阅读说明：本技术 一种羊耳菊提取物及其制备和应用 (Chrysanthemum indicum extract and preparation and application thereof ) 是由 杨建波 阮国永 刘光军 钟正胜 张旭 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及是一种羊耳菊提取物及其制备和应用。所述羊耳菊提取物的制备方法,包括以下步骤：(1)预处理；(2)膨化处理：预处理后的羊耳菊粉碎物加到真空膨化罐中,进行压差膨化处理,获得羊耳菊膨化处理物；(3)提取：将羊耳菊膨化处理物添加到离子液体中进行超声提取,过滤,除去滤液中的离子液体,制得提取液；(4)纯化：将提取液采用柱层析分离,减压浓缩,去除洗脱剂,制得纯化液；(5)固定化。本发明提供的制备方法,整个制备方法在低温下进行,能降低活性成分提取过程中的损失,提高活性成分提取率,更能富聚药物活性成分。本发明所制得的羊耳菊提取物对吸入性颗粒物引起的肺部损伤、肺纤维化具有良好的治疗作用。(The invention relates to a inula cappa extract and a preparation method and application thereof. The preparation method of the inula cappa extract comprises the following steps: (1) pre-treating; (2) puffing: adding the pretreated inula cappa crushed material into a vacuum puffing tank, and carrying out differential pressure puffing treatment to obtain an inula cappa puffed treated material; (3) extraction: adding the expanded product of the inula cappa into ionic liquid for ultrasonic extraction, filtering, and removing the ionic liquid in the filtrate to obtain an extracting solution; (4) and (3) purification: separating the extractive solution by column chromatography, concentrating under reduced pressure, and removing eluent to obtain purified solution; (5) and (4) immobilizing. The preparation method provided by the invention is carried out at low temperature, can reduce the loss in the extraction process of the active ingredients, improves the extraction rate of the active ingredients, and can enrich the active ingredients of the medicine. The inula cappa extract prepared by the invention has good treatment effect on lung injury and pulmonary fibrosis caused by inhalation particles.)

一种羊耳菊提取物及其制备和应用

技术领域

本发明属于中药加工技术领域，尤其是一种羊耳菊提取物及其制备和应用。

背景技术

羊耳菊，为菊科植物羊耳菊的根及全草，又称为白牛胆、大力王、毛柴胡、叶下白、山白芷，为南方民间草药。羊耳菊根及全草的化学成分有半萜内酯、三萜、淄醇、黄酮、芳香化合物、有机酸等，祛风散寒，行气利水，化痰止咳，消肿止痛之功效。常用于风寒感冒，咳嗽，神经性头痛，胃痛，风湿腰腿痛，跌打肿痛，***，白带，血吸虫病。

空气颗粒物是指空气中由各种固体或液体微粒组成的气溶胶体系中各种分散的离子，即各种固态和液态颗粒物质的总称。颗粒物是空气中主要污染物，其理化特征非常复杂。根据颗粒物的空气动力学当量直径，通常将其分为总悬浮颗粒物(粒径≤100μm)、PM10(粒径≤10μm)、PM2.5(粒径≤2.5μm)。空气颗粒物的成分复杂，包括多种金属元素、无机盐类、有机物、颗粒物吸附的多种病原微生物等。PM2.5的粒径较小，可随呼吸进入人体肺组织深处，对人体肺组织产生严重危害。据相关研究，吸入性颗粒物通过肺泡巨噬细胞的吞噬作用进入肺内，被巨噬细胞处理后激活特异性免疫反应，引起纤维细胞活化，导致组织增生，形成纤维化。颗粒物还可通过氧化应激引起肺部炎症反应；氧化应激可直接损伤肺组织，引发炎症损伤、细胞因子释放、炎性基因表达，通过一系列机制使肺成纤维细胞增殖，基质胶原沉积，肺顺应性下降，限制性通气障碍，导致纤维化产生等等。

目前，羊耳菊活性成分在治疗空气颗粒物引起的肺部损伤、肺部纤维化的研究减少。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明通过对羊耳菊活性成分及其提取方法进行研究，提供了一种羊耳菊提取物的制备方法，所制得的羊耳菊提取物对空气颗粒物引起的肺部损伤、肺部纤维化具有良好的防治大效果，具体是通过以下技术方案实现的。

一种羊耳菊提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将羊耳菊粉碎后，加入其质量0.1-0.15％的预处理剂混合均匀，调节其含量为20-50％；

(2)膨化处理：预处理后的羊耳菊粉碎物加到真空膨化罐中，进行压差膨化处理，获得羊耳菊膨化处理物；

(3)提取：将羊耳菊膨化处理物添加到离子液体中进行超声提取，过滤，除去滤液中的离子液体，制得提取液；

(4)纯化：将提取液采用柱层析分离，减压浓缩，去除洗脱剂，制得纯化液；

(5)固定化：将纯化液与固定剂搅拌混合均匀，真空干燥，制得羊耳菊提取物。

优选地，所述羊耳菊粉碎至60-80目；所述预处理剂为碳酸氢钠。

优选地，所述压差膨化处理的条件为：加热使膨化罐内的温度为30-40℃，先在0.2-0.4MPa下处理15-20min，然后-0.01～-0.03MPa下处理20-30min。

优选地，所述离子液体为浓度为0.5mol/L的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液；添加量为羊耳菊膨化处理物质量的10倍。

优选地，所述超声提取的条件为：超声功率200W，超声时间35-40min。

优选地，所述柱层析分离条件为：100-200目硅胶柱，洗脱剂由70％乙醇、丙酮按1:1的体积比组成。

优选地，所述固定剂为纳米纤维素，添加量为纯化液质量的1-1.5倍。

本发明的另一目的在于提供一种上述制备制备方法所制得的羊耳菊提取物。

本发明还提供了一种上述羊耳菊提取物在治疗吸入性颗粒物引起的肺部损伤药物中的应用。

优选地，所述羊耳菊提取物在治疗吸入性颗粒物引起的肺纤维化药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明采用压差膨化对羊耳菊进行处理后再提取，压差膨化能有效破坏植物细胞的细胞壁，提高后续提取过程中有效成分的浸出率，而且基本不会引起羊耳菊挥发性成分损失。采用离子液体辅助超声提取进行提取，能同时提取羊耳菊的水溶性成分和脂溶性成分，更能富集羊耳菊活性成分。本发明提供的制备工艺，整个提取工艺在低温下进行，能降低活性成分提取过程中的损失，提高活性成分提取率，更能富聚药物活性成分；提取后的提取液采用纳米微晶纤维素进行处理，能同时增强药物活性成分的稳定性和生物相容性，提高其药效。本发明所制得的羊耳菊提取物对吸入性颗粒物引起的肺部损伤、肺纤维化具有良好的治疗作用。

为能更好的阐述本发明的有益效果，本发明还列举了如下试验例，旨在说明本发明的有益效果，但决不仅限于本发明的保护范围。

试验例1提取工艺研究

1.提取方式筛选：本发明在进行工艺研究过程中，为最大限度地利用各药物的活性成分，将羊耳菊干燥粉碎至60-80目，分别对超声辅助水提取、水煎提、乙醇回流提取、超声辅助乙醇提取、离子液体浸提、超声辅助离子液体提取等方式进行考察，结果显示，采用超声辅助离子液体提取的方式，不仅该配方药材的活性成分提取效率高，半萜内酯、槲皮素、绿源酸等的含量高，溶出物多。综合批量大生产中生产时间、生产成本等因素，进一步对超声提取的功率、提取时间进行考察。

通过采用5个超声功率(100W、200W、300W、400W、500W)，5个提取时间(20-30min、30-40min、40-50min、50-60min、60-70min)，进行考察，结果显示，当采用200W超声提取50-60min时，其提取液更能富聚药物活性成分，通过检测，挥发油含量≥0.37％生药、多糖≥0.86％生药、黄酮含量≥7.2％生药、总浸出物≥53％生药，发挥最大药效。其中，在提取前进行压差膨化度处理，效果最佳，不仅活性成分含量理想，还可以缩短提取时间为35-40min。由于压差膨化对羊耳菊植物细胞壁的破坏作用，能促进有效成分的他溶出，缩短了提取时间。其中，提取后采用柱层析进行纯化，能去除提取液中的杂质，更能富集其中的活性成分。

试验例2药效学研究

1、吸入性颗粒物所致大鼠呼吸系统损伤的保护作用研究

1.1实验动物：SD大鼠，SPF级。共50只，雌雄各半，动物订购时6～8周龄，体重180～200g。所有大鼠统一饲养一周后用于试验；饲养期间，每周更换1次垫料和笼具，每日添加鼠专用饲料供动物食用，另使用饮水瓶灌装水供动物饮用，整个饲养过程中保持动物饮食活动自由。

1.2实验方法

将SD大鼠随机分为5组，每组10只，雌性各半。实施例1所制得的羊耳菊提取物，将羊耳菊提取物加水制成浓度为0.1g/ml的药液。

对照组：大鼠每日口鼻部暴露于清洁的吸入染毒装置吸入清洁空气30min。

模型组：大鼠每日口鼻部暴露于空气细颗粒物气溶胶染毒装置，吸入空气雾霾30min；

试验组1(低剂量组)：大鼠每日口鼻部暴露于空气细颗粒物气溶胶染毒装置，吸入空气雾霾30min；染毒前1小时灌胃给与1ml/100g(小鼠体重)的药液。

试验组2(中剂量组)：大鼠每日口鼻部暴露于空气细颗粒物气溶胶染毒装置，吸入空气雾霾30min；染毒前1小时灌胃给与2.5ml/100g(小鼠体重)的药液。

试验组3(高剂量组)：大鼠每日口鼻部暴露于空气细颗粒物气溶胶染毒装置，吸入空气雾霾30min；染毒前1小时灌胃给与5ml/100g(小鼠体重)的药液。

采用EMKA动物肺功能监测系统进行清醒大鼠肺功能的测定，将EMKA动物肺功能监测系统放置于安静的实验室内，正式测定前系统校正，标定，通气，数据采集频率为每5秒自动采集一次，每分钟显示一次测定结果。将大鼠放入全体体描计箱内适应5-10min，记录3-8min，将每只动物的结果的均值作为本次动物肺功能的测定结果。测定指标包括吸气时间(Ti)、呼气时间(Te)、潮气量(TV)、呼气量(EV)、放松时间(RT)、每分钟通气量(MV)。在大鼠染毒8周后测定动物呼吸功能，将大鼠放入全体体积描记箱中，连接呼吸功能测定仪进行测定，结果见表1。

表1

Ti(msec)

Te(msec)

TV(ml)

EV(ml)

RT(msec)

MV(ml)

对照组

96.8±16.2

168.7±16.4

0.97±0.22

1.02±0.38

105.4±34.2

297.3±38.4

模型组

101.3±17.6

192.4±19.2

0.72±0.28

0.85±0.42

118.3±32.5

229.4±32.1

试验组1

99.8±20.3

183.7±22.7

0.86±0.32

0.93±0.41

109.6±35.6

287.4±36.4

试验组2

98.4±18.2

178.7±21.2

0.90±0.36

0.97±0.34

106.2±34.4

290.2±38.2

试验组3

97.1±16.7

173.4±21.8

0.92±0.31

0.99±0.32

104.8±35.3

295.8±40.2

模型组大鼠吸入染毒的Ti值明显高于对照组(p<0.05)，染毒SD大鼠的RT明显高于对照组(p<0.05)，说明当模型组大鼠与流量和容量相关的肺功能指标受到了显著抑制。模型组大鼠TV、EV和MV在观察期间均有不同程度的降低，说明呼吸的容积量明显下降，肺通气功能储备量亦降低。而试验组1-3与模型组比较，均能显著提升改善连续吸入细颗粒物造成的大鼠肺功能损伤，具有一定的改善作用。

2.羊耳菊提取物对颗粒物致小鼠肺纤维化的影响研究

2.1实验材料

实验动物：SPF级ICR健康小鼠50只，体质量18～20g，1.1所有小鼠统一饲养一周后用于试验；饲养期间，每周更换1次垫料和笼具，每日添加鼠专用饲料供动物食用，另使用饮水瓶灌装水供动物饮用，整个饲养过程中保持动物饮食活动自由。

PM2.5：在贵州省某燃煤电厂附近采集的PM2.5，加生理盐水制成浓度为30mg/ml的颗粒物悬浮液。

2.2实验方法

将小鼠随机分为5组，每组10只，雌性各半。实施例1所制得的羊耳菊提取物，将羊耳菊提取物加水制成浓度为0.1g/ml的药液。

对照组：小鼠于实验开始第1、6、11、16、21天，经鼻腔滴入0.9％生理盐水(20μl/只)。

模型组(model)：小鼠于实验开始第1、6、11、16、21天，经鼻腔滴入30mg/ml的颗粒物悬浮液(20μl/只)；

试验组1(低剂量组)：小鼠于实验开始第1、6、11、16、21天，经鼻腔滴入30mg/ml的颗粒物悬浮液(20μl/只)；第1天至第21天，每天分别灌胃给与1ml/100g(小鼠体重)的药液。

试验组2(中剂量组)：小鼠于实验开始第1、6、11、16、21天，经鼻腔滴入30mg/ml的颗粒物悬浮液(20μl/只)；第1天至第21天，每天分别灌胃给与2.5ml/100g(小鼠体重)的药液。

试验组3(高剂量组)：小鼠于实验开始第1、6、11、16、21天，经鼻腔滴入30mg/ml的颗粒物悬浮液(20μl/只)；第1天至第21天，每天分别灌胃给与5ml/100g(小鼠体重)的药液。

第22天取材(肺组织)：各个实验组的模型小鼠均在第22天处死，取双侧肺组织，用锡箔纸包好标号置于液氮中快速冷冻后于80℃冰箱中保存待测。

组织匀浆的制备：取0.1g肺组织于离心管中，加入0.9g生理盐水，试管置于冰盒中，采用超声破碎法破碎组织后，分装于两个离心管中，离心管1以1500r/min离心10min，取上清液保存于4℃冰箱，用于SOD和MDA测定。离心管2以5000r/min离心5min，取上清液保存于4℃冰箱，用于IL-6和TNF-α测定。测定结果如表2所示。

表2

	SOD(U/ml)	MDA(nmol/L)	IL-6(pg/ml)	TNF-α(ml)
					对照组	99.43±7.12	5.13±0.26	76.14±5.68	551.96±70.05
模型组	74.18±7.34	16.43±1.68	134.28±21.26	813.46±64.58
					试验组1	80.23±7.38	14.39±2.24	126.48±18.21	769.89±69.34
试验组2	89.16±6.42	10.89±2.05	93.43±16.23	628.16±50.12
					试验组3	99.71±9.43	7.36±1.18	86.32±15.18	589.92±60.16

由上表结果可知，经鼻腔滴注PM2.5悬浮液液诱导小鼠后，模型组肺组织匀浆中SOD活性明显低于对照组，MDA含量、IL-6和TNF-α的含量水平均显著高于对照组；试验组1-3与与模型组比较，SOD活性、MDA含量、IL-6含量、TNF-α的含量均较模型组明显下降，说明羊耳菊提取物能显著改善PM2.45颗粒物造成的小鼠肺肺组织胶原沉积及纤维化样变。

具体实施方式

下面结核具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1

一种羊耳菊提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将羊耳菊粉碎至60-80目，加入其质量0.1％的碳酸氢钠混合均匀，调节含水量为20-50％；

(2)膨化处理：预处理后的羊耳菊粉碎物加到真空膨化罐中，进行压差膨化处理，获得羊耳菊膨化处理物；

(3)提取：将羊耳菊膨化处理物添加到离子液体中进行超声提取，过滤，除去滤液中的离子液体，制得提取液；

(4)纯化：将提取液采用柱层析分离，减压浓缩，去除洗脱剂，制得纯化液；

(5)固定化：将纯化液与其质量1倍的纳米纤维素搅拌混合均匀，真空干燥，制得羊耳菊提取物。

所述压差膨化处理的条件为：加热使膨化罐内的温度为30-40℃，先在0.2-0.4MPa下处理20min，然后-0.01～-0.03MPa下处理20min。

所述离子液体为浓度为0.5mol/L的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液；添加量为羊耳菊膨化处理物质量的10倍。

所述超声提取的条件为：超声功率200W，超声时间40min。

所述柱层析分离条件为：100-200目硅胶柱，洗脱剂由70％乙醇、丙酮按1:1的体积比组成。

实施例2

一种羊耳菊提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将羊耳菊粉碎至60-80目，加入其质量0.12％的碳酸氢钠混合均匀，调节含水量为20-50％；

(2)膨化处理：预处理后的羊耳菊粉碎物加到真空膨化罐中，进行压差膨化处理，获得羊耳菊膨化处理物；

(3)提取：将羊耳菊膨化处理物添加到离子液体中进行超声提取，过滤，除去滤液中的离子液体，制得提取液；

(4)纯化：将提取液采用柱层析分离，减压浓缩，去除洗脱剂，制得纯化液；

(5)固定化：将纯化液与其质量1.2倍的纳米纤维素搅拌混合均匀，真空干燥，制得羊耳菊提取物。

所述压差膨化处理的条件为：加热使膨化罐内的温度为30-40℃，先在0.2-0.4MPa下处理18min，然后-0.01～-0.03MPa下处理25min。

所述离子液体为浓度为0.5mol/L的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液；添加量为羊耳菊膨化处理物质量的10倍。

所述超声提取的条件为：超声功率200W，超声时间38min。

所述柱层析分离条件为：100-200目硅胶柱，洗脱剂由70％乙醇、丙酮按1:1的体积比组成。

实施例3

一种羊耳菊提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将羊耳菊粉碎至60-80目，加入其质量0.15％的碳酸氢钠混合均匀，调节含水量为20-50％；

(2)膨化处理：预处理后的羊耳菊粉碎物加到真空膨化罐中，进行压差膨化处理，获得羊耳菊膨化处理物；

(3)提取：将羊耳菊膨化处理物添加到离子液体中进行超声提取，过滤，除去滤液中的离子液体，制得提取液；

(4)纯化：将提取液采用柱层析分离，减压浓缩，去除洗脱剂，制得纯化液；

(5)固定化：将纯化液与其质量1.5倍的纳米纤维素搅拌混合均匀，真空干燥，制得羊耳菊提取物。

所述压差膨化处理的条件为：加热使膨化罐内的温度为30-40℃，先在0.2-0.4MPa下处理15min，然后-0.01～-0.03MPa下处理30min。

所述离子液体为浓度为0.5mol/L的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液；添加量为羊耳菊膨化处理物质量的10倍。

所述超声提取的条件为：超声功率200W，超声时间35min。

所述柱层析分离条件为：100-200目硅胶柱，洗脱剂由70％乙醇、丙酮按1:1的体积比组成。

在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。