一种适用于提高血浆干粉功能的适配液
阅读说明：本技术 一种适用于提高血浆干粉功能的适配液 (Adaptation liquid suitable for improving function of plasma dry powder ) 是由 檀英霞 张士坤 宫锋 余群芳 李素波 张雪 贠志敏 高红伟 于 2020-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种适用于提高血浆干粉功能的适配液。该适配液包括甘氨酸、抗坏血酸和无菌水；其中,所述甘氨酸(Gly)和抗坏血酸(AA)的摩尔比为(23-93)：1。将血浆干粉用本发明提供的Gly-AA适配液重建血浆后,具有与FFP相似的体外特性,可生产适合于输血的产品。甘氨酸和抗坏血酸联用用于重建血浆,具有非挥发、无毒和低成本等优点,且甘氨酸已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于调节血浆产品的渗透压,使用浓度最高达80mM。抗坏血酸为临床用药物,且我们使用的是低浓度的抗坏血酸,具有很好的安全性。(The invention discloses an adaptation liquid suitable for improving the function of plasma dry powder. The adapter solution comprises glycine, ascorbic acid and sterile water; wherein the molar ratio of the glycine (Gly) to the Ascorbic Acid (AA) is (23-93): 1. after the plasma dry powder is used for reconstructing plasma by using the Gly-AA aptamer provided by the invention, the in vitro characteristics similar to FFP are obtained, and products suitable for blood transfusion can be produced. Glycine is used in combination with ascorbic acid for reconstitution of plasma, has the advantages of non-volatility, non-toxicity and low cost, and glycine has been approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for regulating the osmolality of plasma products, using concentrations up to 80 mM. The ascorbic acid is a clinical medicine, and the ascorbic acid with low concentration is used, so that the ascorbic acid has good safety.)
技术领域
本发明属于血液制品领域，具体涉及一种适用于提高血浆干粉功能的适配液。
背景技术
在自然灾害或公共紧急情况下，大出血合并凝血病是伤员死亡的主要原因。严重创伤后，快速输注新鲜冷冻血浆(fresh-frozen plasma，FFP)可纠正凝血障碍并减少出血，对于抢救伤员、提高存活率至关重要。目前，FFP和24小时内新鲜冷藏血浆是最常用的血浆产品。自然灾害急救的实际需求并扩展到军事用途，证实了血浆输注对于伤员救治、恢复体内平衡的重要性。
然而，在艰苦、偏远等特殊环境下使用冷冻血浆不仅不现实，而且大量血浆需求给运送带来极大挑战，不仅要考虑长距离复杂的冷链物流，还要考虑包装袋破损、不能及时使用(解冻约需30分钟)，解冻后造成浪费(5天内使用)等一系列问题；并且院前、自然灾害频发等严酷环境下，无法使用冰箱等制冷设备。由于存在物流障碍，阻碍了其在急性复苏期的使用。
而血浆干粉可克服上述问题，它具有易于储存和运输，无需后勤支持，便于伤后迅速实施、降低伤员死亡率等优点，可作为FFP的替代品，适合于院前输用。因此，从军用、民用和灾难预防的角度考虑，对血浆干粉的需求是一个紧急的国家卫生保健问题。血浆干粉目前有两种生产工艺，利用升华原理的冻干技术和利用高温快速气流的喷雾干燥技术。已经批准特殊环境下使用血浆冻干粉(freeze-dried plasma，FDP)的国家有：法国、德国、南非等。喷雾干燥技术作为冻干血浆的替代技术，喷雾风干血浆干粉(spray-dried plasma，SDP)尚未在临床使用，各国正在加紧研发。
血浆干粉的加工过程对血浆的理化性能产生影响，进而影响其功能活性。血浆干粉使用前需进行水化处理，以重建血浆。为了保持血浆干粉复溶后的理化特性，研发一种用于高效重建血浆且能最大限度恢复其功能活性的适配液，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于提高血浆干粉功能的适配液。该适配液用于高效重建血浆，最大限度恢复其功能活性，达到即溶即用的目的。
本发明所提供的适用于提高血浆干粉功能的适配液包括甘氨酸(Gly)、抗坏血酸(AA)和无菌水；其中，所述甘氨酸(Gly)和抗坏血酸(AA)的摩尔比可为(23-93)：1；优选摩尔比为45-50:1，具体摩尔比可为70:1.5。
当然，所述适配液也可只由甘氨酸(Gly)、抗坏血酸(AA)和无菌水组成。
所述适配液中甘氨酸和抗坏血酸的有效浓度范围分别为35-70mM和0.75-1.5mM；具体的所述适配液中甘氨酸和抗坏血酸的有效浓度范围分别为70mM和1.5mM；或所述适配液中甘氨酸和抗坏血酸的有效浓度范围分别为35mM和0.75mM。
根据本发明的一个实施例，所述适配液由1.4M甘氨酸(Gly)、0.03M抗坏血酸(AA)和无菌水组成；所述适配液的pH值为3.7。
使用该适配液重建血浆的方法如下：将所述适配液用无菌水稀释20倍后直接溶解血浆干粉(包括FDP和SDP)重建血浆。
根据本发明的另一个实施例，所述适配液由缓冲液B1和缓冲液B2按照体积比1:1的比例组成；所述缓冲液B1为50mM甘氨酸缓冲液，pH值为5.0，所述缓冲液B2由20mM甘氨酸、1.5mM抗坏血酸和无菌水组成，pH值为3.3。
使用该适配液重建血浆的方法如下：将缓冲液B1和缓冲液B2按照体积比1:1的比例混合后溶解血浆干粉(包括FDP和SDP)重建血浆。
本发明的另一个目的是提供一种重建血浆的方法。
本发明所提供的重建血浆的方法，包括下述步骤：用本发明所提供的适配液溶解血浆干粉，得到重建血浆。
所述重建血浆中甘氨酸的终浓度范围是35-70mM，抗坏血酸的终浓度范围是0.75-1.5mM。所用的浓度均在安全范围内(Gly最高使用浓度为80mM，AA最高使用浓度为15mM)。
所述血浆干粉包括冻干血浆干粉(FDP)和喷雾干燥血浆干粉(SDP)。
适配液的用量要保证与其配对的FFP中的总蛋白浓度相当，适配液溶解血浆干粉的浓度基本在85-95mg/mL。
不同浓度的Gly-AA适配液重建血浆后，与配对的FFP(对照)进行综合表征(pH值、渗透压、总蛋白、免疫球蛋白、出凝血相关参数、凝血活性参数等指标)。
用无菌水直接水化血浆干粉(FDP和SDP)，我们发现与配对的FFP相比，血浆pH升高(>8.0，表1)；血浆中的凝血因子VIII的活性降低(表2)；凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)等凝血参数均不在正常范围内(表3)；血栓弹力图中的凝血时间显著延长(R、K值升高或检测不到，表4)；而总蛋白(表5)、渗透压(表6)、免疫球蛋白(表7、8)等参数不受影响。
本发明还提供了一种用于血浆重建的组合物。
本发明所提供的用于血浆重建的组合物由甘氨酸和抗坏血酸组成；其中，所述甘氨酸和抗坏血酸(AA)的摩尔比为35：(0.375-1.5)；优选摩尔比为35：(0.75-1.5)。
本发明还提供了上述组合物的应用。
本发明所提供的应用是甘氨酸和抗坏血酸的组合物在制备适用于提高血浆干粉功能的适配液中的应用。
本发明选用了被FDA批准的调节渗透压的甘氨酸(glycine，Gly)和抗坏血酸(ascorbic acid，AA，别名维生素C，Vc，具有抗氧化、降低炎性细胞因子等特性)作为重建血浆的适配液(Gly-AA适配液)，实现血浆干粉样品的快速重建及功能恢复。
血浆干粉用Gly-AA适配液重建血浆后，具有与FFP相似的体外特性，可生产适合于输血的产品。甘氨酸和抗坏血酸联用用于重建血浆，具有非挥发、无毒和低成本等优点，且甘氨酸已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于调节血浆产品的渗透压，使用浓度最高达80mM。抗坏血酸为临床用药物，且我们使用的是低浓度的抗坏血酸，具有很好的安全性。
附图说明
图1为冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用水和实施例1制备的甘氨酸-抗坏血酸适配液(Gly-AAbuffer)重建血浆，可实现3-5分钟快速重建血浆，目视检查没有残留沉淀物，和新鲜冰冻血浆(FFP)有相似淡黄色外观。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的缩写如下：
FFP，新鲜冰冻血浆 FDP，冻干血浆干粉
SDP，喷雾干燥血浆干粉 FDP.H2O，无菌水重建血浆
SDP.H2O，无菌水重建血浆 FDP.buffer，适配液重建血浆
SDP.buffer，适配液重建血浆 PT，凝血酶原时间
APTT，活化部分凝血活酶时间 TP，总蛋白含量
R，凝血因子活性 K，纤维蛋白原功能
VWF-Ag，人血管性血友病因子抗原 ND，未检出
下述实施例中使用的新鲜冰冻血浆(FFP)、冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)的制备方法如下：
制备新鲜冰冻血浆(FFP)：新鲜分离的血浆放在-30℃保存，过夜后为FFP。
制备冻干血浆干粉(FDP)：将1个单位的冰冻血浆在37℃水浴锅内快速解冻，解冻后的血浆倒入托盘中，迅速倒入液氮，使之冷凝，使用四环冻干机(LGJ-25C)冷冻干燥机冻干(-55℃冻干24小时)，获得冻干血浆干粉。
制备喷雾干燥血浆干粉(SDP)：将1个单位的冰冻血浆在37℃水浴锅内快速解冻，解冻后的血浆通过喷雾干燥仪(B-290Mini Spray Dryer，BucHI，瑞士)进料口，在喷雾干燥的参数(进风温度为100-150℃，出口温度50-60℃)下，经过约20-30分钟，制备出淡黄色血浆干粉。
实施例1、重建血浆的适配液的配制及使用方法
该适配液由1.4M甘氨酸(Gly)、0.03M抗坏血酸(AA)和无菌水组成；所述适配液的pH值为3.30±0.42。
使用该适配液重建血浆的方法如下：将所述适配液用无菌水稀释20倍后直接溶解血浆干粉(包括FDP和SDP)重建血浆。
实施例2、重建血浆的适配液的配制及使用方法
该适配液由缓冲液B1和缓冲液B2按照体积比1:1的比例组成；所述缓冲液B1为50mM甘氨酸缓冲液，pH值为5.10±0.45所述缓冲液B2包括20mM甘氨酸、1.5mM抗坏血酸和无菌水，pH值为3.20±0.40。
使用该适配液重建血浆的方法如下：将缓冲液B1和缓冲液B2按照体积比1:1的比例混合后溶解血浆干粉(包括FDP和SDP)重建血浆。
实施例3、用适配液重建血浆效果评价
用无菌水重建冻干血浆干粉(FDP)：用无菌水溶解冻干血浆干粉(FDP)，得到浓度为85-90mg/mL的重建血浆(保证与原血浆蛋白浓度一致)，记为FDP.H2O。
用无菌水重建喷雾干燥血浆干粉(SDP)：用无菌水溶解喷雾干燥血浆干粉(SDP)，得到浓度为85-90mg/mL的重建血浆(保证与原血浆蛋白浓度一致)，记为SDP.H2O。
用实施例1或2的适配液重建冻干血浆干粉(FDP)：用适配液溶解冻干血浆干粉(FDP)，得到浓度为85-90mg/mL的重建血浆(保证与原血浆蛋白浓度一致)，记为FDP.buffer。
用实施例1或2的适配液重建喷雾干燥血浆干粉(SDP)：用适配液溶解喷雾干燥血浆干粉(SDP)，得到浓度为85-90mg/mL的重建血浆，记为SDP.buffer。
将上述重建血浆与配对的FFP(对照)进行综合表征(pH值、渗透压、总蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、出凝血相关参数、凝血活性参数等指标)。
用凝血分析仪(ACLTop700，Werfen沃芬公司，西班牙)测定冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后的血浆因子Ⅷ活性及VWF-Ag回收率(％)。结果见表3。
用斯塔高全自动血凝仪(STA Compact MAX，Stago公司，法国)检测冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后的凝血参数凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。结果见表4。
用西芬斯血栓弹力图仪(CFMS LEPU-8800，乐普科技公司，中国)检测冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后血栓弹力图的凝血参数(R凝血因子活性和K纤维蛋白原功能)。结果见表5。
用全自动生化分析仪(BECKMAN COULTER)冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后的总蛋白(TP)含量。结果见表6。
用晶体渗透压仪(210型，美国)冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后的晶体渗透压。结果见表7、表8。
用西门子BN2特种蛋白分析仪检测冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后的免疫球蛋白(IgM、IgG)含量变化。结果见表9。
用西门子BN2特种蛋白分析仪检测喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后的免疫球蛋白IgG是否变性(轻链的κ和λ链)。
下述表1-8中，每个表中涉及的某一样本的FFP\FDP\SDP源于同一份血浆。
表1冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和实施例1Gly-AA适配液重建血浆的pH值
表2冻干血浆干粉(FDP)分别用无菌水、实施例1、2的Gly-AA适配液重建血浆的pH值
表3冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和实施例1Gly-AA适配液重建血浆后的血浆因子Ⅷ活性及VWF-Ag回收率(％)
表4冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和实施例1Gly-AA适配液重建血浆后的凝血参数凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)
表5冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和实施例1Gly-AA适配液重建血浆后血栓弹力图的凝血参数(R凝血因子活性和K纤维蛋白原功能)
表6冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和实施例1Gly-AA适配液重建血浆后的总蛋白(TP)含量(单位g/L)
表7冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和实施例1Gly-AA适配液重建血浆后的晶体渗透压(单位mOsm/kg)
表8冻干血浆干粉(FDP)分别用无菌水和实施例1、2的Gly-AA适配液重建血浆后的晶体渗透压(单位mOsm/kg)
表9冻干血浆干粉(FDP)、喷雾干燥血浆干粉(SDP)用无菌水和Gly-AA适配液重建血浆后的免疫球蛋白(IgM、IgG)含量变化
表10喷雾干燥血浆干粉(SDP)用Gly-AA适配液重建血浆后的免疫球蛋白IgG是否变性(轻链的κ和λ链)
结果：
1、Gly-AA适配液可实现3-5分钟内重建液体血浆，目视检查没有残留沉淀物，和新鲜冰冻血浆(FFP)有相似淡黄色外观(见图1)。
3、pH值由水化重建血浆的8.35±0.48恢复到正常范围内7.58±0.21(表1)。
3、无菌水对凝血因子的回收率显著低于Gly-AA适配液，血浆因子FVIII活性由水化后的9.09±0.26％提高到65.51±17.35％，vWF-Ag由水化后的31.88+3.10％提高到70.01±17.42％，恢复到正常参考范围内(表3)。凝血酶原时间(PT)由水化后未检测出到28.47±10.54s和活化部分凝血活酶时间(APTT)由水化后未检测出缩短到97.08±25.79s(表4)。血栓弹力图参数凝血因子活性R由水化后的44.88±14.97s缩短到12±2.23s，纤维蛋白原功能K由水化后未检测缩短到3.4±0.34s(表5)。
4、无菌水和Gly-AA适配液重建血浆对血浆中的总蛋白(表6)，免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)(表9和10)等参数没有影响，与其配对的新鲜冰冻血浆FFP相当。
5、无菌水不影响重建血浆的晶体渗透压，而实施例1的Gly-AA适配液由于添加了甘氨酸重建血浆的晶体渗透压略有升高(332±5.66mOsm/kg)，实施例2的Gly-AA适配液中甘氨酸用量减少，使得重建血浆的渗透压相对稳定(304±5.66mOsm/kg)。(表7、表8)。
因此，在我们测试的浓度范围内，Gly-AA适配液重建血浆优于无菌水，可有效恢复血浆干粉的理化特性，重建血浆中pH值恢复到正常水平，提高了凝血因子的活力及回收率，是血浆干粉在临床有效使用的一种非常实用的重建缓冲液。