阅读说明：本技术 一种具有降血糖作用的黄大茶多糖 (A radix et rhizoma Rhei tea polysaccharide with blood sugar lowering effect ) 是由 陈彦 王志 姚程颖 潘文娟 于 2020-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有降血糖作用的黄大茶多糖制备方法,其特征在于：黄大茶多糖LYT-2是以霍山产的黄大茶为原料,经过EM菌固态发酵,利用深度共熔溶剂技术提取制备；该多糖化合物分子量为4.38×10<Sup>4</Sup> Da,含有4.98%结合蛋白,单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:阿拉伯糖=2.16:4.83:1。体内实验数据显示LYT-2能明显降低高糖高脂小鼠的体重和血糖水平。结果表明LYT-2在食品、医药保健等方面具有良好的应用前景。(The invention discloses a preparation method of a large yellow tea polysaccharide with a hypoglycemic effect, which is characterized by comprising the following steps: the yellow tea polysaccharide LYT-2 is prepared by taking yellow tea produced in Hovenia huoshanensis as a raw material, performing solid state fermentation by EM (effective microorganisms), and extracting by using a deep eutectic solvent technology; the polysaccharide compound has a molecular weight of 4.38 × 10 4 Da, containing 4.98% binding proteins, and monosaccharide composition in molar ratio mannose to glucose to arabinose =2.16:4.83: 1. The in vivo experimental data show that LYT-2 can significantly reduce the body weight and blood sugar level of high-sugar and high-fat mice. The results show that the LYT-2 has good application prospect in the aspects of food, medicine, health care and the like.)

一种具有降血糖作用的黄大茶多糖

技术领域

本发明涉及一种茶叶深加工产品，特别涉及以益生菌发酵黄大茶为原料得到具有降血糖作用的活性多糖组分，属于食品、保健等相关领域。

背景技术

糖尿病作为一种“富贵病”，是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。目前尚无根治糖尿病的方法，现阶段对糖尿病的治疗往往依赖药物来控制，然而药物的使用往往对心、肝、脾、胃、肾造成较大伤害。天然活性物质包括多糖、蛋白质、甾醇类等，具有多种生物活性，副作用较低并被广泛应用于保健、疾病治疗领域，具有广泛的应用前景。

黄大茶，属黄茶，亦称为皖西黄大茶，产于安徽省霍山、金寨、岳西等地，其茶汤除了有独特茶香，还有多种保健功能，但其活性功效的物质基础尚不明确。多糖作为黄大茶的主要功能成分之一，其结构和功能在益生菌的作用下会发生变化。EM菌是由光合细菌、乳酸菌、酵母菌和放线菌为主的10个属80余种微生物复合而成的一种微生物活菌制剂，它可以通过生物转化作用改变目标产物的物质组成，达到更强的药理效果。

热水浸提法是多糖的传统提取方法，它具有提取率低、温度高导致活性物质易破坏、杂质多等缺点。深度共熔溶剂（Deep eutectic solvents, DESs）是由氢键受体和氢键供体化合物按一定的比例通过机械搅拌或加热混合而成，可以定向促进多糖成分释放溶解，相较于传统提取方法，DESs具有提取温度低，时间短，杂质少等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有降血糖作用的黄大茶多糖，该多糖有显著的体内降血糖功能，在医疗保健等领域具有巨大的应用潜力；本发明首次将益生菌和黄大茶联合发酵获得一种新型结构多糖，然后用深度共熔溶剂提取技术对多糖进行提取制备，是一种简单、温和、产率高的制备方法。

本发明为实现发明目的，采用如下技术方案：

一种具有降血糖作用的黄大茶多糖：所述多糖为来源于黄大茶的多糖成分LYT-2，其分子量为4.38×10⁴ Da，含4.98%结合蛋白，单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:***糖=2.16:4.83:1。

上述一种具有降血糖作用的黄大茶多糖制备方法：

A.固体发酵将市场购得的霍山黄大茶粉碎至60~80目，按茶粉质量的1%加入EM菌粉，喷洒0.5~1倍质量的蒸馏水，搅拌均匀，装入厌氧发酵袋中密封，温度维持在20~27℃，发酵时间7~9天；

B.提取纯化采用深度共熔溶剂提取法提取发酵黄大茶多糖，提取溶剂为食品级氯化胆碱和甘油，两者质量比为1:2，料液比为1:20~50，提取时间为120~1200min，提取温度为50~60℃，提取液经过离心、浓缩、醇沉、透析、层析、冷冻干燥等步骤得到述黄大茶多糖LYT-2，即为具有降血糖作用的多糖。

本发明中EM菌粉为市售常规规格。

本发明的有益效果体现在：

本发明以黄大茶为基础原料，通过益生菌发酵联合深度共熔溶剂提取法提高多糖得率及生物活性，产品得率可以达到6%以上。本发明首次将益生菌和黄大茶联合发酵产生一种新多糖，然后用深度共熔溶剂提取技术对多糖进行提取制备，是一种简单、温和、产率高的制备方法。

体内降糖实验显示本发明所得LYT-2能显著降低STZ诱导的糖尿病模型小鼠体内血糖含量及小鼠体重，在400mg/kg灌胃下实验组小鼠比模型组血糖值降低34.33%。LYT-2降血糖功效显著，其市场应用前景十分广阔。

附图说明

图1为本发明实施例5中一种具有降血糖作用的黄大茶多糖组分和相对分子质量检测结果，色谱条件为安捷伦1260 HPLC-ELSD，TSKgel G5000PWxL (7.8 mm × 300 mm)；

图2为本发明实施例5中一种具有降血糖作用的黄大茶多糖单糖组成检测结果，色谱条件为安捷伦 1260 HPLC，Eclipse XDB-C₁₈(2.1mm ×150mm)；

图3为本发明实施例5中一种具有降血糖作用的黄大茶多糖能降低STZ诱导的高糖高脂模型小鼠体重的测量结果，实验表明在400mg/kg灌胃剂量下能明显缓解STZ诱导的高糖高脂模型小鼠体重的下降；

图4为本发明实施例5中一种具有降血糖作用的黄大茶多糖STZ诱导的高糖高脂模型小鼠血糖的测定结果，实验结果表明黄大茶多糖LYT-2能显著降低糖尿病模型小鼠体内血糖含量。

具体实施方式

实施例1

一种具有降血糖作用的黄大茶多糖制备方法为：

（1）粉碎，取1kg黄大茶倒入粉碎机中在3500r/min粉碎，为防止高温使其化学物质发生变化，间歇性重复3次以上操作，将粉碎后的粉末过80目筛；

（2）发酵，将EM菌粉按照1%加入茶粉中搅拌均匀，喷洒1倍质量的蒸馏水搅拌，装入厌氧发酵袋中温度维持在25℃发酵9天；

（3）提取，采用深度共熔溶剂提取法提取黄大茶多糖，提取溶剂为食品级氯化胆碱和甘油，两者质量比为1:2，液料比为1:50提取时间为1200min，提取温度为60℃，采用离心收集上清液；

（4）浓缩，步骤（3）收集的上清液利用旋转蒸发仪在80r/min，65℃，压强<0.08MPa条件下浓缩；

（5）醇沉，在步骤（4）的浓缩液中按照体积比1:4加入4倍冷的无水乙醇，静置过夜离心收集沉淀，在沉淀中加入适量的蒸馏水使沉淀充分溶解，将得到的溶液倒入旋转蒸发仪中，在80r/min，40℃，压强<0.08MPa条件下浓缩将溶液中的无水乙醇蒸发出；

（6）冻干，将步骤（5）中得到的浓缩液利用冷冻干燥技术冻干，得到益生菌发酵黄大茶多糖干粉；

（7）透析，称量黄大茶多糖干粉5g加入50ml的蒸馏水充分溶解后装入透析袋中，双蒸水透析三天后收集透析液浓缩冻干；

（8）分离纯化，将发酵黄大茶粗多糖配制成200μg/ml溶液，取1ml过DEAE-32阴离子交换柱，依次用双蒸水、0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl，流速为1ml/min梯度洗脱，透析冻干。称量水洗组分100mg配制成0.5ml溶液，Superdex-75 (5ml/管，流速为1ml/min)分离纯化。采用双蒸水洗脱，收集洗脱液安捷伦HPLC-ELSD检测洗脱液组分；

实施例2

一种具有降血糖作用的黄大茶多糖制备方法为：

（1）粉碎，取1.5kg黄大茶倒入粉碎机中在3500r/min粉碎，为防止高温使其化学物质发生变化间歇性重复3次以上操作，将粉碎后的粉末过60目筛；

（2）发酵，将EM菌粉按照1%加入茶粉中搅拌均匀，喷洒0.5倍质量的蒸馏水搅拌，装入厌氧发酵袋中温度维持在20℃发酵7天；

（3）提取，采用深度共熔溶剂提取法提取黄大茶多糖，提取溶剂为食品级氯化胆碱和甘油，两者质量比为1:2，液料比为1:20提取时间为150min，提取温度为50℃，采用离心收集上清液；

（4）浓缩，步骤（3）收集的上清液利用旋转蒸发仪在100r/min，60℃，压强<0.08MPa条件下浓缩；

（5）醇沉，在步骤（4）的浓缩液中按照体积比1:4加入4倍冷的无水乙醇，静置过夜离心收集沉淀，在沉淀中加入适量的蒸馏水使沉淀充分溶解，将得到的溶液倒入旋转蒸发仪中，在100r/min，45℃，压强<0.08MPa条件下浓缩将溶液中的无水乙醇蒸发出；

（6）冻干，将步骤（5）中得到的浓缩液利用冷冻干燥技术冻干，得到益生菌发酵黄大茶多糖干粉；

（7）透析，称量黄大茶多糖干粉5g加入60ml的蒸馏水充分溶解后装入透析袋中，双蒸水透析三天后收集透析液浓缩冻干；

（8）分离纯化，将发酵黄大茶粗多糖配制成200μg/ml溶液，取1ml过DEAE-32阴离子交换柱，依次用双蒸水、0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl，流速为1ml/min梯度洗脱，透析冻干。称量水洗组分100mg配制成0.5ml溶液，Superdex-75 (5ml/管，流速为1ml/min)分离纯化。采用双蒸水洗脱，收集洗脱液安捷伦HPLC-ELSD检测洗脱液组分；

实施例3

一种具有降血糖作用的黄大茶多糖制备方法为：

（1）粉碎，取0.5kg黄大茶倒入粉碎机中在3500r/min粉碎，为防止高温使其化学物质发生变化间歇性重复3次以上操作，将粉碎后的粉末过60目筛；

（2）发酵，将EM菌粉按照1%加入茶粉中搅拌均匀，喷洒0.5倍质量的蒸馏水搅拌，装入厌氧发酵袋中温度维持在23℃发酵8天；

（3）提取，采用深度共熔溶剂提取法提取黄大茶多糖，提取溶剂为食品级氯化胆碱和甘油，两者质量比为1:2，液料比为1:30提取时间为180min，提取温度为55℃，采用离心收集上清液；

（4）浓缩，步骤（3）收集的上清液利用旋转蒸发仪在85r/min，62℃，压强<0.08MPa条件下浓缩；

（5）醇沉，在步骤（4）的浓缩液中按照体积比1:4加入4倍冷的无水乙醇，静置过夜离心收集沉淀，在沉淀中加入适量的蒸馏水使沉淀充分溶解，将得到的溶液倒入旋转蒸发仪中，在95r/min，42℃，压强<0.08MPa条件下浓缩将溶液中的无水乙醇蒸发出；

（6）冻干，将步骤（5）中得到的浓缩液利用冷冻干燥技术冻干，得到益生菌发酵黄大茶多糖干粉；

（7）透析，称量黄大茶多糖干粉4g加入50ml的蒸馏水充分溶解后装入透析袋中，双蒸水透析三天后收集透析液浓缩冻干；

（8）分离纯化，将发酵黄大茶粗多糖配制成200μg/ml溶液，取1ml过DEAE-32阴离子交换柱，依次用双蒸水、0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl，流速为1ml/min梯度洗脱，透析冻干。称量水洗组分100mg配制成0.5ml溶液，Superdex-75 (5ml/管，流速为1ml/min)分离纯化。采用双蒸水洗脱，收集洗脱液安捷伦HPLC-ELSD检测洗脱液组分；

实施例4

一种具有降血糖作用的黄大茶多糖制备方法为：

（1）粉碎，取0.8kg黄大茶倒入粉碎机中在3500r/min粉碎，为防止高温使其化学物质发生变化间歇性重复3次以上操作，将粉碎后的粉末过80目筛；

（2）发酵，将EM菌粉按照1%加入茶粉中搅拌均匀，喷洒0.6倍质量的蒸馏水搅拌，装入厌氧发酵袋中温度维持在22℃发酵8天；

（3）提取，采用深度共熔溶剂提取法提取黄大茶多糖，提取溶剂为食品级氯化胆碱和甘油，两者质量比为1:2，液料比为1:40提取时间为240min，提取温度为56℃，采用离心收集上清液；

（4）浓缩，步骤（3）收集的上清液利用旋转蒸发仪在70r/min，62℃，压强<0.08MPa条件下浓缩；

（5）醇沉，在步骤（4）的浓缩液中按照体积比1:4加入4倍冷的无水乙醇，静置过夜离心收集沉淀，在沉淀中加入适量的蒸馏水使沉淀充分溶解，将得到的溶液倒入旋转蒸发仪中，在100r/min，46℃，压强<0.08MPa条件下浓缩将溶液中的无水乙醇蒸发出；

（6）冻干，将步骤（5）中得到的浓缩液利用冷冻干燥技术冻干，得到益生菌发酵黄大茶多糖干粉；

（7）透析，称量黄大茶多糖干粉6g加入55ml的蒸馏水充分溶解后装入透析袋中，双蒸水透析三天后收集透析液浓缩冻干；

（8）分离纯化，将发酵黄大茶粗多糖配制成200μg/ml溶液，取1ml过DEAE-32阴离子交换柱，依次用双蒸水、0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl，流速为1ml/min梯度洗脱，透析冻干。称量水洗组分100mg配制成0.5ml溶液，Superdex-75 (5ml/管，流速为1ml/min)分离纯化。采用双蒸水洗脱，收集洗脱液安捷伦HPLC-ELSD检测洗脱液组分；

实施例5

一种具有降血糖作用的黄大茶多糖制备方法为：

（1）粉碎，取1.2kg黄大茶倒入粉碎机中在3500r/min粉碎，为防止高温使其化学物质发生变化间歇性重复3次以上操作，将粉碎后的粉末过60目筛；

（2）发酵，将EM菌粉按照1%加入茶粉中搅拌均匀，喷洒0.8倍质量的蒸馏水搅拌，装入厌氧发酵袋中温度维持在25℃发酵7天；

（3）提取，采用深度共熔溶剂提取法提取黄大茶多糖，提取溶剂为食品级氯化胆碱和甘油，两者质量比为1:2，液料比为1:25提取时间为200min，提取温度为50℃，采用离心收集上清液；

（4）浓缩，步骤（3）收集的上清液利用旋转蒸发仪在75r/min，60℃，压强<0.08MPa条件下浓缩；

（5）醇沉，在步骤（4）的浓缩液中按照体积比1:4加入4倍冷的无水乙醇，静置过夜离心收集沉淀，在沉淀中加入适量的蒸馏水使沉淀充分溶解，将得到的溶液倒入旋转蒸发仪中，在75r/min，45℃，压强<0.08MPa条件下浓缩将溶液中的无水乙醇蒸发出；

（6）冻干，将步骤（5）中得到的浓缩液利用冷冻干燥技术冻干，得到益生菌发酵黄大茶多糖干粉；

（7）透析，称量黄大茶多糖干粉4.5g加入60ml的蒸馏水充分溶解后装入透析袋中，双蒸水透析三天后收集透析液浓缩冻干；

（8）分离纯化，将发酵黄大茶粗多糖配制成200μg/ml溶液，取1ml过DEAE-32阴离子交换柱，依次用双蒸水、0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl，流速为1ml/min梯度洗脱，透析冻干。称量水洗组分100mg配制成0.5ml溶液，Superdex-75 (5ml/管，流速为1ml/min)分离纯化。采用双蒸水洗脱，收集洗脱液安捷伦HPLC-ELSD检测洗脱液组分；

实施例1所得一种具有降血糖作用的黄大茶多糖降低STZ诱导的高糖高脂模型小鼠血糖；

将60只体重为20±2g的昆明小鼠适应一周后除正常组外其它五组均喂以高糖高脂饲料，并注射120mg/kg STZ建立糖尿病模型3d后禁食测定血糖浓度，当血糖浓度高于16.7mmol/L代表建模成功。建模成功后将小鼠平随机为正常组、模型组、二甲双胍（200mg/kg）组，黄大茶多糖低（100mg/kg）、中（200mg/kg）、高剂量（400mg/kg）组每组8只。连续灌胃给药30天，正常组和模型组给予等量的生理盐水，所有组都给与足量的饮食和蒸馏水。每天观察各组动物摄食、饮水、尿量、毛色、精神状态、活动等情况并做记录，每周称量记录小鼠体重及测量空腹血糖含量。