阅读说明：本技术 一种提高卷枝毛霉wj11中链脂肪酸产量的方法 (Method for increasing yield of medium-chain fatty acid of mucor circinelloides WJ11 ) 是由 张怀渊 高萌 宋元达 王瑞雪 赵燕磊 辛菲菲 于 2020-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明是一种促进卷枝毛霉WJ11生产中链脂肪酸的方法,属于微生物油脂领域。本发明利用在发酵培养基中添加氯化钴溶液,改变了卷枝毛霉的油脂组成,使其中链脂肪酸的占比增加,发酵条件为：添加氯化钴的终浓度为2 mmol/L,添加时间为接种后的24 h,接入种子液的接种量为10%,发酵罐转速为700 rpm,pH为6.2,空气流速为1 vvm,发酵温度为28℃,发酵时间为120 h,最终中链脂肪酸的含量从1.31%提高到了15.29%,其产量为1109.74 mg/L。(The invention discloses a method for promoting mucor circinelloides WJ11 to produce medium-chain fatty acid, and belongs to the field of microbial oil. The invention changes the grease composition of mucor circinelloides by adding the cobalt chloride solution into the fermentation medium, increases the proportion of the fatty acid therein, and the fermentation conditions are as follows: the final concentration of the added cobalt chloride is 2mmol/L, the adding time is 24 hours after inoculation, the inoculation amount of the inoculated seed liquid is 10 percent, the rotating speed of a fermentation tank is 700 rpm, the pH value is 6.2, the air flow rate is 1vvm, the fermentation temperature is 28 ℃, the fermentation time is 120 hours, the content of the medium-chain fatty acid is improved to 15.29 percent from 1.31 percent, and the yield is 1109.74 mg/L.)

一种提高卷枝毛霉WJ11中链脂肪酸产量的方法

技术领域

本发明属于微生物油脂领域。该发酵方法能促进卷枝毛霉WJ11产出中链脂肪酸，并且产量可观。

背景技术

丝状真菌在自然界中广泛存在，卷枝毛霉（Mucor circinelloides）就是其中一种常见的高产油脂的菌种，它能够产生大量的亚油酸、γ-亚麻酸并在细胞内积累。本发明所用的菌种为卷枝毛霉WJ11，它可以产生高达占细胞干重（CDW）36%的脂质，但这些油脂都是C14以上的长链脂肪酸，比如γ-亚麻酸(顺式-6,9,12-十八碳三烯酸)等。

中链脂肪酸 (MCFA) 是一定链长脂肪酸的统称，一般是指辛酸、癸酸等六碳链到十二碳链的脂肪酸。中链脂肪酸是食品、医疗和化工产品的重要前体。摄入的中链脂肪酸通过门静脉直接运输到肝脏参与氧化，从而快速提供能量，不会引起肥胖，非常有利于极限运动员和减肥人群。自然界中的中链脂肪酸主要存在于椰子油、棕榈仁油中，但含量不高（低于总油脂含量的15%）。在工业生产中，中链脂肪酸的来源主要是人工化学合成或者基因工程改造，通过产油微生物来生产中链脂肪酸的方法也较少。

发明内容

本发明展开了一种方便有效的提高中链脂肪酸产量的方法，即向发酵培养基中添加氯化钴溶液。这相对于人工化学合成和基因工程操作省时省力，收益可观。

技术方案：

在之前的实验中，我们选取了Al³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺等多种金属离子分别添加到卷枝毛霉WJ11的培养基中，测定卷枝毛霉WJ11产生的油脂含量以后发现Co²⁺的加入使卷枝毛霉WJ11产出了中链脂肪酸C10和C12。对此现象我们又进行了深入的研究，通过控制Co²⁺的浓度和Co²⁺的添加时间不同从而确定了最优的发酵条件。

本发明的收益效果：

Co²⁺的加入能促进卷枝毛霉WJ11中链脂肪酸的合成，使其比例升高，实验选出了最优的发酵条件即在24 h时加入2 mmol/L Co²⁺，在此发酵条件下Co²⁺促进卷枝毛霉中链脂肪酸合成的效果最好，能使卷枝毛霉产生占总油脂含量15.3%的中链脂肪酸，其含量达到1109.7mg/L。

具体实施方式

菌种：

卷枝毛霉WJ11（Mucor circinelloides WJ11, CCTCC No. M 2014424; China Centerfor Type Culture Collection）

最佳Co²⁺浓度的确定：

本发明设计了6组不同的Co²⁺浓度梯度，将它们在配制培养基时分别加入6个完全相同的挡板三角瓶中，每个三角瓶中都装有200 mL发酵培养基，配方为葡萄糖 80 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L，酒石酸铵2.0 g/L，KH₂PO4 7 g/L，Na₂HPO4 2 g/L，酵母抽提物 1.5 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1 g/L，FeCl₃·6H₂O 8 mg/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.1 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.1 mg/L， MnSO₄·5H₂O 0.1 mg/L，接种量为10%，放入恒温摇床中培养，转速150 rpm，温度28 ℃，培养时间为96 h。

表1 不同Co²⁺的添加量

编号	1	2	3	4	5	6
							Co<sup>2+</sup>浓度（mmol/L）	0	1	2	3	4	5
CoCl<sub>2</sub>溶液（μL）	0	10	20	30	40	50

表2 不同Co²⁺的添加量下中链脂肪酸的产量

Co<sup>2+</sup>浓度(mmol/L )	0	1	2	3	4
						中链脂肪酸含量 ( % )	1.385	4.358	9.022	7.702	7.175

实验结果表明，C10和C12总和即中链脂肪酸的含量受到Co²⁺的影响，Co²⁺浓度为6mmol/L时卷枝毛霉不生长，在Co²⁺的添加量为2 mmol/L时有最大值，此时中链脂肪酸所含比例最高，达到占总油脂含量的9.022%。

最佳的Co²⁺添加时间：

本实验组包含四个完全相同的挡板三角瓶，每个三角瓶中都装有200 mL发酵培养基，最佳Co²⁺浓度为2 mmol/L，分别在溶液配制时（0h）、一天后（24h）、两天后（48h）、三天后（72h）加入。接种量为10%，放入恒温摇床中培养，转速150 rpm，温度28 ℃，培养时间为96h。

表3 不同Co²⁺添加时间下中链脂肪酸的产量

Co<sup>2+</sup>添加时间( d)	0	1	2	3
					中链脂肪酸含量 ( % )	9.917	14.543	5.316	4.202

实验结果表明，当在发酵一天后加入Co²⁺使得卷枝毛霉中链脂肪酸的含量达到最高，其中的中链脂肪酸占总油脂含量的14.543%。在发酵两天及以后再加入Co²⁺对其中链脂肪酸产生的促进作用降低，低于在配制培养基时加入Co²⁺。因此在发酵一天后加入Co²⁺是最优选择。

发酵罐发酵

种子培养：将储存在-80 ℃ 甘油中的卷枝毛霉WJ11接入种子培养基中，放入恒温摇床中培养，转速150 rpm，温度28 ℃，培养时间为24 h，获得种子液。

本实验采用四个发酵罐同时发酵，编号依次为F1、F2、F3、F4，设置的发酵条件如表2所示，设置发酵罐的转速为700 rpm，pH为6.2，温度为28℃，空气流速为1 vvm，发酵时间为120h。

表4 发酵罐中的发酵条件

编号	F1	F2	F3	F4
					种子液（mL）	100	100	100	100
产脂培养基（mL）	900	900	900	900
					Co<sup>2+</sup>浓度（mmol/L）	0	2	2	1
Co<sup>2+</sup>添加时间（h）	0	0	24	24

表5 发酵罐120 h脂肪酸组成（%）

	F1	F2	F3	F4
					C10:0	0.34±0.05	4.27±0.37	4.67±0.36	4.23±0.37
C12:0	0.97±0.11	9.28±0.91	10.62±0.56	9.04±0.89
					C14:0	2.05±0.95	7.20±0.85	7.09±0.74	6.15±0.62
C16:0	33.29±1.2	20.02±1.17	21.61±1.58	21.55±1.57
					C18:0	6.23±0.85	34.56±1.45	34.97±1.76	31.96±1.38
C18:1	31.56±1.87	8.51±0.95	7.96±0.82	9.81±1.01
					C18:2	12.35±1.21	10.28±1.05	8.76±0.88	10.53±1.07
C18:3	13.21±1.35	5.88±0.36	4.33±0.45	6.74±0.72

表6 发酵罐中链脂肪酸的含量（%）

	F1	F2	F3	F4
					24h	0.191	1.35	0.236	0.973
48h	0.714	7.573	0.809	6.949
					72h	1.132	10.683	9.275	8.73
96h	1.205	12.734	13.859	11.295
					120h	1.31	13.553	15.29	13.267

表7 发酵罐中链脂肪酸的产量（mg/L）

	F1	F2	F3	F4
					24h	0.700	1.545	1.054	1.228
48h	29.700	89.615	36.052	186.447
					72h	68.762	375.340	505.000	421.404
96h	94.201	596.570	969.578	757.936
					120h	108.071	680.118	1109.737	902.018

从实验结果中可以看出，往培养基中加入Co²⁺会影响卷枝毛霉中的脂肪酸组成，C10:0、C12:0、C14:0、C18:0的含量相对于对照组有明显的提高，当在1d时加入2 mmol/LCo²⁺时，卷枝毛霉油脂中的中链脂肪酸含量最高。发酵结束时，1d时加入2 mmol/LCo²⁺条件下卷枝毛霉产出中链脂肪酸的产量为1109.7 mg/L。