阅读说明：本技术 一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白及其制备方法 (Goose parvovirus protein capable of inducing goose embryo fibroblast apoptosis and preparation method thereof ) 是由 董浩 胡桂学 王开 鄢雨晴 张双 刘军亭 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白,该蛋白为非结构蛋白,且该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,具有诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的功能。本发明的有益之处在于：本发明提供的一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白为探索GPV感染对GEF细胞的致病机制提供理论依据,同时也为GPV的防治提供了新思路；为深入探讨抗病毒药物及疫苗开发提供了方向。(The invention provides a goose parvovirus protein capable of inducing goose embryo fibroblast apoptosis, which is a non-structural protein, has an amino acid sequence shown as SEQ ID No.1 and has a function of inducing goose embryo fibroblast apoptosis. The invention has the advantages that: the goose parvovirus protein capable of inducing goose embryo fibroblast apoptosis provided by the invention provides a theoretical basis for exploring a pathogenic mechanism of GPV infection on GEF cells, and also provides a new idea for preventing and treating GPV; provides a direction for further discussing the development of antiviral drugs and vaccines.)

一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白及其制 备方法

技术领域

本发明属于预防兽医学技术领域，涉及一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的蛋白，具体涉及一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白及其制备方法。

背景技术

鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)可以导致一种严重的疾病，称为Derzsy病，这种疾病会影响幼鹅和番鸭。在小于1周龄的易感禽类中，死亡率可能达到100％。在1-3周龄的易感禽类中，也会产生很高的死亡率(10-60％)。

病毒复制不仅需要后代的不断增值和传播，还需要通过杀死受体细胞来限制宿主细胞的复制。除了诱导免疫和炎症反应外，大多数病毒的感染还会引发感染细胞的凋亡或其它形式的死亡，这种细胞反应通常是病毒复制作用的强制性或不可避免的副产物。此外，一些病毒通过细胞凋亡作为细胞杀伤和病毒传播的主要途径。细胞凋亡或程序性细胞死亡是一种进化上保守的过程，对于去除受损、感染或过量的细胞至关重要，是正常发育、组织稳态和抵抗感染所必需的。细胞凋亡是由于促凋亡活性非结构蛋白与特异性宿主细胞内的相关蛋白发生互作，形成蛋白复合物，破坏宿主细胞内的微环境，进而触发信号级联，激活不同信号通路，最终激活诱导宿主细胞凋亡。因此，研究病毒感染与细胞凋亡的关系，有助于了解病毒的发生、发展和传播，为病毒的控制提供新思路。

大量研究证实，病毒感染可以引起细胞凋亡。病毒感染是细胞发生凋亡并引发疾病的主要原因。而目前关于GPV的研究，集中于疾病的诊断与防治上，关于GPV的致病机理目前尚未有文献阐明，亦没有关于GPV诱导细胞凋亡的相关报道。但是要想从根本上防治Derzsy病，就需要探索GPV感染对鹅胚成纤维细胞细胞(GEF)的致病机制。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白，该蛋白的发现为进一步探索GPV感染对鹅胚成纤维细胞细胞的致病机制提供了理论依据，同时也为GPV的防治提供了的新思路。

一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白，其特征在于，所述蛋白为非结构蛋白，且所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白，可以通过以下步骤制备得到：

(1)PCR方法扩增目的基因片段：

(1.1)NS1引物设计

基于GPV的NS1基因设计具有切割位点Bam HⅠ、XhoⅠ和保护性碱基的正向和反向引物，序列见下表；

表1引物序列

(1.2)PCR扩增

按照[email protected] DNA Kit(OMEGA)提取GPV的基因组，并以所述基因组DNA为模板，进行NS1片段扩增，反应结束后，进行核酸电泳验证；

表2PCR反应体系(20μL)

表3PCR反应程序设置

(2)构建真核表达载体：

(2.1)NS1片段与pCDNA3.0空载体双酶切

将步骤(1)获得的PCR产物回收后，同pCDNA3.0空载体分别进行双酶切，酶切体系下表，酶切结束后，分别对酶切产物进行纯化；

表4双酶切反应体系(20μL)

(2.2)连接与转化

将酶切产物引入pCDNA-3.0(+)载体中，并将重组载体转化到大肠杆菌DH5α细胞中，得到重组质粒pCDNA-NS1，并使用无内毒素质粒DNA Mini试剂盒纯化，通过DNA测序确认质粒；

表5连接体系(10μL)

(2.3)重组质粒双酶切鉴定

将所述重组质粒用Bam HⅠ和XhoⅠ两种酶进行双酶切，酶切反应同表4，然后通过凝胶电泳进行验证；

(3)蛋白表达：

(3.1)重组质粒pCDNA3.0-NS1转染GEF细胞：提取无内毒素pCDNA3.0-NS1重组质粒，然后使用TurboFect转染试剂进行转染；转染前将GEF细胞用opti处理2h，然后将pCDNA-NS1和pCDNA对照质粒转染到GEF细胞中，并在转染后指定的时间收集细胞样品；

(3.2)蛋白提取：通过博奥森细胞总蛋白提取试剂盒，对细胞内的总蛋白进行提取；

(3.3)蛋白表达鉴定：通过western blot方法，利用flag小鼠单克隆抗体和羊抗鼠二抗进行NS1蛋白的表达情况鉴定；

(4)蛋白活性检测：利用流式细胞术、TUNEL技术、JC-1线粒体膜电位的检测，Western blot实验，在NS1蛋白表达的不同时间对鹅胚成纤维细胞的影响，确认NS1蛋白可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡。

本发明的有益之处在于：

①本发明提供的一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白具有诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的功能。

②本发明提供的一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白的研究为探索GPV感染对GEF细胞的致病机制提供理论依据，同时也为GPV的防治提供了新思路。

③本发明提供的一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白为深入探讨抗病毒药物及疫苗开发提供了方向。

附图说明

图1为本发明实施例1中的目的基因NS1的PCR产物电泳图；图中M代表2000kb DNAMarker，1代表阴性对照，2代表PCR产物；

图2为本发明中实施例1中的pCDNA3.0-NS1重组质粒双酶切片段电泳图；图中M代表15000DNA Marker，1代表重组质粒双酶切片段，2代表BamHⅠ单酶切片段，3代表XhoⅠ单酶切片段，4代表重组质粒酶切前片段；

图3为本发明中实施例1中的q-PCR检测GPV在GEF细胞内的复制能力过程中涉及到的GPV拷贝数标准曲线；

图4为本发明中实施例1中的q-PCR检测GPV在GEF细胞内的复制能力过程中涉及到的GPV在GEF细胞内的复制能力示意图；

图5为本发明中实施例1中重组质粒pCDNA3.0-NS1转染至GEF细胞中的westernblot检测结果示意图；

图6为本发明中实施例1中的流式细胞术检测细胞凋亡情况示意图；图中A代表GPV感染GEF细胞后细胞凋亡率变化的流式细胞仪检测结果，B代表利用GraphPad Prism 6.01软件对三次GPV感染GEF细胞重复试验的流式细胞仪检测数据平均值统计分析的结果，C代表NS1蛋白转染GEF细胞后细胞凋亡率变化的流式细胞仪检测结果，D代表利用GraphPadPrism 6.01软件对三次NS1蛋白转染GEF细胞重复试验的流式细胞仪检测数据平均值统计分析的结果，*代表P<0.05；

图7为本发明中实施例1中的UNEL法检测GEF细胞凋亡情况示意图；图中A代表TUNEL法检测GPV感染GEF细胞后细胞凋亡情况在倒置荧光显微镜下的检测结果，B代表GraphPad Prism 6.01软件对三次GPV感染GEF细胞平行试验的TUNEL检测数据平均值的统计分析结果，C代表TUNEL法检测NS1蛋白转染GEF细胞后细胞凋亡情况在倒置荧光显微镜下的检测结果，D代表GraphPad Prism 6.01软件对三次NS1蛋白转染GEF细胞平行试验的TUNEL检测数据平均值的统计分析结果，*代表P<0.05；

图8为本发明中实施例1中的q-PCR检测凋亡因子mRNA水平变化情况示意图，图中*代表P<0.05；

图9为本发明中实施例1中的GPV感染GEF细胞及NS1蛋白表达后，细胞线粒体膜电位变化情况在倒置荧光显微镜下的检测结果；其中红色荧光为JC-1单体，在荧光显微镜下呈红色荧光，绿色荧光为JC-1复合物，在荧光显微镜下呈绿色荧光；

图10为本发明中实施例1中的Western blot检测AIF蛋白表达情况示意图；其中A代表Western blot检测GPV感染后GEF细胞核内AIF的表达，B代表Western blot检测重组质粒pCDNA3.0-NS1转染后GEF细胞核内AIF的表达，C代表Western blot检测重组质粒pCDNA3.0-NS1的表达，D代表GraphPad Prism6.01软件对GPV组western blot三次平行试验平均值的数据统计分析结果，E代表GraphPad Prism 6.01软件对NS1组western blot三次平行试验平均值的数据统计分析结果，**代表P<0.01；

图11为本发明中实施例1中的流式细胞术检测GPV作用下GEF细胞内ROS变化情况示意图；其中A.代表流式细胞术分析GPV感染GEF细胞后的ROS变化在流式细胞仪下的检测结果，B代表利用GraphPad Prism 6.01软件对流式细胞术三次重复试验平均值的数据统计分析结果，**代表P<0.01，***代表P<0.001；

图12为本发明中实施例1中的采用ELISA检测GEF组织蛋白酶D活性变化的过程中涉及到的鹅组织蛋白酶D酶联免疫反应标准曲线；

图13为本发明中实施例1中的采用ELISA检测GEF组织蛋白酶D活性变化的过程利用GraphPad Prism 6.01软件对GPV组鹅组织蛋白酶D的三次平行试验平均值的数据统计分析结果，*代表P<0.05。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-13，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白，其特征在于，所述蛋白为非结构蛋白，且所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白，可以通过以下步骤制备得到：

(1)PCR方法扩增目的基因片段：

(1.1)NS1引物设计

基于GPV的NS1基因设计具有切割位点Bam HⅠ、XhoⅠ和保护性碱基的正向和反向引物，序列见下表；

表1引物序列

(1.2)PCR扩增

按照[email protected] DNA Kit(OMEGA)提取GPV的基因组，并以所述基因组DNA为模板，进行NS1片段扩增，反应结束后，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在1884bp处可见明显目的条带，与预期结果相符(参见图1)；PCR扩增过程所使用的GPV病毒株的TCID50为10^-8/0.1mL。

表2PCR反应体系(20μL)

表3PCR反应程序设置

(2)构建真核表达载体：

(2.1)NS1片段与pCDNA3.0空载体双酶切

将步骤(1)获得的PCR产物回收后，同pCDNA3.0空载体分别进行双酶切，酶切体系下表，酶切结束后，分别对酶切产物进行纯化；

表4双酶切反应体系(20μL)

(2.2)连接与转化

将酶切产物引入pCDNA-3.0(+)载体中，并将重组载体转化到大肠杆菌DH5α细胞中，得到重组质粒pCDNA-NS1，并使用无内毒素质粒DNA Mini试剂盒纯化，通过DNA测序确认质粒；

表5连接体系(10μL)

(2.3)重组质粒双酶切鉴定

将所述重组质粒用Bam HⅠ和XhoⅠ两种酶进行双酶切，酶切反应同表4，然后通过凝胶电泳进行验证，电泳结果表明双酶切结果也与预期条带结果相符，分别在1902bp(带酶切位点)和5400bp处可见预期条带(参见图2)，证明pCDNA3.0-NS1真核表达载体构建成功。

(3)蛋白表达：

(3.1)重组质粒pCDNA3.0-NS1转染GEF细胞：提取无内毒素pCDNA3.0-NS1重组质粒，然后使用TurboFect转染试剂进行转染；转染前将GEF细胞用opti处理2h，然后将pCDNA-NS1和pCDNA对照质粒转染到GEF细胞中，并在转染后指定的时间收集细胞样品；

(3.2)蛋白提取：通过博奥森细胞总蛋白提取试剂盒，对细胞内的总蛋白进行提取；

(3.3)蛋白表达鉴定：通过western blot方法，利用flag小鼠单克隆抗体和羊抗鼠二抗进行NS1蛋白的表达情况鉴定；

(4)蛋白活性检测：利用流式细胞术、TUNEL技术、JC-1线粒体膜电位的检测，Western blot实验，确认寻找到NS1蛋白可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡；具体检测过程及结果如下：

(4.1)q-PCR检测GPV在细胞内的复制能力结果：通过q-PCR构建GPV拷贝数的标准曲线，参见图3，得到线性方程为：y＝2.6506x+3.5269。同时以感染GPV后不同时间细胞内的病毒DNA为模板，进行荧光定量PCR，并将得到的CT值带入标曲中，得到一条病毒复制能力与感染时间的曲线，由结果可知GPV在细胞内的复制能力随感染时间的增加而上升，并且从12小时到48小时检测到病毒水平显着增加，在48h之后，病毒的复制能力开始下降，参见图4。

(4.2)Western blot检测NS1蛋白在GEF细胞内的表达：将pCDNA3.0-NS1真核表达载体转染至GEF细胞中后，于24、36、48及60h收集细胞内蛋白，通过Western blot方法，一抗和二抗的孵育，进行目的条带的检测，可以检测到目的蛋白的表达，具体结果参见图5。

(4.3)流式细胞术检测细胞凋亡：采用Annexin V-FITC/PI法流式细胞术分别检测GPV感染和被NS1蛋白转染的GEF细胞的凋亡情况。如图6中A和B所示，与对照组细胞相比，GPV感染组在细胞中产生的凋亡水平显著升高，凋亡细胞的百分比随感染时间的增加而增加，在48h时最高达到64.9％。同时，如图6中C和D所示，NS1蛋白转染组产生的凋亡水平亦明显高于对照组细胞，凋亡细胞的百分比随感染时间的增加而增加，并在60小时时达到67.4％，说明GPV感染和NS1蛋白的表达都能够诱导GEF细胞凋亡。

(4.4)TUNEL法检测GEF细胞凋亡：为了进一步验证GPV和NS1蛋白分别能够诱导GEF细胞发生凋亡，通过TUNEL法检测GPV感染及NS1蛋白转染GEF细胞后24、36、48及60h的细胞凋亡情况。凋亡细胞将被TUNEL标记并在荧光显微镜下发出红色荧光，如图7所示。从图7中的A和B可以看出，在感染GPV后36小时时，细胞显示出明显的细胞病变反应，GEF细胞出现了典型的GPV病变特征：细胞聚缩，胞间拉网，死亡脱落等。同时与对照组相比，GPV感染组逐渐出现阳性细胞，并且随感染时间的增加而增加，直至60h，细胞出现大量死亡脱落情况。而对照组细胞，几乎无阳性细胞出现。证明：GPV感染能够诱导GEF细胞发生凋亡，并且与病毒复制呈正相关。在NS1蛋白转染组中，在NS1蛋白转染GEF细胞后的24、36、48及60h时，弃去旧培养基，对细胞进行染色处理，其中发生凋亡的细胞，会被TUNEL标记并在荧光显微镜下发出红色荧光。与对照组相比，NS1蛋白转染组，逐渐出现阳性细胞，并且随NS1蛋白表达时间的增加而增加，而对照组细胞，几乎无阳性细胞出现。证明：NS1蛋白能够诱导GEF细胞发生凋亡，如图7中C和D所示。

(4.5)q-PCR检测凋亡因子mRNA水平变化：为了初步确定GPV诱导GEF细胞凋亡的信号通路，首先通过q-PCR的方法检测了几种不同细胞凋亡通路的凋亡代表因子caspse-3、bcl-2、NF-κb及P53在GPV感染后的24、36、48、60h时的mRNA水平的变化。结果表明：与对照组相比，感染后24小时bcl-2mRNA水平明显升高，而caspase-3在60h出现明显的上调趋势，其他因子并未出现明显的规律变化(参见图8)。同时用试剂盒法检测感染后60小时内caspase-3/7蛋白活性的变化，并用Western blot法检测caspase-3蛋白和PARP蛋白的表达，结果皆呈阴性，因此初步判断GPV诱导的GEF细胞凋亡可能启动了非caspase依赖的线粒体信号通路。

(4.6)JC-1试剂盒检测GEF细胞线粒体膜电位：为了初步验证GPV及NS1蛋白对GEF细胞的线粒体的影响，同时寻找GPV对GEF细胞诱导凋亡的信号通路，利用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒，分别判断了GPV以及NS1蛋白对GEF细胞线粒体的影响。分别通过对感染了GPV及转染了NS1后24、36及48h时的GEF细胞进行线粒体膜电位检测，结果显示：在GPV感染组，与对照组相比，实验组JC-1由于线粒体膜电位降低而产生绿色荧光，但是在对照细胞中，由于线粒体膜电位高，JC-1在线粒体基质中形成聚合物，产生红色荧光，而在空白对照细胞中，未检测到绿色荧光，说明GPV的感染能够导致GEF细胞线粒体发生膜电位下降(参见图9)。NS1蛋白转染组的结果显示：与对照组相比，NS1组的线粒体膜电位显著降低，说明NS1的表达能够导致GEF细胞线粒体发生膜电位下降(参见图9)。

(4.7)Western blot检测AIF蛋白表达：凋亡诱导因子(AIF)是通过线粒体外膜转运至胞质溶胶和细胞核是细胞凋亡的关键启动步骤。通过Western blot在GPV感染期间和NS1蛋白表达期间进行检测，在GEF的细胞核中，随着GPV感染时间的延长，与阴性对照组相比，细胞核中AIF的表达逐渐增加，数据分析显示，差异极显著(如图10中A和D所示)。在NS1蛋白表达期间，GEF的细胞核中，随着NS1蛋白的表达，细胞核中AIF的表达量也逐渐增加，数据分析显示差异极显著(如图10中B和E所示)。证明，GPV和NS1蛋白的作用，都能够促使AIF蛋白从线粒体中释放，并转移到细胞核中，启动细胞凋亡。

由于以上实验皆开展了GPV与NS1蛋白两组平行试验，结果均完全一致，因此我们认为诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的主要功能蛋白应为NS1蛋白(已经通过流式细胞术验证VP1蛋白不能诱导鹅胚成纤维细胞凋亡)，所以为了快速初步探寻活性氧(ROS)以及溶酶体的反应，我们只开展了GPV实验组的研究，以供参考：

(4.8)流式细胞术检测GPV作用下GEF细胞内活性氧(ROS)变化：线粒体是ROS的主要产生者，并且对ROS的作用最敏感。线粒体介导的凋亡可能不仅限于细胞色素C在caspase-3激活中的作用，而且ROS可能提供替代的线粒体信号传导途径。ROS的产生是不可避免的事件，可以通过线粒体膜的功能损伤显著增强。本研究通过流式细胞术检测了GPV感染GEF细胞后，细胞内的ROS水平变化，结果表明：随着感染时间的增加，GEF细胞内的ROS水平显著增加，并与对照细胞相比差异极显著(p<0.001)(如图11所示)。证明：GPV感染能够使GEF细胞线粒体膜电位损伤，并引起线粒体释放ROS，ROS会对细胞DNA造成损害，从而导致DDR。

(4.9)ELISA检测GEF组织蛋白酶D活性变化：越来越多的证据表明，组织蛋白酶的活性可能在AIF的释放中起关键作用。通过试剂盒检测了感染GPV后12、24、36及48h的GEF细胞的组织蛋白酶D量。首先根据标准品建立标准曲线y＝0.0012x-0.0725，R2＝0.978(参见图12)，然后将实验组的OD值带入标曲，得到实验组组织蛋白酶D总量的结果图(OD值见表1)，如图13所示，根据数据分析显示，与对照组相比，实验组细胞内的组织蛋白酶D的总量随着感染时间的增加而增加，且差异显著，表明GPV的感染促进了溶酶体对组织蛋白酶D的释放，进而促进下一步AIF蛋白进入细胞核。

ELISA检测GEF组织蛋白酶D的实验组的OD值

应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 一种可以诱导鹅胚成纤维细胞凋亡的鹅细小病毒蛋白及其制备方法

<130> 2020.04.10

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 627

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Ser Arg Pro Leu Gln Ile Ser Ser Asp Lys Phe Tyr Glu

1 5 10 15

Val Ile Ile Arg Leu Pro Ser Asp Ile Asp Gln Asp Val Pro Gly Leu

20 25 30

Ser Leu Asn Phe Val Glu Trp Leu Ser Thr Gly Val Trp Glu Pro Thr

35 40 45

Gly Ile Trp Asn Met Glu His Val Asn Leu Pro Met Val Thr Leu Ala

50 55 60

Glu Lys Ile Lys Asn Ile Phe Ile Gln Arg Trp Asn Gln Phe Asn Gln

65 70 75 80

Asp Glu Thr Asp Phe Phe Phe Gln Leu Glu Glu Gly Ser Glu Tyr Ile

85 90 95

His Leu His Cys Cys Ile Ala Gln Gly Asn Val Arg Ser Phe Val Leu

100 105 110

Gly Arg Tyr Met Ser Gln Ile Lys Asp Ser Ile Ile Arg Asp Val Tyr

115 120 125

Glu Gly Lys Gln Ile Lys Ile Pro Asp Trp Phe Ala Ile Thr Lys Thr

130 135 140

Lys Ser Gly Gly Gln Asn Lys Thr Val Thr Ala Thr Tyr Ile Leu His

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Pro Lys Lys Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Phe Thr Asn

165 170 175

Met Pro Leu Phe Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gln Lys Arg Gln Glu

180 185 190

Leu Leu Asp Ala Phe Gln Glu Ser Asp Leu Ala Ala Pro Leu Pro Asp

195 200 205

Pro Gln Ala Ser Thr Val Ala Pro Leu Ile Ser Asn Arg Ala Ala Lys

210 215 220

Asn Tyr Ser Asn Leu Val Asp Trp Leu Ile Glu Met Gly Ile Thr Ser

225 230 235 240

Glu Lys Gln Trp Leu Thr Glu Asn Arg Glu Ser Tyr Arg Ser Phe Gln

245 250 255

Ala Thr Ser Ser Asn Asn Arg Gln Val Lys Ala Ala Leu Glu Asn Ala

260 265 270

Arg Ala Glu Met Leu Leu Thr Lys Thr Ala Thr Asp Tyr Leu Ile Gly

275 280 285

Lys Asp Pro Val Leu Asp Ile Ile Lys Asn Arg Val Tyr Gln Ile Leu

290 295 300

Lys Met Asn Asn Tyr Asn Pro Gln Tyr Val Gly Ser Ile Leu Cys Gly

305 310 315 320

Trp Val Lys Arg Glu Phe Asn Lys Arg Asn Ala Ile Trp Leu Tyr Gly

325 330 335

Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala

340 345 350

Ile Pro Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe

355 360 365

Asn Asp Cys Val Asp Lys Met Leu Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met

370 375 380

Thr Asn Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Ala

385 390 395 400

Val Arg Val Asp Gln Lys Cys Lys Gly Ser Val Cys Ile Glu Thr Thr

405 410 415

Pro Val Ile Ile Thr Ser Asn Thr Asp Met Cys Met Ile Val Asp Gly

420 425 430

Asn Ser Thr Thr Met Glu His Arg Ile Pro Leu Glu Glu Arg Met Phe

435 440 445

Gln Ile Val Leu Ser His Lys Leu Glu Pro Ser Phe Gly Lys Ile Ser

450 455 460

Lys Lys Glu Val Arg Glu Phe Phe Lys Trp Ala Asn Asp Asn Leu Val

465 470 475 480

Pro Val Val Ser Glu Phe Lys Val Arg Thr Asn Glu Gln Thr Asn Leu

485 490 495

Pro Glu Pro Val Pro Glu Arg Ala Asn Glu Pro Lys Glu Pro Pro Lys

500 505 510

Ile Trp Ala Pro Pro Thr Arg Glu Glu Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ala

515 520 525

Ser Pro Glu Leu Phe Ser Ser Val Ala Pro Ile Pro Val Thr Pro Gln

530 535 540

Asn Ser Pro Glu Pro Lys Arg Ser Arg Asn Asn Tyr Gln Val Arg Cys

545 550 555 560

Ala Leu His Thr Tyr Asp Asn Ser Met Asp Val Phe Glu Cys Ile Glu

565 570 575

Cys Glu Lys Ala Asn Phe Pro Glu Phe Gln Pro Leu Gly Glu Asn Tyr

580 585 590

Cys Asp Glu His Gly Trp Tyr Asp Cys Ala Ile Cys Lys Glu Leu Lys

595 600 605

Asn Glu Leu Ala Glu Ile Glu His Val Phe Glu Leu Asp Asp Ala Glu

610 615 620

Asn Glu Gln

625

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

acggatccat ggcactttct aggcctct 28

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gcctcgagtt attgttcatt ttcagcatca tcaagct 37