一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用 (Method for improving CRISPR/Cas 9-mediated biallelic gene mutation efficiency and application thereof ) 是由 连正兴 李岩 邓守龙 刘国世 连玲 于 2019-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因工程和分子遗传育种技术领域,具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用。本发明提供的CRISPR/Cas9基因编辑方法包括向原核期胚胎中导入基因编辑核酸的步骤,所述基因编辑核酸包括Cas9 mRNA和sgRNA；所述基因编辑核酸中,所述Cas9 mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：20。本发明提供的基因编辑方法,显著提高了双等位基因突变的效率,进而有效降低了基因编辑嵌合个体的比例,提高了双等位基因突变个体的比例,对于目标性状动物的构建和遗传育种具有重要的应用价值。(The invention relates to the technical field of genetic engineering and molecular genetic breeding, in particular to a method for improving CRISPR/Cas 9-mediated biallelic gene mutation efficiency and application thereof. The CRISPR/Cas9 gene editing method provided by the invention comprises the steps of introducing gene editing nucleic acid into a prokaryotic embryo, wherein the gene editing nucleic acid comprises Cas9mRNA and sgRNA; in the gene editing nucleic acid, the molar concentration ratio of the Cas9mRNA to the sgRNA is 1: 10-1: 20. the gene editing method provided by the invention obviously improves the efficiency of biallelic gene mutation, further effectively reduces the proportion of gene editing chimeric individuals, improves the proportion of biallelic gene mutant individuals, and has important application value for construction and genetic breeding of target character animals.)
技术领域
本发明涉及基因工程和分子遗传育种技术领域，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9技术是一种RNA介导的基因组编辑技术，能对基因进行精确性敲除、敲入和替换等，从而实现研究基因功能、移除或者修复靶向基因的目的。
CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成：sgRNA和Cas9蛋白。sgRNA由CRISPR RNA(crRNA)与反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)组成，crRNA包括能够与tracrRNA配对，形成双链RNA结构的序列，还包括能够与靶基因目标区域互补的序列，并以此识别靶序列。在实际应用时，多将crRNA和tracr RNA嵌合成单链向导RNA(single guideRNA,sgRNA)。CRISPR/Cas9基因编辑系统在进行基因编辑时，Cas9蛋白先与sgRNA形成复合体，该复合体识别目标基因的PAM序列(NGG序列)，Cas9蛋白与PAM序列旁的+1位核苷酸发生相互作用，促使双链DNA解旋，实现Cas9 蛋白对目标区域的切割。基因组双链DNA断裂处的修复方式主要有非同源末端连接和同源介导的双链DNA修复。非同源末端连接是一种错误率极高的修复方式，读框移码的***或删除，导致基因功能丧失。同源介导的双链DNA修复虽然所占比例不足10％，但能在目标位点精确地***期望序列，可用于精确定点编辑或者基因敲入。
CRISPR/Cas9系统在进行动物的基因编辑时，通常采用直接将翻译产生Cas9蛋白的Cas9 mRNA与sgRNA通过显微注射的方式导入原核胚中，但获得动物突变体会存在马赛克现象。所谓“马赛克现象”是指将CRISPR/Cas9系统应用于多细胞生物的受精卵基因编辑时，由于受精卵会***成不同的卵裂球，而Cas9蛋白对不同卵裂球的编辑能力和修复方式可能不同，从而导致同时带有编辑细胞与未编辑细胞的嵌合个体的出现，进而影响了动物基因编辑效率和目标性状动物的获得。因此，亟需开发提高双等位基因突变个体的比例，降低嵌合个体所占比例的CRISPR/Cas9基因编辑方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高 CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用。
在利用CRISPR/Cas9系统进行多细胞生物的受精卵或胚胎细胞的基因编辑时，由于细胞***过程中，Cas9系统对于不同细胞的编辑效率和修复方式可能不同，导致等位基因的突变效率差异，最终导致同时带有基因编辑细胞和未编辑细胞的嵌合个体的出现，影响了多细胞生物的基因编辑效率和双等位基因突变的目标性状个体的获得。发明人在研究过程中发现，通过提高常规使用的sgRNA和Cas9 mRNA 导入细胞的摩尔浓度比例，可以显著提高双等位基因编辑的效率。
首先，本发明提供一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法，所述方法包括向原核期胚胎中导入基因编辑核酸的步骤，所述基因编辑核酸包括Cas9 mRNA和sgRNA；所述基因编辑核酸中，所述Cas9 mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：20。
为得到更优的双等位基因突变效率，所述基因编辑核酸中，所述 Cas9 mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：15。
为得到更优的双等位基因突变效率，同时尽量减少导入核酸对细胞的影响，本发明中，所述导入细胞的Cas9 mRNA的摩尔浓度为 5～8nmol/L。所述sgRNA的摩尔浓度为50～120nmol/L。
本发明中，所述导入Cas9 mRNA和sgRNA为同时导入。
本发明中，所述导入为采用显微注射的方式导入。
所述包含Cas9 mRNA和sgRNA的基因编辑核酸的体积可以在本领域允许的注射体积范围内选择。
作为本发明的一种实施方式，采用显微注射的方式同时导入Cas9 mRNA和sgRNA，所述Cas9 mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1： 15，所述导入基因编辑核酸中Cas9mRNA的浓度为5～8nmol/L； sgRNA的浓度为50～120nmol/L，导入基因编辑核酸的体积为3-10pL。
采用本发明所述的Cas9 mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例进行基因编辑核酸的导入，对原核期胚胎进行以非同源末端连接方式实现的基因编辑，双等位基因的突变效率均得到显著提高。
具体地，本发明所述的基因编辑方法包括如下步骤：
(1)基因编辑核酸的合成；
(2)将基因编辑核酸导入原核期胚胎；
(3)基因编辑阳性个体的鉴定。
本发明中，所述原核期胚胎为非人类哺乳动物原核期胚胎。
作为本发明的一种实施方式，当所述原核期胚胎来源于绵羊时，所述基因编辑方法包括如下步骤：
(1)基因编辑核酸Cas9 mRNA和sgRNA的体外转录合成；
(2)供体绵羊超数***后进行体外输精，获取原核期胚胎；
(3)将Cas9 mRNA和sgRNA通过显微注射导入原核期胚胎；
(4)将注射Cas9 mRNA和sgRNA的胚胎移植至受体绵羊中；
(5)对受体绵羊产出的羔羊个体进行基因编辑阳性个体的鉴定。
CRISPR/Cas9基因编辑方法在哺乳动物胚胎中的原理和作用过程十分相似，因此，本发明提供的CRISPR/Cas9基因编辑方法适用于所有非人类哺乳动物的原核期胚胎，例如：鼠、猪、牛、羊、或猴等。
进一步地，本发明还提供所述基因编辑方法在如下任意一方面的应用：
(1)在制备基因编辑动物中的应用；
(2)在动物遗传育种中的应用；
(3)在提高双等位基因编辑效率中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明在利用CRISPR/Cas9系统进行非人类哺乳动物原核期胚胎的基因编辑时，通过采用特定摩尔浓度比例的Cas9 mRNA和sgRNA导入胚胎，显著提高了双等位基因突变的效率，进而有效降低了基因编辑后代中嵌合个体的比例，提高了双等位基因突变个体的比例；同时，整体的基因编辑效率也有所提高。本发明提供的基因编辑方法对于目标性状动物的制备和遗传育种具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中MSTN基因的两个sgRNA打靶位点(Cr1 和Cr2)的结构示意图，其中，sgRNA序列包括与靶点对应的crRNA 序列以及tracrRNA序列。
图2为本发明实施例1中FGF5基因sgRNA打靶位点的结构示意图，其中方框的位置是sgRNA打靶的位置(Cr3)；方框内的序列为PAM区段，sgRNA包括靶点对应的crRNA序列和tracrRNA序列。
图3为本发明实施例2中Cas9 mRNA及sgRNA的体外转录产物电泳图，其中，A为Cas9加帽(Cas9untailed)及加poly(A)尾巴(Cas9 tailed)转录后的纯化回收条带；B为转录后的sgRNA的纯化回收条带，Cr1、Cr2为针对MSTN基因的两个打靶位点的sgRNA，Cr3为针对FGF5基因打靶位点的sgRNA。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 MSTN和FGF5基因编辑的sgRNA设计
本实施例以绵羊的MSTN和FGF5基因为例，设计CRISPR/Cas9 基因编辑的sgRNA。
为实现较高的基因编辑效率，sgRNA的设计原则如下：与基因组序列互补配对的序列长度为20-30nt，在序列的3’末端必须有PAM (NGG)序列，避免有SNP以及polyT的序列，最好以碱基“G”开始。
针对绵羊的MSTN基因设计了2个打靶位点，均位于MSTN基因第三外显子上。2个靶点在MSTN基因组中的排列及结构如图1所示，命名为Cr1和Cr2，图1显示了基因组中相应的打靶序列，以及该位点的 PAM区段，灰色序列为sgRNA与靶点对应的crRNA序列，其后连接tracrRNA，共同构成MSTN sgRNA，两个打靶位点的sgRNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
针对绵羊的FGF5基因设计了1个打靶位点，在基因组中的排列和结构如图2所示，图2中灰色方框标记为靶点序列(Cr3)，在该基因的正义链上，分布在β折叠中间。图2显示的基因组序列包括了PAM区段， FGF5sgRNA(序列如SEQ ID NO.3所示)包括靶点对应的crRNA序列，以及其后连接的tracrRNA序列。
实施例2 Cas9 mRNA和sgRNA的体外转录
采用Q5高保真DNA聚合酶分别扩增含有T7启动子的Cas9(Cas9 基因序列如SEQ IDNO.4所示)及sgRNA序列，纯化后得到体外转录的模板。T7-Cas9用mMESSAGE mMachineT7Ultra Kit试剂盒转录， T7-sgRNA用MEGAshortscript Kit试剂盒转录。转录后的Cas9RNA用 RNA专用loading处理后成为单链直线，2％琼脂糖-TBE凝胶电泳后显示Cas9加帽转录后约为4200nt，转录后的Cas9 mRNA条带清晰，大小正确(如图3的A所示)。转录后的sgRNA(约为100nt)纯化回收用琼脂糖凝胶电泳检测，sgRNA条带清晰，大小正确(如图3的B所示)。
实施例3 利用CRISPR/Cas9系统对绵羊的MSTN和FGF5基因进行编辑
本实施例采用原核显微注射法将实施例2体外转录合成的Cas9 mRNA及MSTN和FGF5基因的sgRNA导入绵羊原核胚中，实现 MSTN和FGF5的基因敲除。
将实施例2体外转录合成的Cas9 mRNA和sgRNA混合制备为显微注射用基因编辑核酸溶液。根据Cas9 mRNA及sgRNA注射比例的不同将绵羊原核期胚胎分成三组：(1)对照组：Cas9 mRNA和sgRNA 摩尔浓度比为1:2，共进行两次显微注射，第一次显微注射的Cas9 mRNA和sgRNA的浓度分别为5.23*10-9mol/l及10.46*10-9mol/l，第二次显微注射的Cas9 mRNA和sgRNA的浓度分别为7.93*10-9mol/l 及15.86*10-9mol/l，注射体积约为5pL，共注射了448枚受精卵，移植了93只受体母羊，胚胎移植30天后，经过B超检查，35只受体怀孕，共产活羔28只；(2)实验组1：Cas9 mRNA和sgRNA摩尔浓度比为1:10，共进行两次显微注射，第一次显微注射的Cas9 mRNA 和sgRNA的浓度分别为5.23*10-9mol/l及5.23*10-8mol/l，第二次显微注射的Cas9 mRNA和sgRNA的浓度分别为7.93*10-9mol/l及 7.93*10-8mol/l，注射体积约为5pL，共注射了365枚受精卵，移植了 84只受体母羊，胚胎移植30天后，经过B超检查，26只受体怀孕，共产活羔22只；(3)实验组2：Cas9 mRNA和sgRNA摩尔浓度比 1:15，其中，Cas9 mRNA和sgRNA的浓度分别为5.23*10-9mol/l及 7.85*10-8mol/l，注射体积约为5pL，共注射了388枚受精卵，移植了 59只受体母羊，胚胎移植30天后，经过B超检查，17只受体怀孕，共产活羔14只。
取羔羊血液提取基因组DNA并分别进行MSTN和FGF5基因的PCR扩增，将PCR产物送至公司测序。基因突变检测结果如表1所示，对照组(Cas9 mRNA和sgRNA摩尔浓度比为1:2)共有4只羔羊产生了突变，基因编辑的阳性突变率为14.3％(4/28)，但4只羔羊均为单等位基因突变(即目的基因编辑后同时存在突变型和野生型序列)，双等位基因突变率为0％；实验组1(Cas9 mRNA和sgRNA摩尔浓度比为1:10)共有4只羔羊产生了突变，基因编辑的阳性突变率为18.2％(4/22)，4只羔羊全部为双等位基因突变(即目的基因编辑后同源染色体上的等位基因均发生突变)，双等位基因突变率为100％；实验组2(Cas9 mRNA和sgRNA摩尔浓度比为1:15)有1只羔羊产生了突变，且为双等位基因突变，基因编辑的阳性突变率为7.1％(1/14)，双等位基因突变率为100％。
表1绵羊MSTN和FGF5的基因编辑效率
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用
<130> KHP181117407.0
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatataaggc caattactgc tc 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatctttg taggagtaca gcaa 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggttcccct ttccgcacct 20
<210> 4
<211> 4227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccaccatgg actataagga ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa 60
gacgatgacg ataagatggc cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca 120
gcagccgaca agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc 180
gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg caacaccgac 240
cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc 300
gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc 360
tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac 420
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ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga 540
aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc 600
cacatgatca agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc 660
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agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg cctgttcgga 840
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gccggctaca ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat caagcccatc 1260
ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg 1320
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atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac 1500
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ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg 1800
accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa 1860
atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa 1920
attatcaagg acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc 1980
gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat 2040
gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata caccggctgg 2100
ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg caagacaatc 2160
ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct gatccacgac 2220
gacagcctga cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc 2280
ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag 2340
acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc 2400
gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag 2460
agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct gaaagaacac 2520
cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg 2580
cgggatatgt acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac 2640
catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga 2700
agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg 2760
aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat 2820
ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt catcaagaga 2880
cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg 2940
aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag 3000
tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac 3060
aactaccacc acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa 3120
aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg 3180
aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac 3240
agcaacatca tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag 3300
cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat 3360
tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag 3420
gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg 3480
atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg 3540
gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt 3600
gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc 3660
gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct 3720
aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa 3780
ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc 3840
agccactatg agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg 3900
gaacagcaca agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga 3960
gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat 4020
aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga 4080
gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc 4140
aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg 4200
atcgacctgt ctcagctggg aggcgac 4227