阅读说明：本技术 阿片肽分解用组合物 (Composition for decomposing opioid peptides ) 是由 樱井琢磨 桥仓那波 清水金忠 山田明男 于 2018-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明的目的在于提供对饮食习惯没有制限、即使日常利用也没有副作用、能够安心地持续利用的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物。通过以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物、阿片肽分解用药物组合物或阿片肽分解用饮食品组合物来解决该课题。(The purpose of the present invention is to provide an opiate peptide decomposition agent or a composition for opiate peptide decomposition that is not limited in eating habits, has no side effects even in daily use, and can be continuously used with ease. The problem is solved by an opioid peptide-decomposing agent or a composition for opioid peptide decomposition, a pharmaceutical composition for opioid peptide decomposition, or a food or beverage composition for opioid peptide decomposition, which contains a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium, a culture of the bacterium, and/or a treated product of the bacterium as an active ingredient.)

阿片肽分解用组合物

技术领域

本发明涉及阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物、阿片肽分解用药物组合物和阿片肽分解用饮食品组合物。

背景技术

肽中存在与阿片受体结合而显示出各种生理活性的阿片肽。作为阿片肽，已知还存在大量来源于食品的阿片肽，例如，在人的消化道内，由作为乳蛋白的酪蛋白产生称为β-酪啡肽的源自乳的阿片肽。已知上述阿片肽在消化道中未被分解时会对生物体产生各种不良影响。例如，已知来源于食品的阿片肽作用于肠道的细胞并抑制半胱氨酸的吸收而使抗氧化能力降低(非专利文献1)。

为了避免上述阿片肽的影响，例如提出了基于在消化道内不产生阿片肽的材料的饮食等(非专利文献2)。另外，公开了一种外源性阿片肽分解酶剂，其以辅助来源于食品的阿片肽的消化为目的，包含选自由来自桔青霉(Penicillium citrinum)的酶制备物、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酶制备物、来自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的酶制备物组成的组中的一种以上的成分，对源自小麦麸质的阿片肽和源自酪蛋白的阿片肽显示出分解活性(专利文献1)。另外报道了：源自乳酸乳球菌乳脂亚种的酶分解作为源自酪蛋白的阿片肽的β-酪啡肽(非专利文献3)。

另一方面，对于双歧杆菌属细菌，公开了由于长双歧杆菌IATA-ES1具有作为谷蛋白肽的醇溶蛋白的水解活性，因此用于治疗食物过敏(专利文献2)。然而，到目前为止还没有关于双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和前述细菌的菌体处理物具有分解阿片肽的作用的任何报道。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/047082号小册子

专利文献2：日本特表2011-507540号公报

非专利文献

非专利文献1：M.S.Trivedi et al.,J.Nutr.Biochem.,25(10),pp.1011-1018,2014

非专利文献2：A.Reissmann et al.,Functional Foods in Health andDisease,4(8),pp.349-361,2014

非专利文献3：T-R Yan et al.,Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),pp.704-707,1992

发明内容

发明要解决的问题

基于在消化道内不产生阿片肽的材料的饮食存在饮食习惯受到显著限制的问题的担心。

本发明的目的在于提供对饮食习惯没有制限、即使日常利用也没有副作用、能够安心地持续利用的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物。

用于解决问题的方案

本发明人等进行了深入研究，结果发现：双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物具有与二肽基肽酶-4(DPP-4)同样的酶活性，所述二肽基肽酶-4对阿片肽具有分解活性，而完成了本发明。

即，本发明为一种阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物，其以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分。

前述阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物的优选方式是，前述阿片肽为β-酪啡肽。

前述阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物的优选方式是，前述双歧杆菌属细菌的菌体处理物为前述细菌的细胞破碎物的水溶性级分。

前述阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物的优选方式是，前述双歧杆菌属细菌为人常驻性。进而，前述阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物的优选方式是，前述双歧杆菌属细菌为婴幼儿常驻性。

另外，前述阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物的优选方式是，前述双歧杆菌属细菌为选自由长双歧杆菌长亚种ATCC15707(Bifidobacterium longum subsp.longumATCC15707)、长双歧杆菌长亚种ATCC BAA-999(Bifidobacterium longum subsp.longumATCC BAA-999)或长双歧杆菌长亚种BB536(NITE BP-02621)(Bifidobacterium longumsubsp.longum BB536(NITE BP-02621))、长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697(Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC15697)、长双歧杆菌婴儿亚种BCCMLMG23728(Bifidobacterium longum subsp.infantis BCCM LMG23728)或长双歧杆菌婴儿亚种M-63(NITE BP-02623)(Bifidobacterium longum subsp.infantis M-63(NITE BP-02623))、短双歧杆菌ATCC15700(Bifidobacterium breve ATCC15700)、短双歧杆菌FERMBP-11175(Bifidobacterium breve FERM BP-11175)、短双歧杆菌BCCM LMG23729(Bifidobacterium breve BCCM LMG23729)或短双歧杆菌M-16V(NITE BP-02622)(Bifidobacterium breve M-16V(NITE BP-02622))、两歧双歧杆菌ATCC29521(Bifidobacterium bifidum ATCC29521)、青春双歧杆菌ATCC15703(Bifidobacteriumadolescentis ATCC15703)、角双歧杆菌ATCC27535(Bifidobacterium angulatumATCC27535)、齿双歧杆菌DSM20436(Bifidobacterium dentium DSM20436)、假链双歧杆菌ATCC27919(Bifidobacterium psudocatenulatum ATCC27919)、动物双歧杆菌乳亚种DSM10140(Bifidobacterium animalis subsp.lactis DSM10140)、动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527(Bifidobacterium animalis subsp.animalis ATCC25527)、假长双歧杆菌球形亚种JCM5820(Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosum JCM5820)、假长双歧杆菌假长亚种ATCC25526(Bifidobacterium pseudolongum subsp.pseudolongm ATCC25526)和嗜热双歧杆菌ATCC25525(Bifidobacterium thermophilum ATCC25525)组成的组中的一种或多种。

进而，本发明为一种阿片肽分解用药物组合物，其以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分。

前述药物组合物的优选方式是用于预防和/或治疗自闭症、艾斯伯格症候群、Rett综合征、童年瓦解性障碍或睡眠呼吸暂停综合征。

另外，本发明为一种阿片肽分解用饮食品组合物，其以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分。

另外，本发明为一种双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物在制造阿片肽分解用组合物中的应用。

另外，本发明为一种用于分解阿片肽的双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物。

另外，本发明为一种双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物的用于分解阿片肽的应用。

另外，本发明为一种分解阿片肽的方法，其包括如下步骤：向哺乳动物给予双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物。

发明的效果

对于本发明的以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分的、阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物、阿片肽分解用药物组合物和阿片肽分解用饮食品组合物而言，由于以作为经口组合物成分可长期使用的双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分，因此对患有各种疾病的患者也能安心地给药。另外，由于双歧杆菌属细菌还存在于动物的肠道内，因此可期待即使长期、连续地给予也不易产生副作用。

因此，根据本发明，能够提供对饮食习惯没有制限、即使日常利用也没有副作用、能够安心地持续利用的、阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物、阿片肽分解用药物组合物和阿片肽分解用饮食品组合物。此外，通过利用该阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物和阿片肽分解用饮食品组合物，从而能够使主要来源于食品的阿片肽未被分解就直接被消化道吸收的情况得到抑制。

具体实施方式

接着，对本发明的优选的实施方式进行说明。但是本发明不受以下的优选的实施方式限定，可以在本发明的范围内自由变更。需要说明的是，在本说明书中，百分率只要没有特别声明则为基于质量的表示。

＜阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物＞

本发明的阿片肽分解剂主要分解来源于食品的阿片肽，包含双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分。需要说明书的是，本发明的阿片肽分解剂包含双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分，且并不排除包含其它成分。即，本发明的阿片肽分解剂与阿片肽分解用组合物为同等。因此，本发明的其它方式是以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分的阿片肽分解用组合物。

另外，该组合物中的双歧杆菌属细菌的含量优选为1×10⁶～1×10¹²CFU/g或1×10⁶～1×10¹²CFU/mL，更优选为1×10⁷～1×10¹¹CFU/g或1×10⁷～1×10¹¹CFU/mL，进一步优选为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/g或1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。该细菌为死菌时，CFU可以替换为个细胞(cells)。

本发明的双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和前述细菌的菌体处理物具有与作为二肽氨基肽酶之一的二肽基肽酶-4(Dipeptidyl Peptidase-4：DPP-4)同样的酶活性。

已知，DPP-4是具有从蛋白或肽的氨基侧末端切除二肽的作用的外肽酶，是具有分解作为阿片肽的酪啡肽类的活性的酶(G.Puschel et al.,Eur.J.Biochem.,126(2),pp.359-365,1982)。

需要说明的是，本说明书中，“DPP-4活性”是指显示出与DPP-4相同或相似的酶活性，具体而言，是指分解DPP-4特异性底物的活性。作为DPP-4特异性底物，可列举出从氨基侧末端起第2位包含脯氨酸残基或丙氨酸残基的蛋白质、肽。

另外，本发明的其它方案为阿片肽分解用组合物的制造方法，其包括在组合物原料中添加本发明的双歧杆菌属细菌的工序。该制造方法包括饮食品组合物的制造方法，所述饮食品组合物的制造方法包括在饮食品组合物原料中添加本发明的双歧杆菌属细菌的工序。另外，该制造方法包括药物组合物的制造方法，所述药物组合物的制造方法包括在药物组合物原料(例如，基质等)中添加双歧杆菌属细菌的工序。

该阿片肽分解用组合物的制造方法中使用的双歧杆菌属细菌可以是活菌或死菌，还可以是包含活菌和死菌这两者的物质。进而，可以是双歧杆菌属细菌的培养物，还可以是菌体处理物。另外，对于该阿片肽分解用组合物的制造方法，双歧杆菌属细菌可以在培养、浓缩或冷冻干燥后添加至组合物原料中，还可以在将双歧杆菌属细菌添加至组合物原料中后培养该双歧杆菌属细菌。

(1)双歧杆菌属细菌

能够在本发明中使用的双歧杆菌属细菌只要不损害本发明的效果就可以使用公知的双歧杆菌属细菌。例如可以示例出：长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longumsubsp.longum)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、假链双歧杆菌(Bifidobacteriumpsudocatenulatum)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis subsp.animalis)、假长双歧杆菌球形亚种(Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosum)、假长双歧杆菌假长亚种(Bifidobacterium pseudolongum subsp.pseudolongm)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)等。需要说明的是，长双歧杆菌长亚种有时还简记为长双歧杆菌。另外，长双歧杆菌婴儿亚种有时还简记为婴儿双歧杆菌。

具体而言，可以示例出：长双歧杆菌长亚种ATCC15707(Bifidobacterium longumsubsp.longum ATCC15707)、长双歧杆菌长亚种ATCC BAA-999(Bifidobacterium longumsubsp.longum ATCC BAA-999)或长双歧杆菌长亚种BB536(NITE BP-02621)(Bifidobacterium longum subsp.longum BB536(NITE BP-02621))、长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697(Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC15697)、长双歧杆菌婴儿亚种BCCM LMG23728(Bifidobacterium longum subsp.infantis BCCM LMG23728)或长双歧杆菌婴儿亚种M-63(NITE BP-02623)(Bifidobacterium longum subsp.infantis M-63(NITEBP-02623))、短双歧杆菌ATCC15700(Bifidobacterium breve ATCC15700)、短双歧杆菌FERM BP-11175(Bifidobacterium breve FERM BP-11175)、短双歧杆菌BCCM LMG23729(Bifidobacterium breve BCCM LMG23729)或短双歧杆菌M-16V(NITE BP-02622)(Bifidobacterium breve M-16V(NITE BP-02622))、两歧双歧杆菌ATCC29521(Bifidobacterium bifidum ATCC29521)、青春双歧杆菌ATCC15703(Bifidobacteriumadolescentis ATCC15703)、角双歧杆菌ATCC27535(Bifidobacterium angulatumATCC27535)、齿双歧杆菌DSM20436(Bifidobacterium dentium DSM20436)、假链双歧杆菌ATCC27919(Bifidobacterium psudocatenulatum ATCC27919)、动物双歧杆菌乳亚种DSM10140(Bifidobacterium animalis subsp.lactis DSM10140)、动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527(Bifidobacterium animalis subsp.animalis ATCC25527)、假长双歧杆菌球形亚种JCM5820(Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosum JCM5820)、假长双歧杆菌假长亚种ATCC25526(Bifidobacterium pseudolongum subsp.pseudolongm ATCC25526)、嗜热双歧杆菌ATCC25525(Bifidobacterium thermophilum ATCC25525)等。双歧杆菌属细菌可以仅使用一种，还可以使用任意的两种以上。

赋予了ATCC编号的细菌可以由研究美国典型培养物保藏中心(地址：12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,United States of America)获得。

赋予了BCCM编号的细菌可以由作为比利时的保存机构的比利时微生物协调保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)(地址：比利时、B-1000布鲁塞尔Shiatsu Street街(STREET CUP街)8)获得。

赋予了FERM BP-11175保藏编号的细菌于2009年8月25日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(现在的国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心、邮政编码：292-0818、地址：千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)进行了基于布达佩斯条约的国际保藏。

赋予了DSM编号的细菌可以由德国微生物保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(地址：Inhoffenstraβe7B,38124Braunschweig,Germany)获得。

赋予了JCM编号的细菌可以由日本菌种保藏管理中心JCM(Japan Collection ofMicroorganisms)(日本国立研究开发法人理化学研究所研究所生物资源中心微生物材料开发室、邮政编码：305-0074、地址：茨城县筑波市高野台3-1-1)获得。

需要说明书的是，长双歧杆菌长亚种ATCC BAA-999与长双歧杆菌长亚种BB536(NITE BP-02621)为相同的细菌，在优选的方式中还可以使用任意的细菌。长双歧杆菌长亚种BB536(NITE BP-02621)于2018年1月26日以NITE BP-02621保藏编号、在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(邮政编码：292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)进行了基于布达佩斯条约的国际保藏。

另外，长双歧杆菌婴儿亚种BCCM LMG23728与长双歧杆菌婴儿亚种M-63(NITE BP-02623)为相同的细菌，在优选的方式中还可以使用任意的细菌。长双歧杆菌婴儿亚种M-63(NITE BP-02623)于2018年1月26日以NITE BP-02623保藏编号、在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(邮政编码：292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)进行了基于布达佩斯条约的国际保藏。

另外，短双歧杆菌BCCM LMG23729与短双歧杆菌M-16V(NITE BP-02622)为相同的细菌，在优选的方式中还可以使用任意的细菌。短双歧杆菌M-16V(NITE BP-02622)于2018年1月26日以NITE BP-02622保藏编号、在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(邮政编码：292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)进行了基于布达佩斯条约的国际保藏。

本发明的双歧杆菌属细菌不限制于前述保藏菌，还可以是与前述保藏菌实质上同等的细菌。与前述保藏菌实质上同等的细菌是指与前述保藏菌为同属或同种细菌，在让对象摄取或向对象给予前述细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物时，能够在该对象中分解阿片肽，其16SrRNA基因的碱基序列与前述保藏菌的16SrRNA基因的碱基序列具有98％以上、优选为99％以上、更优选为100％的同源性，且优选为除了前述同源性之外与前述保藏菌具有相同的菌学性质的细菌。另外，本发明的双歧杆菌属细菌只要不损害本发明的效果就可以是通过突变处理、基因重组、自然突变株的选择等由前述保藏菌或与其实质上同等的细菌进行育种而得到的细菌。

其中，本发明优选使用人体常驻性的双歧杆菌属细菌。双歧杆菌属细菌除了人以外还栖息在昆虫、小动物中，栖息地(宿主)受到菌种的限定，主要栖息在人体中的双歧杆菌属细菌称为人体常驻性双歧杆菌属细菌(HRB：Human-residential bifidobacteria)，除此以外称为non-HRB。作为HRB，可以示例出：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、假链双歧杆菌(Bifidobacterium psudocatenulatum)等。

进而，本发明的HRB中更优选婴幼儿常驻性的双歧杆菌属细菌。作为婴幼儿常驻性的HRB，可以示例出：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等。

本发明中使用的双歧杆菌属细菌只要具有与上述双歧杆菌属细菌同等以上的阿片肽分解效果，就还可以是上述双歧杆菌属细菌的突变株。某种突变株是否具有与上述双歧杆菌属细菌“同等以上的阿片肽分解效果”例如可以通过如下方式加以确认：测定后述的双歧杆菌属细菌的DPP-4活性；测定作为阿片肽的β-酪啡肽的消耗率(分解率)。

这样的突变株可以通过非人为地在上述双歧杆菌属细菌中导入突变来构建。另外，可以通过使用了UV等突变原的处理在上述细菌中导入突变来构建，还可以通过各种基因操作法在上述株导入突变来构建。

本发明中，DPP-4活性可以通过如下方式确认：将双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物与DPP-4特异性荧光底物混合，对培养的培养物的荧光强度进行测定。即，基于前述培养物的荧光强度，使用表示前述荧光底物来源的荧光物质的浓度与荧光强度的关系的校正曲线，计算出前述培养物中的荧光物质浓度，进而，将在1分钟内产生的荧光物质1nmol作为1单位酶(U)，由此能够确定双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物的酶活性(DPP-4活性)。

例如可以如下方式确定酶活性(DPP-4活性)：从双歧杆菌属细菌的培养物分离菌体并悬浮于PBS溶液中来制备悬浮液，将该悬浮液稀释并使浊度(OD600)为0.1，然后添加作为DPP-4特异性荧光底物的H-Gly-Pro-AMC·HBr(BACHEM公司制)并在37℃下厌氧培养60分钟，培养结束后通过microplate reader SH-9000(Corona Electric公司制)等荧光测定装置，基于在激发波长380nm、测定波长460nm下测定的培养物的荧光强度来确定酶活性(DPP-4活性)。

本发明中，DPP-4活性只要优选为0.5mU以上，更优选为0.7mU以上，进一步优选为1.0mU以上，就能够适宜地发挥本发明的阿片肽分解效果。

另外，本发明中，β-酪啡肽的消耗率(分解率)可以通过如下方式计算出：混合双歧杆菌属细菌和β-酪啡肽并进行培养，使用培养物中的β-酪啡肽浓度并利用下述式子计算出。

〔β-酪啡肽的消耗率(％)〕＝100-(〔培养后的培养物中的β-酪啡肽浓度〕÷〔培养前的培养物中的β-酪啡肽浓度〕)×100

具体而言，可以如后述的试验例3所述进行确认。

本发明中，β-酪啡肽的消耗率(分解率)只要优选为40％以上，更优选为50％以上，进一步优选为60％以上，就能够适宜地发挥本发明的阿片肽分解效果。

本发明中使用的双歧杆菌属细菌和前述细菌的培养物可以通过利用常规方法培养双歧杆菌属细菌而容易地得到。培养方法只要能使双歧杆菌属细菌增殖就没有特别限定，可以根据细菌的性质在适合的条件下进行培养。例如，培养温度可以为25～50℃，优选为35～42℃。另外培养优选在厌氧条件下进行，例如，可以边通入二氧化碳等厌氧气体边进行培养。另外，液体静置培养等还可以在微好氧条件下进行培养。

作为培养本发明中使用的双歧杆菌属细菌培养基，没有特别限定，可以使用在培养双歧杆菌属细菌时通常使用的培养基。即，作为碳源，例如，可以根据同化性而使用葡萄糖、半乳糖、果糖、***糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、淀粉水解物、废糖蜜等糖类。作为氮源，例如可以使用：氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等铵盐类、硝酸盐类。另外，作为无机盐类，例如可以使用：氯化钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、氯化钙、硝酸钙、氯化锰、硫酸亚铁等。另外，可以使用：蛋白胨、大豆粉、脱脂豆粕、肉提取物、酵母提取物等有机成分。

本发明中使用的双歧杆菌属细菌如以上的说明所述，可以以细菌本身、前述细菌的培养物或前述细菌的菌体处理物的形态使用。即，可以是双歧杆菌属细菌本身，可以直接使用培养双歧杆菌属细菌后得到的培养物，可以进行稀释或浓缩后使用，还可以使用从培养物回收的菌体。另外，本发明中使用的双歧杆菌属细菌可以是活菌或死菌，还可以是包含活菌和死菌这两者的物质。

另外，作为前述细菌的菌体处理物，例如可列举出：用丙烯酰胺、卡拉胶等将菌体固定化后的固定化菌体；利用超声波处理、均质器处理等常规方法使菌体的细胞壁和细胞膜的一部分或完全破碎而得到的细胞破碎物等。

进而，前述细胞破碎物可以是前述破碎后的全部级分或一部分级分，还可以是前述破碎后的离心分离上清液、通过硫酸铵处理等将该上清液部分纯化而得到的级分、或将前述上清液浓缩而得到的物质。

作为本发明中使用的双歧杆菌属细菌的具体形态，例如可列举出其菌体悬浮液、前述菌体(细菌)的细胞破碎物的水溶性级分、沉淀再悬浮液等，其中，由于阿片肽分解活性高而优选前述菌体(细菌)的细胞破碎物的水溶性级分。

需要说明的是，本说明书中的“菌体悬浮液”是使对本发明中使用的双歧杆菌属细菌的培养液进行离心分离等而得到的菌体悬浮后的溶液，优选为通过后述的实施例的试验例2的(2)中记载的处理而得到的溶液。

另外，本说明书中的“水溶性级分”是对上述细胞破碎物进行离心分离等而得到的上清液，优选为通过后述的实施例的试验例2的(2)中记载的处理而最终得到的上清液。该水溶性级分更优选利用常规方法进行适宜纯化或浓缩而得到的水溶性级分。

进而，本说明书中的“沉淀再悬浮液”是使对上述细胞破碎物进行离心分离等而得到的沉淀物悬浮后的溶液，优选为使通过后述的实施例的试验例2的(2)中记载的处理而最终得到的沉淀物悬浮后的溶液。

(2)阿片肽

阿片肽是与阿片受体结合并显示出各种生理活性的肽。阿片肽中存在有在生物体内合成的内源性的肽和外源性的肽，但本发明的阿片肽优选为外源性的阿片肽，更优选为来源于食品的阿片肽。作为来源于食品的阿片肽，可以示例出β-酪啡肽和人麦醇溶蛋白(Gliadorphin)等。

＜药物组合物＞

本发明的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物可以用作药物组合物。已知若阿片肽未被分解就直接被消化道吸收至体内，则会对自闭症、艾斯伯格症候群、Rett综合征、童年瓦解性障碍等的症状产生影响(专利文献1)。例如，报道了：自闭症孩子中作为阿片肽的β-酪啡肽的尿中浓度越高儿童自闭症评定量表(Childhood Autism Rating Scale：CARS)的值越高(O.Sokolov et al.,Peptides,56,pp.68-71,2014)。另外，报道了：发生如呼吸暂停那样的婴幼儿突发性危及生命事件(apparent life threating events：ALTE)的婴儿血液中的β-酪啡肽浓度与健康儿童相比为高值，且作为分解β-酪啡肽的酶的DPP-4的活性与健康儿童相比为低值(J.Wasilewska et al.,Nuropeptides,45,pp.189-195,2011)。

因此，本发明的药物组合物能够用于预防和/或治疗与阿片肽相关的疾病。作为与阿片肽相关的疾病，可以示例出：自闭症、艾斯伯格症候群、Rett综合征、童年瓦解性障碍或睡眠呼吸暂停综合征等。

另外，由于本发明的药物组合物以作为经口组合物成分可长期使用的双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分，因此对患有各种疾病的患者也能安心地给药。另外，双歧杆菌属细菌也存在于动物的肠道内，因此可期待即使长期、连续地给药也不易产生副作用。另外，由于本发明的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分，因此对婴幼儿、儿童也能安全地给予。因此，本发明的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物适用于预防和/或治疗婴幼儿、儿童的疾病。

在使用本发明的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物作为药物组合物的情况下，该药物组合物可以是经口给药和非经口给药中的任意者，根据给药方法，可以将其适宜地制成期望的剂型。例如，在经口给药的情况下，可以制剂化成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体制剂；溶液剂、糖浆剂、悬浮剂、乳剂等液体制剂等。另外，在非经口给药的情况下，可以制剂化成栓剂、软膏剂等。

另外，在制剂化时，除了本发明的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物之外，还可以使用通常在制剂化中使用的赋形剂、pH调节剂、着色剂、娇味剂等成分。另外，只要不损害本发明的效果，就可以组合使用本发明的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物、及公知的或未来发现对阿片肽相关的疾病具有预防和/或治疗效果的成分。

而且，制剂化可以根据剂型而适当利用公知方法来实施。在制剂化时，可以适当配合制剂载体而进行制剂化。

本发明的药物组合物的摄取量或给药量可以根据剂型进行适宜选择，例如，相对于体重1kg每1天的双歧杆菌属细菌的摄取量或给药量优选1×10⁶～1×10¹²CFU/kg/天，更优选1×10⁷～1×10¹¹CFU/kg/天，进一步优选1×10⁸～1×10¹⁰CFU/kg/天。需要说明的是，前述单位中CFU是集落形成单位(colony forming units)的简写，是菌落形成单位。该细菌为死菌时，CFU可以替换为个细胞(cells)。

另外，使用双歧杆菌属细菌的培养物、前述细菌的菌体处理物时的摄取量或给药量在换算为双歧杆菌属细菌的摄取量或给药量的情况下优选为上述摄取量或给药量。

另外，本发明的药物组合物中的双歧杆菌属细菌的含量可以基于前述摄取量或给药量进行适宜选择。例如可以为1×10⁶～1×10¹²CFU/g或1×10⁶～1×10¹²CFU/mL，优选为1×10⁷～1×10¹¹CFU/g或1×10⁷～1×10¹¹CFU/mL，更优选为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/g或1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。该细菌为死菌时，CFU可以替换为个细胞(cells)。

另外，使用双歧杆菌属细菌的培养物、前述细菌的菌体处理物时的含量在换算为双歧杆菌属细菌的含量的情况下优选为上述含量。

另外，作为上述制剂载体，可根据剂型使用各种有机或无机的载体。作为固态制剂情况下的载体，可列举例如赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味矫臭剂等。

作为赋形剂，可列举例如：乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等糖衍生物；玉米淀粉、马铃薯淀粉、α-淀粉、糊精、羧甲基淀粉等淀粉衍生物；结晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙等纤维素衍生物；***胶；葡聚糖；普鲁兰多糖；轻质无水硅酸、合成硅酸铝、偏硅酸铝酸镁等硅酸盐衍生物；磷酸钙等磷酸盐衍生物；碳酸钙等碳酸盐衍生物；硫酸钙等硫酸盐衍生物等。

作为结合剂，例如除了上述赋形剂以外还可列举：明胶；聚乙烯基吡咯烷酮；Macrogol等。

作为崩解剂，例如除了上述赋形剂以外还可列举：交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯基吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉或纤维素衍生物等。

作为润滑剂，可列举例如：滑石；硬脂酸；硬脂酸钙、硬脂酸镁等硬脂酸金属盐；硅胶；胶状硅酸镁铝(VEEGUM)、鲸蜡等蜡类；硼酸；甘醇；富马酸、己二酸等羧酸类；苯甲酸钠等羧酸钠盐；硫酸钠等硫酸盐类；亮氨酸；月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁等月桂基硫酸盐；硅酸酐、硅酸水合物等硅酸类；淀粉衍生物等。

作为稳定剂，可列举例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯代丁醇、苯甲醇、苯乙醇等醇类；苯扎氯铵；乙酸酐；山梨酸等。

作为矫味矫臭剂，可列举例如甜味剂、酸味剂、香料等。

需要说明的是，作为经口给药用的液体制剂所使用的载体，可列举水等溶剂、矫味矫臭剂等。

＜饮食品组合物＞

进而，本发明的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物可以用作饮食品组合物。本发明的饮食品组合物可以通过在公知的饮食品中添加双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物而制造，或者还可以通过在饮食品的原料中混合双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物而制成新的饮食品组合物。另外，本发明的饮食品组合物还可以利用如下制造方法来制造，所述方法包括如下工序：在饮食品原料中添加双歧杆菌属细菌后对该双歧杆菌属细菌进行培养。

通过经口摄取含有双歧杆菌属细菌的饮食品组合物，在体内(肠道)增殖的双歧杆菌属细菌会分解阿片肽，因此能够使阿片肽未被分解就直接被消化道吸收至体内的情况得到抑制。

本发明中的饮食品组合物无论液态、膏状、固体、粉末等形态，除了片剂状糖果、流食、饲料(包括宠物用)等以外，还可列举例如：小麦粉制品、速食食品、农产加工品、水产加工品、畜产加工品、乳/乳制品、油脂类、基础调味料、复合调味料/食品类、冷冻食品、点心类、饮料、这些以外的市售品等。另外，只要不损害本发明的效果，就可以在本发明的饮食品组合物中使用公知的或未来发现的具有益活菌效果的成分或辅助益活菌效果的成分。例如，本发明的饮食品组合物可以包含乳清蛋白质、酪蛋白蛋白质、大豆蛋白质、或豌豆蛋白质(p蛋白)等各种蛋白质或其混合物、分解物；亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺等氨基酸；维生素B6或维生素C等维生素类；肌酸；柠檬酸；鱼油；或者，低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚果糖、乳酮糖等低聚糖等的成分。

另外，本发明中定义的饮食品组合物可以以表示出阿片肽相关的疾病的预防、疾病的风险降低、疾病的症状缓和/或疾病的治疗等用途(包括保健用途)的饮食品的形式提供/贩卖。

“标示”行为包括用于使需要者知悉上述用途的全部行为，只要是可想起/类推上述用途的表现方式则不论标示目的、标示内容、标示对象物/介质等如何，均相当于本发明的“标示”行为。

另外，“标示”优选通过使需要者直接意识到上述用途的表现方式来进行。具体而言，可列举对在饮食品的商品或商品的包装上记载了上述用途的物品进行转让、交货、为了转让或交货而进行展示、进口的行为；在与商品有关的广告、价格表或交易文件中记载上述用途并展示或发布、或在以这些为内容的信息中记载上述用途并通过电磁方法(互联网等)进行提供的行为；等。

另一方面，标示内容优选为得到行政等许可的标示(例如，基于行政规定的各种制度而得到许可、并以基于该得到许可的形态进行的标示)。另外优选在包装、容器、商品目录、宣传手册、POP等销售现场的宣传材料、其他文件等中带有这样的标示内容。

另外，作为“标示”，可例示出作为健康食品、功能性食品、经肠营养食品、特别用途食品、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能食品、功能性标示食品、药物用部外品等的标示。这些中，可特别列举：经消费厅许可的标示，例如被特定保健用食品、营养功能食品、或功能性标示食品相关的制度、或与这些类似的制度许可的标示等。具体可列举：作为特定保健用食品的标示、作为附加条件的特定保健用食品的标示、主旨为对身体的结构和功能带来影响的标示、降低疾病风险的标示、基于科学根据的功能性的标示等，更具体而言，典型的例子为：作为关于健康增进法中规定的特别用途标示的许可等的内阁府令(平成二十一年八月三十一日内閣府令第五十七号)所确定的特定保健用食品的标示(特别是保健用途的标示)及与其类似的标示。

本发明的饮食品组合物的摄取量可以适宜选择，例如，相对于体重1kg每1天的双歧杆菌属细菌的摄取量优选1×10⁶～1×10¹²CFU/kg/天，更优选1×10⁷～1×10¹¹CFU/kg/天，进一步优选1×10⁸～1×10¹⁰CFU/kg/天。该细菌为死菌时，CFU可以替换为个细胞(cells)。

另外，使用双歧杆菌属细菌的培养物、前述细菌的菌体处理物时的摄取量在换算为双歧杆菌属细菌的摄取量的情况下优选为上述摄取量。

另外，本发明的饮食品组合物中的双歧杆菌属细菌的含量可以基于前述摄取量进行适宜选择，例如可以为1×10⁶～1×10¹²CFU/g或1×10⁶～1×10¹²CFU/mL，优选为1×10⁷～1×10¹¹CFU/g或1×10⁷～1×10¹¹CFU/mL，更优选为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/g或1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。该细菌为死菌时，CFU可以替换为个细胞(cells)。

另外，使用双歧杆菌属细菌的培养物、前述细菌的菌体处理物时的含量在换算为双歧杆菌属细菌的含量的情况下优选为上述含量。

本发明的阿片肽分解用饮食品组合物可以用作人或动物用的饮食品组合物。另外，本发明的阿片肽分解用饮食品组合物对于自闭症、艾斯伯格症候群、Rett综合征、童年瓦解性障碍或睡眠呼吸暂停综合征等与阿片肽相关的疾病的预防和/或治疗是有效的。由于本发明的阿片肽分解用饮食品组合物以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分，因此能够对婴幼儿、儿童进行安全地给药。因此，本发明的阿片肽分解用饮食品组合物还适用于婴幼儿、儿童中的疾病的预防和/或治疗。

进而，本发明还可以采用以下的构成。需要说明书的是，作为下述的哺乳动物，可列举出人、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、马等。

[1]一种双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物在制造阿片肽分解用组合物或阿片肽分解用药物中的应用。

[2]一种用于分解阿片肽的双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物。

[3]一种用于通过阿片肽的分解而能得到缓和、预防或治疗的疾病的缓和、预防或治疗的双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物。

[4]一种双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物的用于分解阿片肽的应用。

[5]一种分解阿片肽的方法，其包括如下步骤：向哺乳动物给予双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物。

[6]一种分解阿片肽的方法，其包括如下步骤：向哺乳动物给予以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物。

[7]一种通过阿片肽的分解而能得到缓和、预防或治疗的疾病的缓和方法、预防方法或治疗方法，其包括如下步骤：向哺乳动物给予双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物。

[8]一种通过阿片肽的分解而能得到缓和、预防或治疗的疾病的缓和方法、预防方法或治疗方法，其包括如下步骤：向哺乳动物给予以双歧杆菌属细菌、前述细菌的培养物和/或前述细菌的菌体处理物作为有效成分的阿片肽分解剂或阿片肽分解用组合物。

实施例

以下使用实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不限定于这些实施例。

[试验例1]

进行了试验对双歧杆菌属细菌具有DPP-4活性进行确认。

(1)培养液的制备

分别将在包含谷氨酸钠1％和脱脂奶粉10％的水溶液中冷冻保存的以下17种双歧杆菌属细菌(HRB12种和non-HRB5种)的菌液90μL添加至MRS液体培养基3mL中，在37℃下进行16小时厌氧培养以使双歧杆菌属细菌的菌数为1×10⁹CFU/mL。MRS液体培养基通过如下方式制备：将Difco Lactobacilli MRS Broth(BD公司制)5.5g和L-半胱氨酸盐酸盐单水合物(和光纯药工业株式会社制)50mg溶解于纯水中制成100mL，用HCl水溶液调节为pH6.5，在121℃下进行15分钟灭菌而制备。

＜人常驻性的双歧杆菌属细菌(HRB)＞

·长双歧杆菌长亚种ATCC 15707

·长双歧杆菌长亚种ATCC BAA-999

·长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697

·长双歧杆菌婴儿亚种BCCM LMG23728

·短双歧杆菌ATCC 15700

·短双歧杆菌FERM BP-11175

·短双歧杆菌BCCM LMG23729

·两歧双歧杆菌ATCC 29521

·青春双歧杆菌ATCC 15703

·角双歧杆菌ATCC 27535

·齿双歧杆菌DSM 20436

·假链双歧杆菌ATCC 27919

＜非人常驻性的双歧杆菌属细菌(non-HRB)＞

·动物双歧杆菌乳亚种DSM 10140

·动物双歧杆菌动物亚种ATCC 25527

·假长双歧杆菌球形亚种JCM 5820

·假长双歧杆菌假长亚种ATCC 25526

·嗜热双歧杆菌ATCC 25525

(2)DPP-4活性的测定

将(1)中制备的各培养液在4℃、5000×g的条件下进行30分钟离心处理，然后丢弃上清液，将分离的菌体悬浮于PBS溶液中。将各悬浮液的浊度(OD600)统一制成0.1，添加作为DPP-4特异性荧光底物的H-Gly-Pro-AMC·HBr(BACHEM公司制)并在37℃下厌氧培养60分钟。培养结束后，使用microplate reader SH-9000(Corona Electric公司制)在激发波长360nm、测定波长460nm下测定了培养物的荧光强度。需要说明的是，荧光强度的单位为任意单位(arbitrary unit:a.u.)。基于测定的荧光强度，使用表示预先制作的前述荧光底物来源的荧光物质(AMC：氨基甲基香豆素)浓度与测定波长460nm中的荧光强度的关系的校正曲线，计算出培养物中的AMC浓度(nM)。进而，基于该AMC浓度，将在1分钟内产生的AMC的1nmol作为1酶单位(U)，计算出各双歧杆菌属细菌的酶活性。

(3)结果

各双歧杆菌属细菌的荧光强度和酶活性如表1所示。确认了全部17种双歧杆菌属细菌显示出分解DPP-4特异性荧光底物的活性。即，确认了全部17种双歧杆菌属细菌具有DPP-4的酶活性。另外，确认了作为HRB的双歧杆菌属细菌与non-HRB的双歧杆菌属细菌相比有DPP-4活性增高的倾向。进而，长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697、短双歧杆菌FERM BP-11175、短双歧杆菌BCCM LMG23729和短双歧杆菌ATCC15700等婴幼儿常驻性的双歧杆菌属细菌的DPP-4活性在HRB中特别高，与non-HRB的动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527的DPP-4活性相比，均显示出5倍以上的酶活性，启示出具有较强的DPP-4活性。

[表1]

表1

[试验例2]

进而，使用作为HRB的短双歧杆菌FERM BP-11175和作为non-HRB的动物双歧杆菌乳亚种DSM10140，分别进行了确定DPP-4活性高的级分的试验。

(1)培养液的制备

按照与试验例1的(1)同样的步骤，制备了前述2种双歧杆菌属细菌的培养液。

(2)超声波破碎处理

将(1)中制备的各培养液在4℃、5000×g的条件下进行30分钟离心处理，然后丢弃上清液，将分离的菌体悬浮于PBS溶液中，得到了“菌体悬浮液”。对于各悬浮液，使用BRANSON SONIFIER 250(Branson Ultrasonics公司制)并利用超声波处理将菌体的细胞破碎，然后以16000×g、4℃进行30分钟离心分离。然后，回收上清液作为“水溶性级分”，将沉淀物再次悬浮于PBS溶液中，得到了“沉淀再悬浮液”。

(3)DPP-4活性的测定

对于(2)中回收的水溶性级分和沉淀再悬浮液，按照试验例1的(2)的步骤测定荧光强度并计算出酶活性。

(4)结果

各样品的酶活性如表2所示。对于任意的双歧杆菌属细菌也确认了水溶性级分的酶活性高于沉淀再悬浮液的酶活性。进而，对于任意的双歧杆菌属细菌，水溶性级分的酶活性也高于试验例1中确认的菌体悬浮液的酶活性。

另外，上述2种水溶性级分中，作为HRB的短双歧杆菌FERM BP-11175的活性高于作为non-HRB的双歧杆菌乳亚种DSM 10140的活性，前者为后者的1.3倍以上。因此，启示出水溶性级分具有显著的阿片肽分解活性。

[表2]

表2

[试验例3]

进而，对于以下4种在试验例1中确认了具有DPP-4活性的双歧杆菌属细菌，进行了用于确认作为阿片肽的β-酪啡肽的分解活性的试验。另外，对于短双歧杆菌FERM BP-11175和动物双歧杆菌乳亚种DSM10140这2种，也确认了对人麦醇溶蛋白的分解活性。

·短双歧杆菌BCCM LMG23729

·短双歧杆菌FERM BP-11175

·动物双歧杆菌乳亚种DSM10140

·动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527

(1)培养液的制备

按照与试验例1的(1)同样的步骤，制备了前述4种双歧杆菌属细菌的培养液。

(2)β-酪啡肽和人麦醇溶蛋白的分解活性的测定

将(1)中制备的各培养液在4℃、5000×g的条件下进行30分钟离心处理，然后丢弃上清液，将分离的菌体悬浮于PBS溶液中。对于各悬浮液，用细菌计数器(DU-AA01NP-H,Panasonic公司制)进行计数而制备菌数(10¹¹个/ml)后，以成为100μg/ml的方式添加β-酪啡肽(β-Casomorphin 1-7human,SIGMA-ALDORICH公司制)或人麦醇溶蛋白(Gliadorphin-7、Bachem公司制)并在37℃下进行1小时厌氧培养。将培养后的悬浮液在4℃、5000×g的条件下进行30分钟离心分离并回收上清液，在下述条件下通过HPLC(D-7000HPLC System、日立株式会社制)对该上清液进行分析，测定了残留的β-酪啡肽或人麦醇溶蛋白的浓度。

〔HPLC条件〕

柱：POROS R2/H,2.1mmD/100mmL(PerSeptive Biosystems公司制)

检测：280nm

流速：0.4ml/分钟

洗脱液A：0.1％TFA水

洗脱液B：0.1％TFA乙腈溶液

梯度：使洗脱液B的比例从5％在40分钟后上升至60％的线性梯度

接着，基于下述式子求出β-酪啡肽的消耗率(已分解的β-酪啡肽的比例)。

〔β-酪啡肽的消耗率(％)〕＝100-(〔培养后的培养物中的β-酪啡肽浓度〕÷〔培养前的培养物中的β-酪啡肽浓度〕)×100

另外，基于下述式子求出人麦醇溶蛋白的消耗率(已分解的人麦醇溶蛋白的比例)。

〔人麦醇溶蛋白的消耗率(％)〕＝100-(〔培养后的培养物中的人麦醇溶蛋白浓度〕÷〔培养前的培养物中的人麦醇溶蛋白浓度〕)×100

(3)结果

各双歧杆菌属细菌的β-酪啡肽或人麦醇溶蛋白的消耗率(已分解的β-酪啡肽或人麦醇溶蛋白的比例)如表3所示。

[表3]

表3

确认了任意的双歧杆菌属细菌也分解β-酪啡肽。进而，作为HRB的短双歧杆菌BCCMLMG23729和短双歧杆菌FERM BP-11175分别显示出93％和76％这样较高的β-酪啡肽消耗率。另一方面，作为non-HRB的动物双歧杆菌乳亚种DSM10140和动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527的β-酪啡肽消耗率分别为59％和5％。

另外，确认了任意的双歧杆菌属细菌也分解人麦醇溶蛋白。进而，作为HRB的短双歧杆菌FERM BP-11175的人麦醇溶蛋白消耗率为10％，作为non-HRB的动物双歧杆菌乳亚种DSM10140的人麦醇溶蛋白消耗率为6％。

因此，启示出HRB的双歧杆菌属细菌与non-HRB相比，能够有效地分解作为阿片肽的β-酪啡肽或人麦醇溶蛋白。此外，短双歧杆菌FERM BP-11175和动物双歧杆菌乳亚种DSM10140中，β-酪啡肽的消耗率均比人麦醇溶蛋白的消耗率高7倍以上。因此，启示出本发明的双歧杆菌属细菌作为阿片肽对β-酪啡肽的分解具有特别高的活性。

[试验例4]

进而，在DPP-4活性最高的双歧杆菌属细菌的水溶性级分中，进行了确认对作为HRB的短双歧杆菌BCCM LMG23729和作为non-HRB的动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527对β-酪啡肽的底物特异性是否相同的试验。

(1)培养液的制备

按照与试验例1的(1)同样的步骤，制备前述2种双歧杆菌属细菌的培养液，按照试验例2的(2)的步骤回收了水溶性级分。此处，利用与试验例2同样的方法确认了动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527的水溶性级分的DPP-4活性，结果与作为HRB的短双歧杆菌BCCMLMG23729的水溶性级分相比显示出0.4倍的荧光强度。基于该结果，将作为HRB的短双歧杆菌BCCM LMG23729的水溶性级分稀释至2.5倍，以使各细菌的水溶性级分在相同容量下具有相同的DPP-4活性。

(2)β-酪啡肽分解活性的测定

分别在前述(1)中制备的作为HRB的短双歧杆菌BCCM LMG23729的水溶性级分的2.5倍稀释液、及作为non-HRB的动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527的水溶性级分中以成为100μg/ml的方式添加β-酪啡肽(β-Casomorphin 1-7人,SIGMA-ALDORICH公司制)，在37℃下进行1小时厌氧培养。将培养后的各液在4℃、5000×g的条件下进行30分钟离心分离并回收上清液，按照与试验例3的(2)同样的步骤求出β-酪啡肽的消耗率(已分解的β-酪啡肽的比例)。

(3)结果

各双歧杆菌属细菌的β-酪啡肽的消耗率(已分解的β-酪啡肽的比例)如表4所示。

[表4]

表4

	β-酪啡肽消耗率
		短双歧杆菌BCCM LMG23729	45％
动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527	31％

作为HRB的短双歧杆菌BCCM LMG23729和作为non-HRB的动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527的情况，在以使DPP-4活性相同的方式进行了浓度调节的试样之间的比较中，作为阿片肽的β-酪啡肽的消耗率(已分解的β-酪啡肽的比例)也产生了10％以上的差异。其原因推测出与作为non-HRB的动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527相比，作为HRB的短双歧杆菌BCCM LMG23729对作为阿片肽的β-酪啡肽的底物特异性高。因此，由该结果也能够启示出：与non-HRB相比，HRB的双歧杆菌属细菌能够有效地降低作为阿片肽的β-酪啡肽。

[制造例1]

将选自试验例1中使用的17种双歧杆菌属细菌中的一种或多种分别添加或添加至同一MRS液体培养基3mL中，在37℃下进行16小时厌氧培养，将培养液浓缩，进行冷冻干燥，得到其一种或多种细菌的菌末。将该一种或多种菌末和赋形剂等适宜混合而制成片剂。以总量计菌的摄取量为1×10⁶～1×10¹²cfu/kg体重/天的方式每天摄取该片剂3个月。

通过该片剂的摄取而能够期待阿片肽分解效果。

[制造例2]

将试验例1中使用的17种双歧杆菌属细菌中的一种或多种分别添加或添加至同一MRS液体培养基3mL中，在37℃下进行16小时厌氧培养，将培养液浓缩，进行冷冻干燥，得到其一种或多种细菌的菌末。将该一种或多种菌末添加至发酵乳原料中而得到了发酵乳。以总量计菌的摄取量为1×10⁶～1×10¹²cfu/kg体重/天的方式每天摄取该发酵乳至少3个月。

通过该发酵乳的摄取而能够期待阿片肽分解效果。

[制造例3]

下述示出添加了选自试验例1中使用的17种双歧杆菌属细菌中的一种或多种细菌的配方奶粉的制造法。

将脱盐牛乳乳清蛋白质粉末(Mirai公司制)10kg、牛乳酪蛋白粉末(Fonterra公司制)6kg、乳糖(Mirai公司制)48kg、矿物混合物(富田制药社制)920g、维生素混合物(田边制药株式会社制)32g、乳酮糖(森永乳業社制)500g、棉子糖(Nippon Beet SugarManufacturing Co.,Ltd.制)500g和低聚半乳糖液糖(Yakult Pharmaceutical IndustryCo.,Ltd.制)900g溶解于温水300kg中，进而在90℃下加热溶解10分钟，添加制备脂肪(太阳油脂株式会社制)28kg并进行均质化。然后，进行灭菌、浓缩的工序并进行喷雾干燥，制备了配方奶粉约95kg。在其中，将选自试验例1中使用的17种双歧杆菌属细菌中的一种或多种分别添加或添加至同一MRS液体培养基3mL中，在37℃下进行16小时厌氧培养，将培养液浓缩，在进行冷冻干燥后加入用淀粉冲淡而得到的菌末(1.8×10¹¹cfu/g)100g而制备双歧杆菌/低聚糖配混配方奶粉约95kg。将得到的配方奶粉溶解于水中，制成作为标准调乳浓度的总固体成分浓度14％(w/V)的调乳液时，调乳液中的双歧杆菌数为2.7×10⁹cfu/100ml。通过摄取如上述那样得到的配方奶粉，从而能够期待阿片肽分解效果。

PCT/RO/134表