达到开花，并且通常比常规品种更早地达到生理成熟。由于较矮的秆和较低的穗位置，本文公开的半矮秆玉米植物不易出现秆和根倒伏。本文所公开的玉米植物由于其高的穗/秸秆比也具有生产高质量草料的潜力。
矮株型或半矮秆玉米植物还可具有一种或多种其它性状，包括但不限于茎直径增加，未成熟折断减少，根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，水利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中花色素苷含量和面积减少，穗重增加，籽粒数量增加，籽粒重量增加，产量增加，种子数量增加，种子重量增加，和多穗性提高，和/或收获指数提高。
根据本公开的方面，提供了具有至少一种有益农艺性状和至少一种基本上或完全没有异型的雌性生殖器官或穗的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的谷类或玉米植物。所述有益的农艺性状可包括但不限于植株高度较矮，一个或多个节间中的节间长度较短，茎或秆直径较大(较粗)，抗倒伏性增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，水利用效率提高，根系较深，叶面积较大，冠层闭合较早和/或可收获产量增加。如本文所用，“收获指数”是指收获谷粒的质量除以收获面积上植物的地上生物量的总质量。
在一个方面，相对于对照玉米植物，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出改善的抗倒伏性、未成熟折断减少或两者。
在一个方面，表现出半矮秆表型的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的成熟时高度相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物降低了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高度为在可比较条件下生长的对照植物的高度的1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至15％、1％至10％、1％至5％、或1％至2％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高度为在可比较条件下生长的对照植物的高度的2％至75％、5％至75％、10％至75％、15％至75％、20％至75％、25％至75％、30％至75％、35％至75％、40％至75％、45％至75％、50％至75％、55％至75％、60％至75％、65％至75％、或70％至75％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高度为在可比较条件下生长的对照植物的高度的2％至70％、5％至65％、10％至60％、15％至55％、20％至50％、25％至45％、或30％至40％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高度为在可比较条件下生长的对照植物的高度的1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、或70％至80％。
在一个方面，转基因的玉米植物或基因组编辑/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物的秆或茎直径增加了至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的秆或茎直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物的秆或茎直径大0.1％至100％、0.2％至100％、0.5％至100％、1％至100％、1.5％至100％、2％至100％、2.5％至100％、3％至100％、3.5％至100％、4％至100％、4.5％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、15％至100％、20％至100％、25％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的秆或茎直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物的秆或茎直径大0.1％至95％、0.1％至90％、0.1％至85％、0.1％至80％、0.1％至75％、0.1％至70％、0.1％至65％、0.1％至60％、0.1％至55％、0.1％至50％、0.1％至45％、0.1％至40％、0.1％至35％、0.1％至30％、0.1％至25％、0.1％至20％、0.1％至15％、0.1％至10％、0.1％至9％、0.1％至8％、0.1％至7％、0.1％至6％、0.1％至5％、0.1％至4.5％、0.1％至4％、0.1％至3.5％、0.1％至3％、0.1％至2.5％、0.1％至2％、0.1％至1.5％、0.1％至1％、0.1％至0.5％、或0.1％至0.2％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的秆或茎直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物的秆或茎直径大0.2％至95％、0.5％至90％、1％至85％、1.5％至80％、2％至75％、2.5％至70％、3％至65％、3.5％至60％、4％至55％、4.5％至50％、5％至45％、6％至40％、7％至35％、8％至30％、9％至25％、或10％至20％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的秆或茎直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物的秆或茎直径大0.1％至1％、1％至5％、6％至10％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、90％至100％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的叶片氮百分比相比于在相同或类似条件下生长的对照植物的叶片氮百分比大0.02％至10％、0.04％至9.5％、0.06％至9.0％、0.08％至8.5％、0.1％至8.0％、0.2％至7.5％、0.3％至7.0％、0.4％至6.5％、0.5％至6.0％、0.6％至5.5％、0.7％至5.0％、0.8％至4.5％、0.9％至4.0％、1.0％至3.5％、1.5％至3.0％、或2.0％至2.5％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的叶片氮百分比相比于在相同或类似条件下生长的对照植物的叶片氮百分比大0.02％至0.04％、0.04％至0.06％、0.06％至0.08％、0.08％至0.1％、0.1％至0.2％、0.2％至0.3％、0.3％至0.4％、0.4％至0.5％、0.5％至0.6％、0.6％至0.7％、0.7％至0.8％、0.8％至0.9％、0.9％至1.0％、1.0％至1.5％、1.5％至2.0％、2.0％至2.5％、2.5％至3.0％、3.0％至3.5％、3.5％至4.0％、4.0％至4.5％、4.5％至5.0％、5.0％至5.5％、5.5％至6.0％、6.0％至6.5％、6.5％至7.0％、7.0％至7.5％、7.5％至8.0％、8.0％至8.5％、8.5％至9.0％、9.0％至9.5％、或9.5％至10.0％。
在一个方面，转基因的玉米植物或基因组编辑的/突变的玉米植物的叶片氮百分比相对于在相同或类似条件下生长的对照玉米植物增加至少0.02％、至少0.04％、至少0.06％、至少0.08％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1.0％、至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5.0％、至少5.5％、至少6.0％、至少6.5％、至少7.0％、至少7.5％、至少8.0％、至少8.5％、至少9.0％、至少9.5％、至少10％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的叶片氮百分比相比于在相同或类似条件下生长的对照玉米植物的叶片氮百分比大0.02％至10％、0.04％至10％、0.06％至10％、0.08％至10％、1.0％至10％、1.5％至10％、2％至10％、2.5％至10％、3％至10％、3.5％至10％、4％至10％、4.5％至10％、5％至10％、5.5％至10％、6％至10％、6.5％至10％、7％至10％、7.5％至10％、8％至10％、8.5％至10％、9％至10％、9.5％至10％。
根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的叶片氮百分比相比于在相同或类似条件下生长的对照玉米植物的叶片氮百分比大0.02％至9.5％、0.02％至9.0％、0.02％至8.5％、0.02％至8.0％、0.02％至7.5％、0.02％至7.0％、0.02％至6.5％、0.02％至6.0％、0.02％至5.5％、0.02％至5.0％、0.02％至4.5％、0.02％至4.0％、0.02％至3.5％、0.02％至3.0％、0.02％至2.5％、0.02％至2.0％、0.02％至1.5％、0.02％至1.0％、0.02％至0.9％、0.02％至0.8％、0.02％至0.7％、0.02％至0.6％、0.02％至0.5％、0.02％至0.4％、0.02％至0.3％、0.02％至0.2％、0.02％至0.1％、0.02％至0.08％、0.02％至0.06％、0.02％至0.04％。
在另一方面，表现出半矮秆表型的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物产量等于或大于在可比较条件下生长的对照植物的产量。
在另一方面，表现出半矮秆表型的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物与对照植物相比需要少约5％、10％、15％、20％或25％的热量单位才能达到开花。
在另一方面，表现出半矮秆表型的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的相对成熟期比在可比较条件下生长的对照植物的相对成熟期少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％的天数。
根据本公开的一个方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高度小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm或小于1000mm并且平均茎直径为至少17.5mm、至少18mm、至少18.5mm、至少19mm、至少19.5mm、至少20mm、至少20.5mm、至少21mm、至少21.5mm或至少22mm。根据另一方面，经修饰的玉米植物还包含至少一个基本上不含成熟雄性生殖组织的穗。
根据本公开的方面，提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物，其在发育的后期营养和/或生殖阶段(例如在R3阶段)的植株高度为1000mm至1800mm、1000mm至1700mm、1050mm至1700mm、1100mm至1700mm、1150mm至1700mm、1200mm至1700mm、1250mm至1700mm、1300mm至1700mm、1350mm至1700mm、1400mm至1700mm、1450mm至1700mm、1000mm至1500mm、1050mm至1500mm、1100mm至1500mm、1150mm至1500mm、1200mm至1500mm、1250mm至1500mm、1300mm至1500mm、1350mm至1500mm、1400mm至1500mm、1450mm至1500mm、1000mm至1600mm、1100mm至1600mm、1200mm至1600mm、1300mm至1600mm、1350mm至1600mm、1400mm至1600mm、1450mm至1600mm、1000mm至2000mm、1200mm至2000mm、1200mm至1800mm、1300mm至1700mm、1400mm至1700mm、1400mm至1600mm、1400mm至1700mm、1400mm至1800mm、1400mm至1900mm、1400mm至2000mm、或1200mm至2500mm，和/或平均茎直径为17.5mm至22mm、18mm至22mm、18.5至22mm、19mm至22mm、19.5mm至22mm、20mm至22mm、20.5mm至22mm、21mm至22mm、21.5mm至22mm、17.5mm至21mm、17.5mm至20mm、17.5mm至19mm、17.5mm至18mm、18mm至21mm、18mm至20mm、或18mm至19mm。经修饰的玉米植物可以基本上没有异型，例如在经修饰的玉米植物的一个或多个穗中的雄性生殖组织或结构。
根据本公开的一个方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高度为1000mm至1600mm、1000mm至1500mm、1050mm至1500mm、1100mm至1500mm、1150mm至1500mm、1200mm至1500mm、1250mm至1500mm、1300mm至1500mm、1350mm至1500mm、1400mm至1500mm、1450mm至1500mm、1000mm至1600mm、1100mm至1600mm、1200mm至1600mm、1300mm至1600mm、或1000mm至1300mm，并且平均茎直径为17.5mm至22mm、18mm至22mm、18.5至22mm、19mm至22mm、19.5mm至22mm、20mm至22mm、20.5mm至22mm、21mm至22mm、21.5mm至22mm、17.5mm至21mm、17.5mm至20mm、17.5mm至19mm、17.5mm至18mm、18mm至21mm、18mm至20mm、或18mm至19mm。根据另一方面，经修饰的玉米植物还包含至少一个基本上不含成熟雄性生殖组织的穗。
根据本公开的一个方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高度比对照植物的高度小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％，并且秆或茎直径比对照植物的茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
根据本发明的一个方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的穗鲜重比对照植物的穗鲜重高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
根据本公开的一个方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物群体的倒伏频率与未经修饰的对照植物群体相比低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的玉米植物群体的倒伏频率与对照植物群体相比低5％至100％、5％至95％、5％至90％、5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、5％至10％、10％至100％、10％至75％、10％至50％、25％至75％、25％至50％、或50％至75％。
根据本公开的一个方面，提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物，其平均节间长度(或相对于穗位置的负-2节间长度和/或负-4节间长度)比对照植物的相同或平均节间长度小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
玉米植物的“负-2节间”是指植物的穗下方的第二节间，并且玉米植物的“负-4节间”是指植物的穗下方的第四节间。根据许多方面，提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物，其平均节间长度(或相对于穗位置的负-2节间长度和/或负-4节间长度)比对照植物的相同或平均节间长度小5％至75％、5％至50％、10％至70％、10％至65％、10％至60％、10％至55％、10％至50％、10％至45％、10％至40％、10％至35％、10％至30％、10％至25％、10％至20％、10％至15％、10％至10％、10％至75％、25％至75％、10％至50％、20％至50％、25％至50％、30％至75％、30％至50％、25％至50％、15％至50％、20％至50％、25％至45％、或30％至45％。
经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的收获指数可比野生型或对照植物的收获指数高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。经修饰的玉米植物的收获指数可比对照植物的收获指数高1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、1％至2％、5％至15％、5％至20％、5％至30％、或5％至40％。
根据本公开的一个方面，提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物，相对于野生型或对照植物，其可收获产量增加至少1蒲式耳/英亩、至少2蒲式耳/英亩、至少3蒲式耳/英亩、至少4蒲式耳/英亩、至少5蒲式耳/英亩、至少6蒲式耳/英亩、至少7蒲式耳/英亩、至少8蒲式耳/英亩、至少9蒲式耳/英亩或至少10蒲式耳/英亩。经修饰的玉米植物的可收获产量增加可为1至10、1至8、2至8、2至6、2至5、2.5至4.5、或3至4蒲式耳/英亩。经修饰的玉米植物的可收获产量相比于野生型或对照植物的可收获产量增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％或至少25％。经修饰的玉米植物的可收获产量比对照植物的可收获产量高1％至25％、1％至20％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、1％至2％、5％至15％、5％至20％、5％至25％、2％至10％、2％至9％、2％至8％、2％至7％、2％至6％、2％至5％、或2％至4％。
根据一个方面，本公开提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的群体，其中所述经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的群体与单个经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物有共同祖先，其中经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物群体的平均高度为1500mm或更小，其中经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物群体的平均秆或茎直径为18mm或更大，其中少于5％、少于10％、少于15％、少于20％或少于25％的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物群体的高度大于1500mm，并且其中少于5％、少于10％、少于15％、少于20％或少于25％的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物群体包含至少一个包含成熟雄性生殖组织的穗。在另一方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物群体的平均高度为1200mm或更小。
根据一个方面，本公开提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的群体，其中所述经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的群体与单个经修饰的玉米植物有共同祖先，其中经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的群体的平均高度为1500mm或更小，其中少于5％、少于10％、少于15％、少于20％或少于25％的经修饰的玉米植物群体的高度大于1500mm，并且其中经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的群体的倒伏频率相比于对照玉米植物群体低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
根据一个方面，本公开提供了一种经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物，其高度为1500mm或更小，其中所述经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物还包含18mm或更大的秆或茎直径，并且其中经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的至少一个穗基本上没有成熟的雄性生殖组织。
根据一个方面，本公开提供了一种经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物，其高度为1500mm或更小，其中所述经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物还包含至少0.58的收获指数，并且其中经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物还包含至少一个基本上没有成熟的雄性生殖组织的穗。
根据本公开的一个方面，提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物，与野生型或对照植物的一或多个相同组织相比，一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质在经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的植物的一种或多种组织(例如一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织)中的表达水平显著降低或消除。在一个方面，一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质或者一种或多种GA氧化酶(或GA氧化酶样)基因转录物和/或蛋白质在经修饰的玉米植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中的水平比在对照玉米或谷类植物的一个或多个相同组织中小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
根据本公开的一个方面，提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的谷物或玉米植物，其具有至少一种有益农艺性状和至少一种基本上或完全没有异型的雌性生殖器官或穗。所述有益农艺性状可包括例如植株高度较矮，一个或多个节间中的节间长度较短，茎或秆直径较大(较粗)，抗倒伏性增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，水利用效率提高，根系较深，叶面积较大，冠层闭合较早和/或可收获产量增加。经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的谷类或玉米植物可具有相对于对照或野生型植物看来正常的雌性生殖器官或穗。实际上，提供了经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的谷物或玉米植物，其包含至少一个不具有或表现出或者实质上或完全没有异型的生殖器官或穗，所述异型包括雄性不育，籽粒或种子数量减少，和/或一个或多个雌性器官或穗中的雄性化结构。
本文提供了在植物的生殖组织中缺乏明显异型的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的谷类或玉米植物。异型可包括雄性(雄穗或花药)不育，籽粒或种子数量减少，和/或植物的雌性器官或穗(例如花药穗)中存在一种或多种雄性化或雄性(或类似雄性的)生殖结构。
如本文所用，如果基于在后期生殖阶段目视检查雌性器官或穗，在植物的雌性器官或穗中不存在或几乎不存在雄性生殖结构，则植物例如玉米的雌性器官或穗“基本上不含”雄性生殖结构。如果通过在后期生殖阶段目视检查雌性器官或穗，在植物(例如玉米植物)的雌性器官或穗中不存在或未观察到或观察不到雄性生殖结构，则所述植物(例如玉米)的雌性器官或穗“完全不含”成熟的雄性生殖结构。
在一个方面，相对于对照玉米植物，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出增加的穗面积。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出穗面积增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相比于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出穗面积大1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、25％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相比于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出穗面积大1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本发明的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗面积比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗面积大2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗面积比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗面积大1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出增加的穗体积。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出穗体积增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗体积比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗体积大1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、25％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗体积比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗体积大1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗体积比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗体积大2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗体积比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗体积大1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出增加的穗直径。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出穗直径为至少0.2％、至少0.4％、至少0.6％、至少0.8％、至少1.0％、至少1.2％、至少1.4％、至少1.6％、至少1.8％、至少2.0％、至少2.2％、至少2.4％、至少2.6％、至少2.8％、至少3.0％、至少3.2％、至少3.4％、至少3.6％、至少3.8％、至少4.0％、至少4.5％、至少5.0％、至少5.5％、至少6.0％、至少6.5％、至少7.0％、至少7.5％、至少8.0％、至少8.5％、至少9.0％、至少9.5％、至少10.0％。
根据本发明的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗直径大0.2％至10.0％、0.4％至10.0％、0.6％至10.0％、0.8％至10.0％、1.0％至10.0％、1.2％至10.0％、1.4％至10.0％、1.6％至10.0％、1.8％至10.0％、2.0％至10.0％、2.2％至10.0％、2.4％至10.0％、2.6％至10.0％、2.8％至10.0％、3.0％至10.0％、3.2％至10.0％、3.4％至10.0％、3.6％至10.0％、3.8％至10.0％、4.0％至10.0％、4.5％至10.0％、5.0％至10.0％、5.5％至10.0％、6.0％至10.0％、6.5％至10.0％、7.0％至10.0％、7.5％至10.0％、8.0％至10.0％、8.5％至10.0％、9.0％至10.0％、或9.5％至10.0％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗直径大0.2％至9.5％、0.2％至9.0％、0.2％至8.5％、0.2％至8.0％、0.2％至7.5％、0.2％至7.0％、0.2％至6.5％、0.2％至6.0％、0.2％至5.5％、0.2％至5.0％、0.2％至4.5％、0.2％至4.0％、0.2％至3.8％、0.2％至3.6％、0.2％至3.4％、0.2％至3.2％、0.2％至3.0％、0.2％至2.8％、0.2％至2.6％、0.2％至2.4％、0.2％至2.2％、0.2％至2.0％、0.2％至1.8％、0.2％至1.6％、0.2％至1.4％、0.2％至1.2％、0.2％至1.0％、0.2％至0.8％、0.2％至0.6％、或0.2％至0.4％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗直径大0.4％至9.5％、0.6％至9.0％、0.8％至8.5％、1.0％至8.0％、1.2％至7.5％、1.4％至7.0％、1.6％至6.5％、1.8％至6.0％、2.0％至5.5％、2.2％至5.0％、2.4％至4.5％、2.6％至4.0％、2.8％至3.8％、3.0％至3.6％、或3.2％至3.4％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗直径比在可比较条件下生长的对照玉米植物大0.2％至0.6％、0.6％至1.0％、1.0％至1.4％、1.4％至1.8％、1.8％至2.2％、2.2％至2.6％、2.6％至3.0％、3.0％至3.5％、3.5％至4.0％、4.0％至4.5％、4.5％至5.0％、5.0％至5.5％、5.5％至6.0％、6.0％至6.5％、6.5％至7.0％、7.0％至7.5％、7.5％至8.0％、8.0％至8.5％、8.5％至9.0％、9.0％至9.5％、或9.5％至10.0％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出增加的穗长。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出穗长增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗长比在可比较条件下生长的玉米植物的穗长大1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、25％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗长比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗长大1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗长比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗长大2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗长比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗长大1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出减少的穗尖空隙。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出穗尖空隙减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗尖空隙比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗尖空隙少1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、25％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗尖空隙比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗尖空隙少1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗尖空隙比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗尖空隙少2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗尖空隙比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗尖空隙少1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出每穗粒数增加。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出每穗粒数增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每穗粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每穗粒数多1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、25％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每穗粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每穗粒数多1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每穗粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每穗粒数多2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每穗粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每穗粒数多1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出增加的单粒重。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出单粒重增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出单粒重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的单粒重高1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、25％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出单粒重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的单粒重高1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出单粒重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的单粒重高2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出单粒重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的单粒重高1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出单粒重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的单粒重高1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、或9％至10％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的穗鲜重。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出穗鲜重增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗鲜重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗鲜重高1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、21％至100％、22％至100％、23％至100％、24％至100％、25％至100％、26％至100％、27％至100％、28％至100％、29％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗鲜重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗鲜重高1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至29％、1％至28％、1％至27％、1％至26％、1％至25％、1％至24％、1％至23％、1％至22％、1％至21％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗鲜重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗鲜重高2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗鲜重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗鲜重高1％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出穗鲜重比在可比较条件下生长的对照玉米植物的穗鲜重高1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、10％至11％、11％至12％、12％至13％、13％至14％、14％至15％、15％至16％、16％至17％、17％至18％、18％至19％、19％至20％、20％至21％、21％至22％、22％至23％、23％至24％、24％至25％、25％至26％、26％至27％、27％至28％、28％至29％、29％至30％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的产量。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于在可比较条件下生长的对照玉米植物表现出产量增加至少1％、至少3％、至少5％、至少7％、至少9％、至少11％、至少13％、至少15％、至少17％、至少19％、至少21％、至少23％、至少25％、至少27％、至少29％、至少31％、至少33％、至少35％、至少37％、至少39％、至少41％、至少43％、至少45％、至少47％、至少49％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出产量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的产量高1％至100％、3％至100％、5％至100％、7％至100％、9％至100％、11％至100％、13％至100％、15％至100％、17％至100％、19％至100％、21％至100％、23％至100％、25％至100％、27％至100％、29％至100％、31％至100％、33％至100％、35％至100％、37％至100％、39％至100％、41％至100％、43％至100％、45％至100％、47％至100％、49％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出产量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的产量高1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至49％、1％至47％、1％至45％、1％至43％、1％至41％、1％至39％、1％至37％、1％至35％、1％至33％、1％至31％、1％至29％、1％至27％、1％至25％、1％至23％、1％至21％、1％至19％、1％至17％、1％至15％、1％至13％、1％至11％、1％至9％、1％至7％、1％至5％、或1％至3％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出产量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的产量高3％至95％、5％至90％、7％至85％、9％至80％、11％至75％、13％至70％、15％至65％、17％至60％、19％至55％、21％至50％、23％至49％、25％至47％、27％至45％、29％至43％、31％至41％、33％至39％、或35％至37％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出产量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的产量高1％至7％、7％至13％、13％至19％、19％至25％、25％至31％、31％至37％、37％至43％、43％至49％、49％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、或95％至100％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出每田地面积粒数增加。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出每田地面积粒数增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每田地面积粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每田地面积粒数多1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、21％至100％、22％至100％、23％至100％、24％至100％、25％至100％、26％至100％、27％至100％、28％至100％、29％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每田地面积粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每田地面积粒数多1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至29％、1％至28％、1％至27％、1％至26％、1％至25％、1％至24％、1％至23％、1％至22％、1％至21％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每田地面积粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每田地面积粒数多2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每田地面积粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每田地面积粒数多1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出每田地面积粒数比在可比较条件下生长的对照玉米植物的每田地面积粒数多1％至3％、3％至5％、5％至7％、7％至9％、9％至11％、11％至13％、13％至15％、15％至17％、17％至19％、19％至21％、21％至23％、23％至25％、25％至27％、27％至29％、或29％至30％。
在一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出小花数量增加。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物相对于对照玉米植物表现出小花数量增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出小花数量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的小花数量多1％至100％、2％至100％、3％至100％、4％至100％、5％至100％、6％至100％、7％至100％、8％至100％、9％至100％、10％至100％、11％至100％、12％至100％、13％至100％、14％至100％、15％至100％、16％至100％、17％至100％、18％至100％、19％至100％、20％至100％、21％至100％、22％至100％、23％至100％、24％至100％、25％至100％、26％至100％、27％至100％、28％至100％、29％至100％、30％至100％、35％至100％、40％至100％、45％至100％、50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出小花数量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的小花数量多1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至29％、1％至28％、1％至27％、1％至26％、1％至25％、1％至24％、1％至23％、1％至22％、1％至21％、1％至20％、1％至19％、1％至18％、1％至17％、1％至16％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出小花数量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的小花数量多2％至90％、3％至85％、4％至80％、5％至75％、6％至70％、7％至65％、8％至60％、9％至55％、10％至50％、11％至45％、12％至40％、13％至35％、14％至30％、或15％至25％。
根据本公开的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出小花数量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的小花数量多1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
根据本发明的一个方面，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出小花数量比在可比较条件下生长的对照玉米植物的小花数量多1％至3％、3％至5％、5％至7％、7％至9％、9％至11％、11％至13％、13％至15％、15％至17％、17％至19％、19％至21％、21％至23％、23％至25％、25％至27％、27％至29％、或29％至30％。
本公开中公开的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物可显示正性状相互作用，其中由于存在第二转基因(或突变或编辑)，例如可归因于转基因(或突变或编辑)的正或负性状的性状可被增强、性能提高、中和、抵消或缓解。与仅包含一个转基因(或突变或编辑)的对照玉米植物相比，这样的转基因的和/或基因组编辑的/突变的玉米植物可表现出改善的穗部性状。例如，在增加的穗直径、单粒重、穗鲜重和/或产量方面，相对于MoaD单株和/或GA20Ox_SUP单株植物，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物可具有增强的性状和/或正性状相互作用。在另一方面，相对于对照玉米植物，本公开的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中花色素苷含量和面积减少，穗重增加，收获指数提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
在另一方面，本公开的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何明显的异型。
根据本公开的一个方面，相对于对照玉米植物，经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物对选自由衰老、延迟开花、真菌感染和它们的组合组成的组的性状或表型不具有不利影响或具有降低的不利影响。
矮株型或半矮秆玉米植物还可具有一种或多种其它性状，包括茎直径增加，未成熟折断减少，根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，水利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中花色素苷的含量和面积降低，穗重增加，籽粒数量增加，籽粒重量增加，产量增加和/或收获指数提高。
根据本公开的一个方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的收获指数为至少0.57、至少0.58、至少0.59、至少0.60、至少0.61、至少0.62、至少0.63、至少0.64或至少0.65。根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的收获指数为0.57至0.65、0.57至0.64、0.57至0.63、0.57至0.62、0.57至0.61、0.57至0.60、0.57至0.59、0.57至0.58、0.58至0.65、0.59至0.65、或0.60至0.65。根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的收获指数与未经修饰的对照植物相比高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。根据本公开的另一方面，本文提供的经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的收获指数与对照植物相比高1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、1％至2％、5％至15％、5％至20％、5％至30％、或5％至40％。
根据本公开的另一方面，提供了用于在田间以正常/标准或高密度种植本文提供的一种或多种经修饰的或转基因的植物的方法。根据一些方面，可通过在田间以更高的密度种植本公开的一种或多种经修饰的或转基因的植物来增加每英亩(或每土地面积)的作物植物的产量。如本文所述，表达编码靶向一种或多种内源GA20和/或GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列和编码一种或多种Moco生物合成多肽的转基因的经修饰的或转基因的植物可具有降低的植株高度，较短的节间，增加的秆/茎直径和/或增加的抗倒伏性。本文所述的经修饰的或转基因的植物可耐受高密度种植条件，因为茎直径的增加可抵抗倒伏，并且较矮的植株高度可允许在高密度种植条件下增加对较低叶片的透光性。因此，本文提供的经修饰的或转基因的植物可以更高的密度种植，以增加田间每英亩(或土地面积)的产量。对于行播作物，可通过在每行长度上种植更大数量的种子/植物和/或通过减小行间距来实现更高的密度。在一个方面，用于经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高密度种植的行距小于或等于40英寸。在一个方面，用于经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高密度种植的行距小于或等于30英寸。在另一方面，用于经修饰的、转基因的或基因组编辑的/突变的玉米植物的高密度种植的行距小于或等于20英寸。
根据一个方面，经修饰的或转基因的作物植物的种子可以比根据标准农艺实践的所述作物植物的正常种植密度高至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％的田间密度(每土地/田地面积的植株数)进行种植。经修饰的或转基因的作物植物可以至少38,000株植物/英亩、至少40,000株植物/英亩、至少42,000株植物/英亩、至少44,000株植物/英亩、至少45,000株植物/英亩、至少46,000株植物/英亩、至少48,000株植物/英亩、50,000株植物/英亩、至少52,000株植物/英亩、至少54,000株植物/英亩或至少56,000株植物/英亩的田间密度种植。
举例来说，玉米植物的种子可以更高的密度种植，例如密度范围为约38,000株植物/英亩至约60,000株植物/英亩、或约40,000株植物/英亩至约58,000株植物/英亩、或约42,000株植物/英亩至约58,000株植物/英亩、或约40,000株植物/英亩至约45,000株植物/英亩、或约45,000株植物/英亩至约50,000株植物/英亩、或约50,000株植物/英亩至约58,000株植物/英亩、或约52,000株植物/英亩至约56,000株植物/英亩、或约38,000株植物/英亩、约42,000株植物/英亩、约46,000株植物/英亩、或约48,000株植物/英亩、约50,000株植物/英亩、或约52,000株植物/英亩、或约54,000株植物/英亩，与例如约18,000株植物/英亩至约38,000株植物/英亩的标准密度范围形成对照。
本说明书提供了一种重组DNA分子或构建体，所述重组DNA分子或构建体包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:170具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:170的序列；c)SEQ ID NO:170的功能部分，其中所述功能部分具有基因调控活性；和d)与c)中的所述功能部分具有至少85％序列同一性的序列；其中所述序列与异源可转录DNA序列可操作地连接。
在一个方面，重组DNA分子或构建体中包含的序列与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
在另一方面，重组DNA分子或构建体中包含的序列与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
在一个方面，重组DNA分子或构建体还包含一个或多个序列，所述序列中的每一者与选自由SEQ ID NO:171-173和它们的组合组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
在一个方面，重组DNA分子或构建体中包含的异源可转录DNA序列与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
在一个方面，提供了一种植物，所述植物包含本文所述的启动子，例如可操作地连接至能够向植物提供有益农艺性状的异源可转录DNA序列的SEQ ID NO.170或其功能部分。或者，这样的启动子可与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。实际上，这样的植物可具有一种或多种有益的农艺性状。一些有益的农艺性状包括但不限于除草剂耐受性，昆虫防治，改善或提高的产量，真菌病抗性，病毒抗性，线虫抗性，细菌病抗性，植物生长和发育，淀粉产生，改善的油产生，高油产生，改善的脂肪酸含量，高蛋白质产生，果实成熟，增强的动物和人类营养，生物聚合物，环境胁迫抗性，药物肽和分泌肽，改善的加工性状，改善的可消化性，酶产生，风味，固氮，杂交种子产生，纤维产生和生物燃料产生。在一个方面，提供了一种核酸分子或包含这种分子的植物，其中所述分子包含可操作地连接至异源序列的本文所述的启动子(例如，与SEQ ID NO.170或其功能部分具有至少80％的序列同一性)，所述异源序列赋予所关注的性状，所述性状选自由以下组成的组：产量、广亩产量、氮利用效率、磷利用效率、水利用效率以及营养素可用性和利用率。
可转录DNA序列通常可以是需要表达RNA转录物的任何DNA序列。RNA转录物的这种表达可导致所得mRNA分子的翻译并因此导致蛋白质表达。或者，可设计可转录DNA序列以最终引起特定基因或蛋白质表达的降低，例如经由RNA干扰以引起一种或多种靶基因的抑制。可转录DNA序列可编码靶向抑制基因的RNA分子，例如经由反义RNA、双链RNA(dsRNA)或反向重复RNA序列的表达，或经由通过小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)或微RNA(miRNA)等的表达进行的共抑制或RNA干扰(RNAi)。
在另一方面，提供了一种DNA构建体或含有这种DNA构建体的植物，其中所述DNA构建体包含可操作地连接至可能是具有农艺意义的基因的异源可转录DNA序列的本文所述的启动子(例如，与SEQ ID NO.170或其功能部分具有至少80％同一性的序列)。如本文所用，术语“具有农艺意义的基因”是指当在特定植物组织、细胞或细胞类型中表达时提供与植物形态、生理学、生长、发育、产量、产物、营养概况、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性相关的期望特征的可转录DNA序列。具有农艺意义的基因包括但不限于编码以下物质的基因：产量蛋白，胁迫抗性蛋白，发育控制蛋白，组织分化蛋白，除草剂抗性蛋白，疾病抗性蛋白，脂肪酸生物合成酶，生育酚生物合成酶，氨基酸生物合成酶，杀虫蛋白，或靶向特定基因以进行抑制的任何其它试剂如反义、dsRNA或其它RNA分子。具有农艺意义的基因的产物可在植物内起作用以对植物的生理学或代谢产生影响，或者在害虫防治中充当杀虫剂。
示例性实施方案
以下是本说明书的示例性实施方案。
1.一种经修饰的玉米植物或其植物部分，所述经修饰的玉米植物或其植物部分包含：1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种赤霉酸20(GA20)氧化酶基因和/或一种或多种赤霉酸3(GA3)氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码钼辅因子(Moco)生物合成多肽的DNA序列。
2.如实施方案1所述的经修饰的玉米植物，其中所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒被稳定整合到所述玉米植物或其植物部分的基因组中。
3.如实施方案1所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于不具有所述第一重组表达盒或所述第二重组表达盒的对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
4.如实施方案1至3所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA3氧化酶基因的非编码RNA。
5.如实施方案4所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA3氧化酶_1基因、GA3氧化酶_2基因或两者的非编码RNA。
6.如实施方案5所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
7.如实施方案5所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列编码非编码RNA，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15个连续核苷酸具有80％互补性的序列。
8.如实施方案1至3所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶基因的非编码RNA。
9.如实施方案8所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因、GA20氧化酶_5基因或它们的组合的非编码RNA。
10.如实施方案8所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_5基因或两者的非编码RNA。
11.如实施方案10所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列包含与SEQ ID NO:39、53或55的至少15个连续核苷酸具有至少60％同一性或互补性的序列。
12.如实施方案10所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列编码与SEQ ID NO:40、54或56的至少15个连续核苷酸具有至少60％同一性或互补性的序列。
13.如实施方案4至10中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述非编码RNA包含与编码玉米植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
14.如实施方案4至10中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
15.如实施方案1、2或3所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列。
16.如实施方案15所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
17.如实施方案1至3中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述Moco生物合成多肽包括大肠埃希氏菌(大肠杆菌)MoaD多肽。
18.如实施方案1至16中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第二重组表达盒中包含的所述DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
19.如实施方案1至16中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
20.如实施方案1或3所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中在所述经修饰的玉米植物或其植物部分中内源GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的表达水平降低或消除。
21.如实施方案1或3所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述可转录DNA序列与异源植物可表达启动子可操作地连接。
22.如实施方案21所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述异源植物可表达启动子是维管启动子。
23.如实施方案22所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述维管启动子选自由以下组成的组：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮秆双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉蜀黍条纹双生病毒(MSV)外壳多肽(CP)启动子、水稻黄条纹1(YS1)样启动子、水稻黄条纹2(OsYSL2)启动子和它们的组合。
24.如实施方案23所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
25.如实施方案21所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述异源植物可表达启动子是水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子。
26.如实施方案25所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中RTBV启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
27.如实施方案21所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述异源植物可表达启动子是叶启动子。
28.如实施方案27所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述叶启动子选自由以下组成的组：RuBisCO启动子、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)启动子、果糖1-6双磷酸醛缩酶(FDA)启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合多肽基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、Myb基因启动子和它们的组合。
29.如实施方案28所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
30.如实施方案21所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述异源植物可表达启动子是组成型启动子。
31.如实施方案30所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：肌动蛋白启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子、花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒(PCLSV)启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子或玉蜀黍醇脱氢酶、其功能部分和它们的组合。
32.如实施方案31所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
33.如实施方案1或3所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述非编码RNA是能够被加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
34.如实施方案1或3所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第二重组表达盒中包含的所述DNA序列与异源植物可表达启动子可操作地连接。
35.如实施方案34所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述异源植物可表达启动子是根启动子或胁迫诱导型启动子。
36.如实施方案34所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述异源植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
37.如实施方案1至36中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的成熟时高度降低至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
38.如实施方案1至37中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的秆或茎直径增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
39.如实施方案1至38中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出改善的抗倒伏性、未成熟折断减少或两者。
40.如实施方案1至39所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出增加的穗直径。
41.如实施方案40所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出穗直径增加至少0.2％、至少0.4％、至少0.6％、至少0.8％、至少1.0％、至少1.2％、至少1.4％、至少1.6％、至少1.8％、至少2.0％、至少2.2％、至少2.4％、至少2.6％、至少2.8％、至少3.0％、至少3.2％、至少3.4％、至少3.6％、至少3.8％或至少4.0％。
42.如实施方案1至41所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出增加的单粒重。
43.如实施方案42所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出单粒重增加至少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％。
44.如实施方案1至43中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出增加的穗鲜重。
45.如实施方案44所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出穗鲜重增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％或至少30％。
46.如实施方案1至45中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出增加的产量。
47.如实施方案46所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出产量增加至少1％、至少3％、至少5％、至少7％、至少9％、至少11％、至少13％、至少15％、至少17％、至少19％、至少21％、至少23％、至少25％、至少27％、至少29％、至少31％、至少33％、至少35％、至少37％、至少39％、至少41％、至少43％或至少45％。
48.如实施方案1至47中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中的花色素苷含量和面积降低，穗重增加，收获指数提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
49.如实施方案1至48中任一项所述的经修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰的玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何明显的异型。
50.一种如实施方案1至49中任一项所述的经修饰的玉米植物的种子，其中所述种子包含第一重组表达盒和第二重组表达盒。
51.如实施方案50所述的种子，其中相对于不包含所述第一重组表达盒或所述第二重组表达盒的对照玉米植物，从所述种子生长的后代植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
52.一种从如实施方案50所述的种子生产的商品或商业产品，所述商品或商业产品包含第一DNA序列重组表达盒和第二DNA序列重组表达盒。
53.一种方法，所述方法包括将如实施方案50所述的种子种植在生长培养基或土壤中。
54.如实施方案53所述的方法，所述方法还包括以小于或等于40英寸的行间距种植多个种子。
55.如实施方案53所述的方法，所述方法还包括以小于或等于30英寸的行间距种植多个种子。
56.如实施方案55所述的方法，其中所述行间距小于或等于20英寸。
57.如实施方案53所述的方法，所述方法还包括从所述种子生长玉米植物。
58.如实施方案57所述的方法，所述方法还包括从所述玉米植物收获种子。
59.如实施方案55至58中任一项所述的方法，其中所述种子以选自由以下组成的组的密度种植：至少38,000株植物/英亩、至少40,000株植物/英亩、至少42,000株植物/英亩、至少44,000株植物/英亩、至少45,000株植物/英亩、至少46,000株植物/英亩、至少48,000株植物/英亩、50,000株植物/英亩、至少52,000株植物/英亩、至少54,000株植物/英亩和至少56,000株植物/英亩。
60.田间的多个经修饰的玉米植物，每个经修饰的玉米植物包含
1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种赤霉酸20(GA20)氧化酶基因和/或一种或多种赤霉酸3(GA3)氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和
2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列。
61.如实施方案60所述的多个经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物具有增加的产量。
62.如实施方案60或61所述的多个经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物的产量相比于对照玉米植物增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％或至少25％。
63.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：
a.向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述玉米细胞包含第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列；以及
b.从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
64.如实施方案63所述的方法，其中所述引入是经由使用位点特异性核酸酶的定点整合。
65.如实施方案64所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：RNA指导的核酸内切酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶和转座酶。
66.如实施方案63所述的方法，其中所述引入是经由农杆菌介导的转化。
67.如实施方案63所述的方法，其中所述引入是经由粒子轰击。
68.如实施方案63至67中任一项所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA3氧化酶_1基因、GA3氧化酶_2基因或两者的非编码RNA。
69.如实施方案68所述的方法，其中所述可转录DNA序列包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
70.如实施方案68所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码非编码RNA，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15个连续核苷酸具有80％互补性的序列。
71.如实施方案63至67中任一项所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶基因的非编码RNA。
72.如实施方案71所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因、GA20氧化酶_5基因或它们的组合的非编码RNA。
73.如实施方案72所述的方法，其中所述非编码RNA包含与编码玉米植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
74.如实施方案72所述的方法，其中所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
75.如实施方案63至74中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
76.如实施方案63至74中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包括大肠杆菌MoaD多肽。
77.如实施方案63至74中任一项所述的方法，其中所述第一重组表达盒中包含的所述DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
78.如实施方案63至74中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
79.如实施方案63所述的经修饰的玉米植物，其中所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒被稳定整合到所述玉米细胞的基因组中。
80.如实施方案63所述的方法，所述方法还包括选择具有期望性状的经修饰的玉米植物。
81.如实施方案80所述的方法，其中相对于不具有所述第一重组表达盒或所述第二重组表达盒的对照玉米植物，所选择的经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
82.如实施方案80或81所述的方法，其中选择具有期望性状的经修饰的玉米植物包括使用一种或多种分子技术。
83.如实施方案82所述的方法，其中所述一种或多种分子技术选自由以下组成的组：Southern分析，聚合酶链反应(PCR)扩增，Northern印迹，RNA酶保护，引物延伸，反转录PCR(RT-PCR)，Sanger测序，下一代测序技术，酶法测定，蛋白质凝胶电泳，Western印迹，免疫沉淀，酶联免疫测定，原位杂交，酶染色，免疫染色，标记基因分型和它们的组合。
84.如实施方案63至83中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的成熟时高度降低至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
85.如实施方案63至84中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的秆或茎直径增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
86.如实施方案63至84中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的穗部性状：穗直径增加、单粒重增加、穗鲜重增加、产量增加和它们的组合。
87.如实施方案63至84中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中的花色素苷含量和面积降低，穗重增加，收获指数提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
88.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：
a.向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含可转录DNA序列，所述可转录DNA序列编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA，其中所述玉米细胞包含第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及
b.从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
89.如实施方案88所述的方法，其中所述引入是经由使用位点特异性核酸酶的定点整合。
90.如实施方案89所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：RNA指导的核酸内切酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶和转座酶。
91.如实施方案88所述的方法，其中所述引入是经由农杆菌介导的转化。
92.如实施方案88所述的方法，其中所述引入是经由粒子轰击。
93.如实施方案88至92中任一项所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA3氧化酶_1基因、GA3氧化酶_2基因或两者的非编码RNA。
94.如实施方案93所述的方法，其中所述可转录DNA序列包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
95.如实施方案93所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码非编码RNA，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15个连续核苷酸具有80％互补性的序列。
96.如实施方案88至92中任一项所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶基因的非编码RNA。
97.如实施方案96所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因、GA20氧化酶_5基因或它们的组合的非编码RNA。
98.如实施方案97所述的方法，其中所述非编码RNA包含与编码玉米植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
99.如实施方案97所述的方法，其中所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
100.如实施方案88至99中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
101.如实施方案88至99中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包括大肠杆菌MoaD多肽。
102.如实施方案88至99中任一项所述的方法，其中所述第二重组表达盒中包含的所述DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
103.如实施方案88至99中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
104.如实施方案88所述的经修饰的玉米植物，其中所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒被稳定整合到所述玉米细胞的基因组中。
105.如实施方案88所述的方法，所述方法还包括选择具有期望性状的经修饰的玉米植物。
106.如实施方案105所述的方法，其中相对于不具有所述第一重组表达盒或所述第二重组表达盒的对照玉米植物，所选择的经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
107.如实施方案105或106所述的方法，其中选择具有期望性状的经修饰的玉米植物包括使用一种或多种分子技术。
108.如实施方案107所述的方法，其中所述一种或多种分子技术选自由以下组成的组：Southern分析，PCR扩增，Northern印迹，RNA酶保护，引物延伸，RT-PCR，Sanger测序，下一代测序技术，酶法测定，蛋白质凝胶电泳，Western印迹，免疫沉淀，酶联免疫测定，原位杂交，酶染色，免疫染色，标记基因分型和它们的组合。
109.如实施方案88至108中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的成熟时高度降低至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
110.如实施方案88至109中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的秆或茎直径增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
111.如实施方案88至110中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的穗部性状：穗直径增加、单粒重增加、穗鲜重增加、产量增加和它们的组合。
112.如实施方案88至111中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中的花色素苷含量和面积降低，穗重增加，收获指数提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
113.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括
a.向玉米细胞中引入：1)第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及
b.从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
114.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括
a.向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列；
b.向步骤(a)的所述玉米细胞中引入第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列以产生经修饰的玉米细胞；以及
c.从步骤(b)的所述经修饰的玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
115.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括
a.向玉米细胞中引入第一重组表达盒，所述第一重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；
b.向步骤(a)的所述玉米细胞中引入第二重组表达盒，所述第二重组表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列以产生经修饰的玉米细胞；以及
c.从步骤(b)的所述经修饰的玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一重组表达盒和所述第二重组表达盒。
116.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：
a.使第一经修饰的玉米植物与第二经修饰的玉米植物杂交，其中相对于野生型对照，一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因在所述第一经修饰的玉米植物中的表达或活性降低，并且其中所述第二经修饰的玉米植物包含重组表达盒，所述重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列；以及
b.产生包含所述重组表达盒并且具有所述一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或GA20氧化酶基因的表达降低的后代玉米植物。
117.如实施方案116所述的方法，其中所述第一经修饰的玉米植物和所述第二经修饰的玉米植物是经由使用位点特异性核酸酶的定点整合获得的。
118.如实施方案117所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：RNA指导的核酸内切酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶和转座酶。
119.如实施方案116所述的方法，其中所述第一经修饰的玉米植物和所述第二经修饰的玉米植物是经由农杆菌介导的转化获得的。
120.如实施方案116所述的方法，其中所述第一经修饰的玉米植物和所述第二经修饰的玉米植物是经由粒子轰击获得的。
121.如实施方案116至120所述的方法，其中所述第一经修饰的玉米植物和所述后代玉米植物包含编码用于抑制GA3氧化酶_1基因、GA3氧化酶_2基因或两者的非编码RNA的可转录DNA序列。
122.如实施方案121所述的方法，其中所述可转录DNA序列包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
123.如实施方案121所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码非编码RNA，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15个连续核苷酸具有80％互补性的序列。
124.如实施方案116至120中任一项所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶基因的非编码RNA。
125.如实施方案124所述的方法，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因、GA20氧化酶_5基因或它们的组合的非编码RNA。
126.如实施方案125所述的方法，其中所述非编码RNA包含与编码玉米植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
127.如实施方案125所述的方法，其中所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
128.如实施方案116至127中任一项所述的方法，其中所述第二经修饰的玉米植物和所述后代玉米植物包含重组表达盒，所述重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列。
129.如实施方案128所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
130.如实施方案116至127中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包括大肠杆菌MoaD多肽。
131.如实施方案116至127中任一项所述的方法，其中所述第二经修饰的玉米植物中包含的所述DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
132.如实施方案116至127中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
133.如实施方案116所述的方法，所述方法还包括选择具有期望性状的后代玉米植物。
134.如实施方案133所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所选择的后代玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
135.如实施方案133或134所述的方法，其中选择具有期望性状的后代玉米植物包括使用一种或多种分子技术。
136.如实施方案135所述的方法，其中所述一种或多种分子技术选自由以下组成的组：Southern分析，PCR扩增，Northern印迹，RNA酶保护，引物延伸，RT-PCR，Sanger测序，下一代测序技术，酶法测定，蛋白质凝胶电泳，Western印迹，免疫沉淀，酶联免疫测定，原位杂交，酶染色，免疫染色，标记基因分型和它们的组合。
137.如实施方案116至136中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述后代玉米植物的成熟时高度降低至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
138.如实施方案116至137中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述后代玉米植物的秆或茎直径增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
139.如实施方案116至138中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述后代玉米植物表现出选自由以下组成的组的穗部性状：穗直径增加、单粒重增加、穗鲜重增加、产量增加和它们的组合。
140.如实施方案116至139中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述后代玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中的花色素苷含量和面积降低，穗重增加，收获指数提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
141.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：
a.向玉米细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中所述玉米细胞在一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因中包含一个或多个突变和/或编辑；以及
b.从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，
其中所述经修饰的玉米植物包含所述重组表达盒和所述一个或多个突变和/或编辑，并且其中相对于不具有所述一个或多个突变和/或编辑的对照植物，所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因在所述经修饰的玉米植物中的表达或活性水平降低。
142.如实施方案141所述的方法，所述方法还包括引入编码靶向所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的指导RNA的重组DNA构建体。
143.如实施方案142所述的方法，其中所述指导RNA包含与一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。
144.如实施方案143所述的方法，其中所述指导RNA包含与SEQ ID NO:34、35、36、37或38或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24个或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。
145.如实施方案142至144中任一项所述的方法，其中所述指导RNA是CRISPR RNA(crRNA)或单链指导RNA(sgRNA)。
146.如实施方案142至145中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含与所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列紧邻的所述玉米细胞基因组中存在的前间区序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
147.如实施方案142至146中任一项所述的方法，其中所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因编码与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的蛋白质。
148.如实施方案141所述的方法，其中所述引入是经由农杆菌介导的转化或粒子轰击。
149.如实施方案148所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
150.如实施方案148所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包括大肠杆菌MoaD多肽。
151.如实施方案141至150中任一项所述的方法，其中所述DNA序列包含与SEQ IDNO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
152.如实施方案141至150中任一项所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
153.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括：
a.在玉米细胞中突变或编辑一种或多种内源GA3氧化酶基因和/或一种或多种GA20氧化酶基因，其中所述玉米细胞包含编码Moco生物合成多肽的重组表达盒，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接；以及
b.从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述重组表达盒和所述一个或多个突变和/或编辑，并且其中相对于不具有所述一个或多个突变和/或编辑的对照植物，所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因在所述经修饰的玉米植物中的表达或活性水平降低。
154.如实施方案153所述的方法，其中所述突变或编辑是通过使用位点特异性核酸酶获得的，所述位点特异性核酸酶选自由RNA指导的核酸内切酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶和转座酶组成的组。
155.如实施方案153或154所述的方法，所述方法还包括引入编码靶向所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的指导RNA的重组DNA构建体。
156.如实施方案155所述的方法，其中所述指导RNA包含与一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24个或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。
157.如实施方案156所述的方法，其中所述指导RNA包含与SEQ ID NO:34、35、36、37或38或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24个或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性的指导序列。
158.如实施方案155至157中任一项所述的方法，其中所述指导RNA是CRISPR RNA(crRNA)或单链指导RNA(sgRNA)。
159.如实施方案155至158中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含与所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列紧邻的所述玉米细胞基因组中存在的前间区序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
160.如实施方案155至159中任一项所述的方法，其中所述一种或多种内源GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因编码与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的蛋白质。
161.如实施方案153所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
162.如实施方案153所述的方法，其中所述重组表达盒编码大肠杆菌MoaD多肽。
163.如实施方案153所述的方法，其中所述重组表达盒包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
164.如实施方案153所述的方法，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
165.如实施方案153至164中任一项所述的方法，所述方法还包括选择具有期望性状的经修饰的玉米植物。
166.如实施方案165所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的成熟时高度降低至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
167.如实施方案166所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的秆或茎直径增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
168.如实施方案165至167中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的穗部性状：穗直径增加、单粒重增加、穗鲜重增加、产量增加和它们的组合。
169.如实施方案165至168中任一项所述的方法，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中的花色素苷含量和面积降低，穗重增加，收获指数提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
170.一种经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物包含：1)一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因处或附近的一个或多个突变或编辑，其中相对于野生型对照植物，所述一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达或活性降低，和2)重组表达盒，所述重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
171.如实施方案170所述的经修饰的玉米植物，其中相对于既不包含所述一个或多个突变或编辑又不包含所述重组表达盒的对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
172.如实施方案170或171所述的经修饰的玉米植物，其中所述一个或多个突变或编辑选自由以下组成的组：***、取代、倒位、缺失、复制和它们的组合。
173.如实施方案170至172中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶引入所述一个或多个突变或编辑。
174.如实施方案170至173中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
175.如实施方案170至173中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中Moco生物合成多肽包括大肠杆菌MoaD多肽。
176.如实施方案170至173中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
177.如实施方案170至173中任一项所述的经修饰的玉米植物，所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
178.如实施方案170至177中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述重组表达盒被稳定整合到所述经修饰的玉米植物的基因组中。
179.如实施方案170至178中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的成熟时高度降低至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
180.如实施方案170至179中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的秆或茎直径增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
181.如实施方案170至180中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出改善的抗倒伏性、未成熟折断减少或两者。
182.如实施方案170至181中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的穗直径。
183.如实施方案170至182中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的单粒重。
184.如实施方案170至183中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的穗鲜重。
185.如实施方案170至184中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的产量。
186.如实施方案170至185中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中的花色素苷含量和面积降低，穗重增加，收获指数提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
187.如实施方案170至186中任一项所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何明显的异型。
188.田间的多个经修饰的玉米植物，每个经修饰的玉米植物包含
1)一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因处或附近的一个或多个突变或编辑，其中所述一种或多种内源GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达相对于野生型对照植物有所降低，和
2)重组表达盒，所述重组表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
189.如实施方案188所述的多个经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物具有增加的产量。
190.如实施方案188或189所述的多个经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相比于对照玉米植物的产量增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％或至少25％。
191.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：1)第一表达盒，所述第一表达盒包含编码用于抑制一种或多种GA20氧化酶或一种或多种GA3氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，和2)第二表达盒，所述第二表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
192.如实施方案191所述的重组DNA构建体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒在转化载体的单个T-DNA区段中。
193.如实施方案191所述的重组DNA构建体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒在转化载体的两个不同的T-DNA区段中。
194.如实施方案191至193中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA3氧化酶基因的非编码RNA。
195.如实施方案194所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA3氧化酶_1基因、GA3氧化酶_2基因或两者的非编码RNA。
196.如实施方案195所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列包含与SEQID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性或互补性的序列。
197.如实施方案195所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列编码非编码RNA，所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、36和37中的一者或多者的至少15个连续核苷酸具有80％互补性的序列。
198.如实施方案194所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶基因的非编码RNA。
199.如实施方案198所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_4基因、GA20氧化酶_5基因或它们的组合的非编码RNA。
200.如实施方案198所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列编码用于抑制GA20氧化酶_3基因、GA20氧化酶_5基因或两者的非编码RNA。
201如实施方案200所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列包含与SEQ IDNO:39、53或55的至少15个连续核苷酸具有至少80％同一性或互补性的序列。
202.如实施方案201所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列编码与SEQID NO:40、54或56的至少15个连续核苷酸具有至少80％互补性的序列。
203.如实施方案191至202中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA包含与编码玉米植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
204.如实施方案191至203中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补性的序列。
205.如实施方案191至204中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述第二表达盒中包含的所述DNA序列包含编码蛋白质的序列，所述蛋白质具有与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
206.如实施方案191至204中任一项所述的重组DNA构建体，其中包含在所述第二表达盒中的所述DNA序列编码大肠杆菌MoaD多肽。
207.如实施方案191至204中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
208.如实施方案191至204中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
209.如实施方案191至208中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是根启动子或胁迫诱导型启动子。
210.如实施方案191至208中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
211.一种转化载体，所述转化载体包含如实施方案191至210中任一项所述的重组DNA构建体。
212.一种经修饰的玉米植物或其植物部分，所述经修饰的玉米植物或其植物部分包含如实施方案211所述的重组DNA构建体。
213.如实施方案212所述的经修饰的玉米植物，其中相对于既不具有第一表达盒又不具有第二表达盒的对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
214.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的成熟时高度降低至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
215.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物的秆或茎直径增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
216.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出改善的抗倒伏性、未成熟折断减少或两者。
217.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的穗直径。
218.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的单粒重。
219.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的穗鲜重。
220.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物相对于对照玉米植物表现出增加的产量。
221.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中相对于对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物表现出选自由以下组成的组的性状：根系较深，叶面积增加，冠层闭合较早，气孔导度较高，穗高较低，叶片含水量增加，耐旱性改善，氮利用效率提高，在正常或限氮或限水胁迫条件下叶片中的花色素苷含量和面积降低，穗重增加，收获指数提高，产量提高，种子数量增加，种子重量增加，多穗性提高和它们的组合。
222.如实施方案213所述的经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何明显的异型。
223.一种用于将***序列定点整合到玉米植物基因组中的重组DNA供体模板分子，所述重组DNA供体模板分子包含***序列和至少一个同源序列，其中所述同源序列与玉米植物细胞基因组中的靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补性，并且其中所述***序列包含表达盒，所述表达盒包含编码Moco生物合成多肽的DNA序列，其中所述DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
224.如实施方案223所述的重组DNA供体模板分子，其包含两个同源序列，其中所述两个同源序列在所述***序列的侧翼。
225.如实施方案223或224所述的重组DNA供体模板分子，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:174-177中的一者或多者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
226.如实施方案223或224所述的重组DNA供体模板分子，其中所述Moco生物合成多肽包括大肠杆菌MoaD多肽。
227.如实施方案223或224所述的重组DNA供体模板分子，其中所述表达盒中包含的所述DNA序列包含与SEQ ID NO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。
228.如实施方案223或224所述的重组DNA供体模板分子，其中所述Moco生物合成多肽包含与SEQ ID NO:168具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
229.如实施方案223至228中任一项所述的重组DNA供体模板分子，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
230.如实施方案223至228中任一项所述的重组DNA供体模板分子，其中所述植物可表达启动子是根启动子或胁迫诱导型启动子。
231.如实施方案223至230中任一项所述的重组DNA供体模板分子，所述重组DNA供体模板分子还包含编码用于抑制一种或多种GA20氧化酶基因和/或一种或多种GA3氧化酶基因的非编码RNA的可转录DNA序列，其中所述可转录DNA序列与启动子可操作地连接。
232.如实施方案231所述的重组DNA供体模板分子，其中所述启动子是维管启动子。
233.如实施方案232所述的重组DNA供体模板分子，其中所述维管启动子选自由以下组成的组：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮秆双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉蜀黍条纹双生病毒(MSV)外壳多肽(CP)启动子、水稻黄条纹1(YS1)样启动子、水稻黄条纹2(OsYSL2)启动子和它们的组合。
234.如实施方案233所述的重组DNA供体模板分子，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
235.如实施方案223至228中任一项所述的重组DNA供体模板分子，其中所述启动子是水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子。
236.如实施方案235所述的重组DNA供体模板分子，其中所述RTBV启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
237.如实施方案223至228中任一项所述的重组DNA供体模板分子，其中所述启动子是叶启动子。
238.如实施方案237所述的重组DNA供体模板分子，其中所述叶启动子选自由以下组成的组：RuBisCO启动子、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)启动子、果糖1-6双磷酸醛缩酶(FDA)启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合多肽基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、Myb基因启动子和它们的组合。
239.如实施方案238所述的重组DNA供体模板分子，其中所述叶启动子包含与SEQID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
240.如实施方案223至228中任一项所述的重组DNA供体模板分子，其中所述启动子是组成型启动子。
241.如实施方案240所述的重组DNA供体模板分子，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：肌动蛋白启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子、花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒(PCLSV)启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子或玉蜀黍醇脱氢酶、其功能部分和它们的组合。
242.如实施方案241所述的重组DNA供体模板分子，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一者或多者或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
243.如实施方案1所述的经修饰的玉米植物，其中所述第一重组表达盒包含SEQID NO:39，并且所述第二重组表达盒包含SEQ ID NO:169。
244.如实施方案243所述的经修饰的玉米植物，其中相对于不包含所述第一重组表达盒或所述第二重组表达盒的对照植物，所述经修饰的玉米植物是半矮秆的并且表现出一种或多种改善的穗部性状。
245.如实施方案244所述的经修饰的玉米植物，其中所述一种或多种改善的穗部性状选自由以下组成的组：广亩产量、穗鲜重、叶片氮百分比和它们的组合。
246.一种经修饰的玉米植物或其植物部分，所述经修饰的玉米植物或其植物部分包含：1)包含SEQ ID NO:39的第一可转录DNA序列，和2)包含SEQ ID NO:169的第二可转录DNA序列。
247.如实施方案246所述的经修饰的玉米植物，其中相对于不具有所述第一可转录DNA序列或所述第二可转录DNA序列的对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
248.如实施方案247所述的经修饰的玉米植物，其中所述一种或多种改善的穗部性状选自由以下组成的组：广亩产量、穗鲜重、叶片氮百分比和它们的组合。
249.一种用于产生经修饰的玉米植物的方法，所述方法包括
a.向玉米细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包括包含SEQ ID NO:39的第一可转录DNA序列和包含SEQ ID NO:169的第二可转录DNA序列；
b.从所述玉米细胞再生或发育经修饰的玉米植物，其中所述经修饰的玉米植物包含所述第一可转录DNA序列和所述第二可转录DNA序列。
250.如实施方案249所述的方法，其中相对于不具有所述第一可转录DNA序列或所述第二可转录DNA序列的对照玉米植物，所述经修饰的玉米植物是半矮秆的并且具有一种或多种改善的穗部性状。
251.如实施方案250所述的方法，其中所述一种或多种改善的穗部性状选自由以下组成的组：广亩产量、穗鲜重、叶片氮百分比和它们的组合。
252.一种重组表达盒，所述重组表达盒包含：1)包含SEQ ID NO:39的第一可转录DNA序列，和2)包含SEQ ID NO:169的第二可转录DNA序列。
253.一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：
a)与SEQ ID NO:170具有至少85％序列同一性的序列；
b)包含SEQ ID NO:170的序列；
c)SEQ ID NO:170的功能部分，其中所述功能部分具有基因调控活性；和
d)与c)中的所述功能部分具有至少85％序列同一性的序列；其中所述序列与异源可转录DNA序列可操作地连接。
254.如实施方案253所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
255.如实施方案253所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:170或其功能部分具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
256.如实施方案253至255中任一项所述的重组DNA分子，所述重组DNA分子还包含一个或多个序列，所述序列中的每一者与选自由SEQ ID NO:171-173和它们的组合组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
257.如实施方案256所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录DNA序列与SEQ IDNO:169具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
实施例
实施例1.GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的生成
在已知导致在植物的维管组织中表达的水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(SEQID NO:65)的控制下，利用具有包含编码靶向序列(SEQ ID NO:40)的miRNA编码DNA序列(SEQ ID NO:39)的表达构建体的转化载体经由农杆菌介导的转化来转化近交玉米植物品系。由所述构建体编码的miRNA包含靶向玉米植物中的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的RNA序列。由此产生若干转化事件。所得的转化的/转基因的近交系在本文中称为GA20Ox_SUP或GA20Ox_SUP单株。
测量R3阶段直到最上方舌状叶的植株高度。如图1所示，相对于对照植物，在GA20Ox_SUP单株植物中一致观察到植株高度的统计学显著降低在35％至40％之间(p值≤0.2)。
类似地，利用具有表达构建体的转化载体经由农杆菌介导的转化来转化近交玉米植物品系，所述表达构建体包含玉米启动子(SEQ ID NO:170)、其前导序列(SEQ ID NO:171)、内含子序列(SEQ ID NO:172)和终止子区域(SEQ ID NO:173)，其可操作地连接至编码大肠杆菌MoaD多肽(SEQ ID NO:168)的多核苷酸序列(SEQ ID NO:169)。由此产生若干转化事件。所得的转化的/转基因的近交系在本文中称为Moly、MoaD、MoaD或Moly转基因植物、Moly单株或MoaD单株。
将亲本GA20Ox_SUP和MoaD单株杂交以产生堆叠转基因后代植物，所述后代植物既包含MoaD转基因又包含用于抑制GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA编码DNA序列。所得的堆叠转基因品系在本文中称为GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株。如果亲本系具有相同的近交系来源，则GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株可以是近交堆叠株，或者当亲本系具有不同的近交系时，则可以是杂种。
对于每种类型的转基因单株和堆叠株植物，还产生了用于比较的相应对照植物，所述对照植物具有相同近交系或相同亲本系组合，但没有转基因GA20Ox_SUP和MoaD构建体。
实施例2.GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的高度降低
GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物在标准农艺实践下在田间生长至成熟，并对其高度进行测量。植株高度测量为从土壤线到R3阶段的最高领叶基部的地块平均值。测量足够数量的植物以满足p值≤0.2的统计显著性。具有相同亲本近交系但没有GA20Ox_SUP和MoaD转基因构建体的对照植物也在类似条件下生长。
图2示出GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株以及GA20Ox_SUP单株和MoaD单株的平均植株高度降低，每一者都相对于对照植物。如图2所示，相对于对照植物，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物中一致观察到统计学显著的植株高度平均降低25％至30％。相反，与对照植物相比，MoaD单株植物的植株高度略有增加。
实施例3.通过MoaD基因表达增强的穗部性状
实施例1中所述的转基因单株和堆叠株植物和对照植物在标准农艺实践下生长。在R6阶段对MoaD单株植物测量若干玉米穗部性状。通过对穗进行成像并在面积测量中包括籽粒和尖端空隙，从二维视图中以穗面积的地块平均值来测量穗面积。通常，每个地块测量10个代表性的穗。穗空隙测量为通过对穗成像而根据二维视图具有空隙(即缺少发育的籽粒)的穗的面积百分比的地块平均值，其中所述穗的总面积包括籽粒和空隙。穗尖空隙是对穗面积的远端30％内的穗空隙面积百分比的地块平均值的度量。穗直径是对穗直径的地块平均值的度量，所述穗直径测量为穗在其最宽截面的最大“宽”轴。穗长是从穗的尖端沿一条直线延伸到穗结节的底部测量的穗长度的地块平均值的度量。
谷粒产量估计值是从一小块地块收集的每单位面积手工收获的谷粒重量测量结果换算为蒲式耳/英亩的等效数量，包括调整到标准水分含量。每单位面积籽粒数测量为每单位面积田地的籽粒数的地块平均值。每穗粒数是粒数除以穗数的地块平均值的度量。
籽粒等级是通过将每穗粒数(对每个地块取平均值)除以人工计数的行数(对每个地块取平均值)而计算出的穗的每行的平均籽粒数。籽粒行是通过计算穗中部周围的籽粒行数来测量的。最终值是对每个地块取平均值。籽粒行数的范围可以在12至20之间。
单粒重被测量为每个籽粒重量的地块平均值，计算为样品籽粒重量(调整到标准水分含量)/样品籽粒数量。样品籽粒数量的范围可以为350至850。
图3示出在限氮条件下MoaD单株植物的穗部性状结果。结果显示为MoaD单株植物与不具有MoaD转基因构建体的相同近交系的对照植物之间的百分比差异(Δ)。深灰色条柱指示与对照植物相比的统计学显著变化(正或负)(p值≤0.2)。如图3所示，与对照相比，MoaD单株植物在限氮条件下表现出许多穗部性状的统计学显著改善，包括穗面积增加，穗直径增加，穗长增加，谷粒产量估计值增加，每单位面积粒数增加，每穗粒数增加，籽粒等级增加，单粒重增加，穗空隙减少和穗尖空隙减少。对于限氮条件，应根据需要对田地施加氮，以使氮的最终浓度仅为100磅/英亩。
如图4所示，在标准农艺条件下与对照植物相比，MoaD单株植物确实显示出产量(蒲式耳/英亩)降低，其中深灰色条柱指示统计学显著的正或负变化(p值≤0.2)。然而，如下所示，与本实验中的MoaD单株植物不同，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物除表现出改善的穗部性状外，还令人惊讶地表现出增加的产量。
实施例4.GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的增强的穗部性状
当GA20Ox_SUP和MoaD构建体同时存在于同一株植物中时，观察到正面穗部性状。如图5所示，在单个生长季节中生长的GA20Ox_SUP单株的两个事件、MoaD单株的两个事件和GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的四个事件中测量穗部性状，例如穗鲜重、穗直径和单粒重。上面提供了穗直径和单粒重的定义。穗鲜重测量为R6阶段穗鲜重的地块平均值。图5中的每个条柱对应于一个转化事件。与GA20Ox_SUP和MoaD单株植物相比，带有双星号(**)的条柱指示统计学显著的变化(增加)，而与GA20Ox_SUP和MoaD单株植物中的一者或两者相比，带有单星号(*)的条柱指示数值变化。
图5中的结果表明，尽管GA20Ox_SUP和MoaD单事件相对于对照植物可具有适度提高的穗鲜重、穗直径和单粒重，但GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物相对于对照植物具有穗鲜重、穗直径和单粒重的统计学显著增加，并且GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物中的所有三种穗部性状的增加通常都大于MoaD和GA20Ox_SUP单株植物的性状增加，其中这些穗部性状相比于具有一些事件的MoaD和GA20Ox_SUP单株植物中的一者或两者均具有统计学显著的增加。
图7示出针对单个生长季节中生长的GA20Ox_SUP单株的一个事件、MoaD单株的一个事件以及GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的一个事件组合测得的谷粒产量估计值。图7中的数据呈现为GA20Ox_SUP单株、MoaD单株和GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物与非转基因对照植物的谷粒产量估计值之间的百分比差异。深灰色条柱指示统计学显著的正变化(p值≤0.2)，并且浅灰色条柱指示数值上的正或负变化。
如图7所示，在GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物中观察到正性状效果。尽管MoaD单株和GA20Ox_SUP单株植物相对于对照植物具有相似的谷粒产量估计值，但GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物相对于对照植物显示出统计学显著的谷粒产量估计值增加。
图8示出针对在单个生长季节中生长的GA20Ox_SUP单株的一个事件、MoaD单株的一个事件和GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的一个事件组合测得的穗部性状，例如穗体积、穗直径、穗长、穗尖空隙、每穗粒数和单粒重。图8中的数据呈现为GA20Ox_SUP单株、MoaD单株和GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物与非转基因对照植物的各种穗部性状中的每一者之间的百分比差异。深灰色条柱指示统计学显著的正或负变化(p值≤0.2)，并且浅灰色条柱指示数值上的正或负变化。
如图8所示，在GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物中观察到正性状效果。相对于对照植物，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物显示出穗体积、穗直径、穗长、每穗粒数和单粒重的统计学显著增加。GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的这些性状中的每一者相比于MoaD单株植物都有所增加，并且这些性状中的若干性状(包括穗体积、穗直径、每穗粒数和单粒重)相比于GA20Ox_SUP单株植物都有所增加。GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物相对于对照植物也显示出穗尖空隙的仅轻微数值增加，这小于GA20Ox_SUP单株植物的增加。
这些结果表明，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物与对照植物和MoaD和/或GA20Ox_SUP单株植物相比具有增强的穗部性状，例如穗体积、穗鲜重、穗直径、穗长、穗尖空隙、每穗粒数和单粒重，其中在一些情况下，根据特定事件组合，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物中的这些性状具有统计学显著增加(参见图5)。
实施例5.GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的产量增加
图6示出GA20Ox_SUP单株植物和GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的田间试验的产量结果。结果显示为与对照植物相比的产量(蒲式耳/英亩)的百分比差异(Δ)。深灰色条柱指示与对照植物显著不同(增加)的值(p值≤0.1)，并且浅灰色条柱指示与对照植物在数值上不同(增加)的值。如图6所示，相对于对照植物观察到GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的产量的统计学显著增加，并且该增加大于GA20Ox_SUP单株植物的增加。鉴于MoaD单株植物中对产量的潜在负面影响，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物的这些产量结果令人惊讶(如上图4所示，比对照植物少至少1.45％)。
这些结果表明，GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物中的上述正面穗部性状可能导致或允许GA20Ox_SUP/MoaD堆叠株植物相比于对照植物的产量增加，这可能大于GA20Ox_SUP单株的产量增加。
实施例6.MoaD基因同源物的鉴定
MoaD基因通常存在于病毒、植物和动物中。在中搜索大肠杆菌MoaD蛋白质序列，以使用BlastP(e值截止值为1e-10)从各种物种中鉴定出其它MoaD同源物。然后过滤初步搜索结果，以鉴定具有完整氨基酸序列的那些，所述氨基酸序列具有起始甲硫氨酸和与大肠杆菌MoaD蛋白具有序列同源性的Pfam结构域。这些搜索的汇编结果包括具有如SEQ ID NO:174-177所示的氨基酸序列的蛋白质。
实施例7.使用单个载体生成GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物
经由分子克隆产生构建体和载体，所述构建体和载体具有包含编码靶向玉米植物中的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的DNA序列的表达盒和包含编码MoaD多肽的DNA序列的表达盒。构建第一载体(载体1)，其依次包含编码大肠杆菌MoaD多肽的基因序列(SEQ ID NO:169)和编码具有针对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5的靶向序列(SEQ IDNO:40)的miRNA的miRNA编码DNA序列(SEQ ID NO:39)，其中所述两个编码序列各自可操作地连接至启动子和终止子序列，并通过基因间序列彼此分开。构建另外两个载体(载体2和载体3)，其依次包含编码具有针对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的靶向序列(SEQ IDNO:40)的miRNA的miRNA编码DNA序列(SEQ ID NO:39)和编码大肠杆菌MoaD多肽的DNA序列(SEQ ID NO:169)，其中所述两个编码序列各自可操作地连接至启动子和终止子序列，并通过基因间序列彼此分开。对于每个载体，将编码大肠杆菌MoaD多肽的DNA序列可操作地连接至玉米启动子(SEQ ID NO:170)，并且将miRNA编码DNA序列可操作地连接至水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(SEQ ID NO:65)。
经由农杆菌介导的转化将每种载体(载体1、载体2和载体3)转化到玉米植物中，以产生被称为GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物的转基因玉米植物。
实施例8.GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物与对照相比的产量增加
对于含有来自载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的五个事件之一的植物测量广亩产量(“BAY”)。图9示出含有载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物的四个事件在15个地点在一个生长季节中的BAY。结果显示为GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物与非转基因对照植物的BAY之间的平均差异(蒲式耳/英亩)。图9中的每个条柱对应于单个转化事件。图9中的深灰色条柱指示统计学显著的正或负变化(p值≤0.1)，并且浅灰色条柱指示数字上正或负的变化。
如图9所示，来自载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物的五个事件中有两个事件相对于对照植物显示出具有BAY的统计学显著增加，其中它们之间平均增加约15蒲式耳/英亩，而其它载体堆叠事件相对于对照植物具有类似的产量结果。
实施例9.GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物与GA20Ox_SUP单株相比的穗鲜重增加
图10示出含有来自载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的五个事件之一、来自载体2的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的四个事件之一和来自载体3的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的三个事件之一的植物的每株穗鲜重。结果显示为GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物与GA20Ox_SUP单株植物之间的每株穗鲜重的百分比差异。图10中的每个条柱对应于单个转化事件。图10中的深灰色条柱指示统计学显著的正或负变化(p值≤0.2)，并且浅灰色条柱指示数值上正或负的变化。
如图10的左图所示，含有来自载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的五个事件之一的植物相对于GA20Ox_SUP单株植物显示出每株穗鲜重的统计学显著增加，并且含有来自载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的五个事件中的两个事件的植物相对于GA20Ox_SUP单株植物显示出每株穗鲜重的数值增加，但含有来自载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物的另一事件的植物相对于GA20Ox_SUP单株植物显示出每株穗鲜重的数值减少。
如图10的中图所示，含有来自载体2的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的四个事件之一的植物相对于GA20Ox_SUP单株植物显示出每株穗鲜重的统计学显著增加，并且含有来自载体2的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的其它三个事件中的任一者的植物相对于GA20Ox_SUP单株植物显示出每株穗鲜重的数值增加。
如图10的右图所示，含有来自载体3的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的三个事件之一的植物相对于GA20Ox_SUP单株植物显示出每株穗鲜重的统计学显著增加，并且含有来自载体3的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的其它两个事件之一的植物相对于GA20Ox_SUP单株植物显示出每株穗鲜重的数值增加。
实施例10.GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物的叶片氮百分比增加。
如本实施例中所用，“叶片氮百分比”是指氮(“N”)含量除以叶冲压样品的总干重的百分比[氮％＝100*(氮的重量)/(干燥样品的总重量)]。使用1112元素分析仪(Thermo Fisher)测量氮含量，并使用K因子法计算氮含量。使用以下公式获得常数：K＝％Th*(I-b)/p；Th＝标准物的理论百分比，p＝重量(毫克)，I＝面积积分，b＝空白面积积分。未知数的计算使用未知数％＝K*p/(I-b)。阿托品用于校准反应并在每次分析过程中检查适用性。检查样品的可接受结果为±6.2％N。
图11示出在R2或V12发育阶段含有来自载体1的GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的五个不同事件之一的植物和在R2或V12发育阶段含有GA20Ox_SUP单构建体的四个不同事件之一的植物的叶片氮百分比。结果显示为GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠或GA20Ox_SUP单株植物相对于对照植物的叶片氮百分比之间的百分比差异。图11中的每个条柱对应于单个转化事件。图11中的深灰色条柱指示统计学显著的正变化(p值≤0.2)，并且浅灰色条柱指示数值上的正或负变化。
如图11的左上图所示，在R2阶段的含有GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的五个事件中的两个事件的植物与对照植物相比具有叶片氮百分比的统计学显著增加，并且在R2阶段的含有GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠的其它三个事件之一的植物与对照植物相比具有叶片氮百分比的数值增加。如图11的右上图所示，仅含有GA20Ox_SUP单事件之一的植物与对照植物相比具有R2阶段的叶片氮百分比的数值增加，并且含有其它三个GA20Ox_SUP单事件之一的植物与对照植物相比具有R2阶段的叶片氮百分比的数值减少。另外，GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物在R2阶段的叶片氮百分比的平均增加大于GA20Ox_SUP单株植物在R2阶段的叶片氮百分比的平均增加。
如图11的下图所示，含有五个GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠事件中的任一者的植物与对照植物相比显示出V12阶段的叶片氮百分比的统计学显著增加。类似地，含有四个GA20Ox_SUP单事件中的任一者的植物与对照植物相比显示出V12阶段的叶片氮百分比的统计学显著增加，但在该实验中GA20Ox_SUP/MoaD载体堆叠植物在V12阶段的叶片氮百分比相对于对照植物的平均增加大于GA20Ox_SUP单株植物在V12阶段的叶片氮百分比的平均增加
实施例11.在稳定转化的玉米植物中由P-Zm.G663620-1:1:2驱动的GUS表达的分析
该实施例说明了启动子(SEQ ID NO:170)在稳定转化的玉米植物中驱动转基因表达的能力。用载体、特别是植物表达载体转化玉米植物，所述载体含有驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因表达的测试调控元件。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件对表达的影响。
用植物GUS表达构建体转化玉米植物。使用本领域已知的标准方法将调控元件克隆到基础植物表达载体中。所得的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的左边界区(B-AGRtu.左边界)，用于选择赋予除草剂草甘膦抗性的转化植物细胞的第一转基因选择盒；用于评估如SEQ ID NO:170中所示的启动子的活性的第二转基因盒，所述启动子的5'可操作地连接至前导序列(SEQ ID NO:171)，所述前导序列的5'可操作地连接至内含子序列(SEQID NO:172)，所述内含子的5'可操作地连接至设计用于在植物细胞中表达并编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的合成编码序列，所述合成编码序列含有衍生自马铃薯光诱导的组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，所述编码序列的5'可操作地连接至3'终止区(SEQ ID NO:173)，和来自根癌农杆菌的右边界区(B-AGRtu.右边界)。
如本领域中众所周知的，使用上述二元转化载体构建体通过农杆菌介导的转化来转化玉米品种LH244植物细胞。将所得转化的植物细胞再生以形成整株玉米植物。
使用定性和定量GUS分析来评估转化植物中所选植物器官和组织中表达元件的活性。为了通过组织化学染色对GUS表达进行定性分析，将整装或切片的组织与含有1mg/mLX-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)的GUS染色溶液一起在37℃下温育5小时，并用35％EtOH和50％乙酸脱色。通过在解剖显微镜或复合显微镜下目测检查选定的植物器官或组织的蓝色着色，定性确定GUS的表达。
为了通过酶法测定定量分析GUS表达，从转化的玉米植物的选定组织中提取总蛋白。将1至2微克的总蛋白与1mM浓度的荧光底物4-甲基伞酮基-β-D-葡糖苷酸(MUG)一起温育，总反应体积为50微升。在37℃下温育1小时后，通过加入350微升的200mM碳酸氢钠溶液来终止反应。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下具最大荧光，其中羟基被离子化。同时添加碱性碳酸钠溶液可终止测定，并调节pH值以定量荧光产物4-MU。通过测量其荧光来估计所形成的4-MU的量。使用具有Micromax读取器的Fluoromax-3(Horiba；日本京都)，在365nm激发、445nm发射下测量荧光，其中狭缝宽度设置为激发2nm和发射3nm。
在R0代中针对GUS表达对以下组织取样：V4阶段叶和根；V7阶段叶和根；VT阶段叶、根和花/花药；R1阶段穗轴/丝；以及授粉(DAP)后21天的R3阶段种子胚和种子胚乳。表4示出针对所测定的每种组织的启动子(SEQ ID NO:170)的平均定量GUS表达值，其中“bdl”指示低于检测水平。
表4.通过启动子(SEQ ID NO:170)驱动的稳定转化的LH244品种玉米植物中的平均定量GUS表达
从上面的表4中可以看出，在所测定的大多数组织中，GUS的表达较低，而在V7根中的表达最高。在许多组织中，定量GUS表达低于检测水平。在定量测量值太低而无法检测的组织中观察到组织化学GUS染色。例如，在V4根中，在根整装和根尖中都观察到GUS表达。在VT小尖峰中，在花梗、颖壳和内稃中观察到染色。另外，在种子21DAP中，在基底胚乳转移细胞层、糊粉、花梗和果皮中观察到染色。使用该启动子并测量GUS转录物表达的早期实验表明，所述启动子(SEQ ID NO:170)在低氮条件下是可诱导的(数据未示出)。
已经详细描述了本公开，将显而易见的是，在不脱离如本文和所附权利要求书中所描述的本公开的精神和范围的情况下，可以进行修改、变化和等同方面。此外，应当理解，本公开中的所有实施例都作为非限制性实例提供。
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