阅读说明：本技术 抑制t细胞衰竭的组合物和方法 (Compositions and methods for inhibiting T cell depletion ) 是由 克里斯托·麦考尔 瑞秋·琳恩 埃文·温伯 埃琳娜·索蒂罗 于 2018-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及T细胞组合物及其在疗法(therapy)和治疗(treatment)情形下的使用方法。特别地,本发明提供了经修饰的T细胞(例如,遗传和/或功能修饰)以在未经修饰T细胞呈现衰竭的条件下维持功能。本申请公开的组合物和方法可用于预防改造的(例如,嵌合抗原受体(CAR)T细胞)以及未改造的T细胞的衰竭,从而增强T细胞的功能(例如,抗癌症或抗传染病的活性)。(The present invention relates to T cell compositions and methods of use thereof in the context of therapy (therapy) and treatment (treatment). In particular, the invention provides modified T cells (e.g., genetically and/or functionally modified) to maintain function under conditions in which unmodified T cells exhibit depletion. The compositions and methods disclosed herein can be used to prevent the depletion of engineered (e.g., Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells) as well as unmodified T cells, thereby enhancing the function of the T cells (e.g., anti-cancer or anti-infectious disease activity).)

抑制T细胞衰竭的组合物和方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月28日提交的美国临时申请62/738,687和2017年12月15提交的美国临时申请62/599,299的优先权，其全部内容在此参考并入。

技术领域

本发明涉及T细胞组合物及其在疗法和治疗情形下的使用方法。特别地，本发明提供了经修饰的T细胞(例如，遗传和/或功能修饰)以在未修饰T细胞呈现衰竭的条件下维持功能。本申请公开的组合物和方法可用于预防改造的(例如，嵌合抗原受体(CAR)T细胞)以及未改造的T细胞的衰竭，从而增强T细胞的功能(例如，抗癌症或抗传染病的活性)。本发明所述的组合物和方法可用于临床和研究领域，例如生物学、免疫学、医学和肿瘤学领域。

背景技术

T细胞是被抗原调动后经由T细胞受体(TCR)信号传导和共刺激而被激活的免疫细胞。通过T细胞受体的生理活化使得T细胞能够介导有效的抗肿瘤和/或抗感染作用。在急性炎症反应消退期间，活化的效应T细胞亚类分化为长寿记忆细胞。相比之下，在患有慢性感染或癌症的患者中，T细胞经常会发生朝向功能障碍状态的病理分化，这被称为T细胞衰竭。T细胞衰竭的特征在于代谢功能、转录程序、效应子功能(例如细胞因子分泌、杀伤能力)的丧失以及多种表面抑制性受体的共表达发生显著变化。T细胞衰竭的根本原因是持续的抗原暴露导致持续的TCR信号传导。长期以来，一直寻求能预防或逆转T细胞衰竭，以此作为增强T细胞效力的手段(例如，在患有癌症或慢性感染的患者中)。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞在B细胞恶性肿瘤中显示出令人惊叹的应答率，但是仅在约50％的B-ALL1和大B细胞淋巴瘤患者中有长期的疾病控制(参考文献2；其全部内容在此参考并入)，并且在CLL中的频率甚至更低(参考文献3；其全部内容在此参考并入)。而且，虽然进行了许多试验，但CAR T细胞仍未能在实体瘤中介导持久的抗肿瘤作用(参考文献4；其全部内容在此参考并入)。许多因素限制了CAR T细胞的功效，包括异源抗原的表达以及用于获得最佳CAR功能从而能够对抗原丢失变体进行快速选择而所需的高抗原密度(参考文献5-7；这些文献的全部内容在此参考并入)、抑制性肿瘤微环境(参考文献8；其全部内容在此参考并入)和由T细胞衰竭导致的固有的T细胞功能障碍(参考文献3、9、10；这些文献的全部内容在此参考并入)。T细胞衰竭已越来越多地被认为是导致CAR T细胞中T细胞功能障碍的原因。由于scFv的聚集，内在的抗原非依赖性信号传导通常发生在表达CAR的T细胞中，并且可以诱导快速衰竭(参考文献9；其全部内容在此参考并入)。将CD28内结构域整合到第二代CAR T细胞受体中虽然增强了扩增能力，但无论是在递补性(tonic)信号传导受体的环境中还是在暴露于高肿瘤负荷下的CD19-28z CAR T细胞中都容易发生CAR T细胞衰竭(参考文献9；其全部内容在此参考并入)。最近已证实，CD19-BBz CAR移植物中所含的带有衰竭特征的T细胞的频率增加能区分接受针对CLL3的治疗的无应答性患者和应答性患者。来自各种研究的广泛数据表明，由于T细胞衰竭而引起的固有T细胞功能障碍是限制CAR T细胞疗法疗效的主要因素，并预期改造出能抵抗衰竭的CAR T细胞可以显著改善临床结果。

发明内容

本发明涉及用于预防改造的(例如，被改造成表达合成的受体如改造的T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞)和未改造的(例如，初始的)T细胞的衰竭的组合物和方法。根据本发明的修饰(例如，以预防T细胞衰竭)的T细胞、包含所述修饰的T细胞的组合物、以及使用所述修饰的T细胞以增强T细胞的功能性(例如，针对癌症或传染病的活性)的方法。

CAR T细胞在一小类癌症患者中介导抗肿瘤效应，但是由于T细胞衰竭而引起的功能障碍极大地阻碍了它的发展。为了研究表达CAR受体的人T细胞衰竭的生物学特性，在本申请的实施方案的开发过程中，使用模型系统进行了实验，所述模型系统采用了递补性信号传导CAR，其诱导了在其他环境中描述的衰竭特征。结果表明，衰竭与IL-2产生的严重缺陷伴随AP-1转录因子基序对染色质可及性的增加，以及与参与抑制活性的众多bZIP和IRF转录因子的过表达有关。将CAR T细胞改造成过表达AP-1因子(例如c-Jun)在许多体内肿瘤模型中增强了扩增潜力，提升了功能性，减少了终末分化并改善了抗肿瘤能力。

在本申请实施方案的开发过程中进行的实验还证明，AP-1因子(例如c-Jun)的功能缺陷介导了衰竭的人T细胞的功能障碍，以及改造CAR T细胞以过表达AP-1因子(例如c-Jun)能使它们抵抗衰竭，从而为这一新兴治疗方法取得进展扫清了主要障碍。

在本申请实施方案的开发过程中进行的实验还证明，IRF4的敲除显著提升了衰竭性HA-28z CAR T细胞的功能活性，c-Jun修饰的HA-28z CAR T细胞的体内功能的增强不能通过离体提供IL-2进行重复，c-Jun在抑制性实体瘤微环境中能增强Her2-BBz CAR T细胞的活性，c-Jun的过表达提升了对衰竭性HA-28z CAR T细胞的TGFβ介导的抑制的抗性，以及c-Jun修饰的细胞的转录变化与衰竭减少和记忆形成的提高一致。

如本申请所述，提供了改造的T细胞(例如，经改造以表达合成受体如改造的T细胞受体或CAR的T细胞)以及未改造的(例如，初始的、天然的)T细胞，它们被修饰成过表达和/或包含升高水平(例如，使其具有生理学升高水平)的一种或多种激活蛋白1(AP-1)转录因子(例如，c-Fos、c-Jun、激活转录因子(ATF)和Jun二聚化蛋白(JDP)家族)和/或被修饰(例如，遗传修饰)以降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员(例如，JunB和BATF3以及其他BATF家族成员、IRF4和ATF家族成员)的表达和/或活性。

因此，在一个方面，本发明提供了经修饰以过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞。例如，在一个实施方案中，在经改造以表达合成的受体(例如，改造的T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR))的T细胞中表达c-Jun。在另一个实施方案中，在具有初始的天然T细胞受体的T细胞中表达c-Jun。本发明不受表达一种或多种AP-1转录因子的方式的限制。在一个实施方案中，当与改造的TCR或CAR共表达时，c-Jun(和/或其他AP-1转录因子)和所述改造的受体在不同的病毒载体中共表达。在另一个实施方案中，它们通过使用双顺反子载体在单一载体构建体中表达。C-Jun(和/或其他AP-1转录因子)可以组成性表达或以受调控的方式(例如，使用通过小分子远程地调控表达的系统或使用内源调控系统)表达。在另一个实施方案中，可以使用逆转录病毒、慢病毒或其他病毒载体或经由基于CRISPR/cas9的系统将c-Jun和/或其他AP-1转录因子基因遗传整合到细胞DNA中。在又一个实施方案中，经由RNA或溶瘤病毒或本领域已知的其他瞬时表达系统表达c-Jun和/或其他AP-1转录因子。C-Jun和/或其他AP-1转录因子可以离体递送到T细胞中以进行过继转移，也可以经由体内遗传转移来递送。

类似地，本发明不受被修饰成过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或被修饰(例如遗传修饰)以降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员(例如JunB和BATF3以及其他BATF家族成员、IRF4和ATF家族成员)的表达和/或活性的T细胞的类型的限制。在一些实施方案中，所述T细胞是CD3+T细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞的组合)。在某些实施方案中，所述T细胞是CD8+T细胞。在其他实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是自然杀伤(NK)T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是αβT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+和CD8T+细胞的组合(例如，CD3+的T细胞)。在某些实施方案中，所述T细胞是记忆T细胞。在某些实施方案中，所述记忆T细胞是中央记忆T细胞。在某些实施方案中，所述记忆T细胞是效应记忆T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在某些实施方案中，所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK T细胞、记忆T细胞和/或γδT细胞的组合。在一些实施方案中，所述T细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞。

在一些实施方案中，T细胞是抗肿瘤T细胞(例如，具有抗肿瘤(例如，自体肿瘤)活性的T细胞，所述T细胞在应答抗原时被激活并扩增)。在一个实施方案中，抗肿瘤T细胞(例如，用于过继T细胞转移的抗肿瘤T细胞)包括用识别和应答肿瘤抗原的受体进行遗传修饰的来源于外周血的T细胞。此类受体通常包括胞外结构域，所述胞外结构域包含与细胞内T细胞信号传导基序相连的对肿瘤抗原具有特异性的单链抗体(scFv)(参见例如Westwood,J.A.et al,2005,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,102(52):19051-19056)。其他抗肿瘤T细胞包括获自切除的肿瘤或肿瘤活检标本的T细胞(例如，浸润肿瘤的淋巴细胞(TIL))。在另一个实施方案中，所述T细胞是多克隆或单克隆的肿瘤反应性T细胞(例如通过血液分离术获得，针对由自体或人工抗原呈递细胞呈递的肿瘤抗原进行离体扩增)。在另一个实施方案中，将所述T细胞进行改造以表达识别肿瘤抗原的人或鼠源性T细胞受体。本发明不限于以此方式识别的肿瘤抗原类型。事实上，包含识别肿瘤抗原的受体的任何T细胞都可用于本发明所述的组合物和方法中。实例包括但不限于表达受体(例如，初始的或天然存在的受体，或被改造成表达合成的受体(例如，改造的T细胞受体或CAR))的T细胞，所述T细胞识别选自下组的抗原：CD19、CD20、CD22、酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)蛋白质或抗原、叶酸受体、间皮素、人癌胚抗原(CEA)、CD33/IL3Rα、酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)或肝细胞生长因子受体(HGFR)、***特异性膜抗原(PSMA)、糖脂F77、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、NY-ESO-1、黑素瘤抗原基因(MAGE)家族成员A3(MAGE-A3)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1)、GP1000、p53或本申请所述的其他肿瘤抗原。

在一些实施方案中，所述T细胞被改造成表达CAR。本发明不受CAR类型的限制。实际上，任何特异性结合所需抗原(例如，肿瘤抗原)的CAR都可以如本申请所公开和描述的那样被修饰成过表达和/或包含升高水平(例如，使其具有生理学升高水平)的一种或多种AP-1转录因子(例如c-Jun)。在某些实施方案中，所述CAR包含抗原结合结构域。在某些实施方案中，所述抗原结合结构域是含有重链和轻链可变区的单链可变片段(scFv)，所述重链和轻链可变区与所需抗原特异性结合。在一些实施方案中，所述CAR还包含跨膜结构域(例如，T细胞跨膜结构域(例如，CD28跨膜结构域))和包含一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域(例如，T细胞受体信号传导结构域(例如，TCRζ链))。在一些实施方案中，所述CAR包含一个或多个共刺激结构域(例如，提供第二信号以刺激T细胞活化的结构域)。本发明不受共刺激结构域类型的限制。事实上，可以使用本领域已知的任何共刺激结构域，包括但不限于CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137/TNFRSF9、高亲和力免疫球蛋白E受体γ亚基(FcERIγ、ICOS/CD278、白介素2亚基β(ILRβ)或CD122、细胞因子受体共同亚基γ(IL-2Rγ)或CD132、和CD40。在一个实施方案中，所述共刺激结构域是4-1BB。

在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的疾病或病理状况的方法，所述方法包括向患有所述疾病或病症的所述受试者(例如，患者)施用有效量的T细胞，所述T细胞被修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或被修饰(例如，遗传修饰)以降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员(例如，JunB和BATF3以及其他BATF家族成员，IRF4和ATF家族成员)的表达和/或活性。本发明不受所治疗的疾病或病症的类型的限制。事实上，可以用T细胞治疗(例如，在治疗后疾病的指征或症状得到改善)的任何疾病或病症均可以通过使用本发明所述的组合物和方法(例如，含有和/或使用经修饰表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞)以一种改善的且更有效的方式进行治疗。在一个实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在另一个实施方案中，所述疾病或病症是传染病。本发明不受癌症类型或传染病类型的限制。事实上，任何可以用T细胞疗法治疗的本领域已知的癌症均可以使用本发明所述的组合物和方法来治疗。以类似的方式，任何可以用T细胞疗法治疗的本领域已知的传染病均可以使用本发明所述的组合物和方法来治疗。在一个实施方案中，向患有疾病或病症的受试者(例如患者)施用有效量的经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或表达和/或活性降低的一种或多种AP-1抑制性复合物成员的T细胞抑制T细胞衰竭(例如，与接受相同量的未经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或具有表达和/或活性降低的一种或多种AP-1抑制性复合物成员的改造的T细胞(例如CAR T细胞或包含重组TCR的T细胞)的受试者相比)。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种通过修饰T细胞以表达和/或包含升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性(例如，与未经如此修饰的对照T细胞相比)来抑制T细胞衰竭(例如，暴露于过量抗原下(例如，在治疗疾病或病症的情况下)维持T细胞的功能)的方法。在一个实施方案中，经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子(例如c-Jun)的T细胞显示出增强的功能和/或活性(例如，抗原诱导的细胞因子产生增加、杀伤能力增强(例如，对具有低表面抗原的肿瘤靶标的识别增强)、记忆细胞形成增强和/或对抗原应答的增殖增强)和/或降低的衰竭特征(例如，较低水平的指示衰竭的标志物(例如，PD-1、TIM-3、LAG-3)和/或较低水平的程序性细胞死亡)。在一些实施方案中，本申请所述的经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性的T细胞能显著增强(例如，改造的T细胞(例如，CAR T细胞)和/或未改造的天然T细胞的)临床疗效。

在某些实施方案中，本发明证明了用治疗有效量的包含经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞的组合物治疗患有癌症的受试者优于用表达正常量的一种或多种AP-1转录因子的T细胞治疗患有癌症的受试者。在一些实施方案中，用治疗有效量的包含经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞的免疫治疗组合物治疗患有癌症的动物(例如人)能抑制癌细胞的发展或生长或和/或使这些癌细胞成为更易受其他治疗(例如，癌症治疗药物或放射疗法的细胞死亡诱导活性)影响的群体。因此，本发明所述的组合物和方法可以用作单一疗法(例如，用于杀死癌细胞和/或减少或抑制癌细胞的生长、诱导癌细胞的凋亡和/或细胞周期停滞)，或当与一种或多种其他试剂如其他抗癌剂(例如，诱导细胞死亡或破坏细胞周期的癌症治疗药物或放射疗法)联合使用时，能使更大比例的癌细胞(与仅用癌症治疗药物或放射疗法治疗的动物中相应部分的细胞相比)易于被杀死、抑制癌细胞生长、诱导凋亡和/或细胞周期停滞。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了治疗或延缓患者癌症发展的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含经修饰(例如遗传修饰)以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子(例如c-Jun)和/或经修饰(例如遗传修饰)以降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员(例如JunB和BATF3以及其他BATF家族成员、IRF4和ATF家族成员)的表达和/或活性的T细胞。在某些实施方案中，所述治疗有效量的所述修饰的T细胞组合物在此类治疗后减少了所述患者体内癌细胞的数量。在某些实施方案中，所述治疗有效量的修饰的T细胞组合物在此类治疗后减少和/或消除了所述患者的肿瘤负担。在某些实施方案中，所述方法还包括对患者进行放射治疗。在某些实施方案中，在患者接受治疗有效量的经修饰的T细胞组合物之前、同时和/或之后给予放射疗法。在某些实施方案中，该方法进一步包括向患者施用一种或多种抗癌剂和/或一种或多种化学治疗剂。在某些实施方案中，在患者接受治疗有效量的修饰的T细胞组合物之前、同时和/或之后施用一种或多种抗癌剂和/或一种或多种化学治疗剂。在某些实施方案中，与单独用修饰的T细胞或抗癌药物/放射治疗的患者相比，用治疗有效量的修饰的T细胞和一个疗程的抗癌药对患者的组合治疗在这种患者中产生更大的肿瘤应答和临床益处。由于所有批准的抗癌药物和放射治疗的剂量都是已知的，因此本发明考虑了它们与修饰的T细胞的各种组合。

在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗有效量的组合物(例如，免疫治疗组合物)，所述组合物包含根据本发明进行了修饰的T细胞(例如，用于治疗或延缓受试者的癌症进展)。如本申请所述，所述组合物可进一步包含一种或多种抗癌剂，例如一种或多种化学治疗剂。本发明还提供了所述组合物用于诱导细胞周期停滞和/或凋亡的用途。本发明还涉及所述组合物用于使细胞对其他试剂(例如凋亡和/或细胞周期停滞的诱导剂)致敏的用途，以及通过在用化学治疗剂处理之前诱导细胞周期停滞来对正常细胞进行化学保护的用途。本发明所述的组合物可用于治疗、改善或预防疾病，例如任何类型的癌症或传染病，以及对诱导凋亡性细胞死亡有反应的任何细胞(例如，以细胞凋亡失调为特征的疾病，包括过度增殖性疾病如癌症)。在某些实施方案中，所述组合物可以用于治疗、改善或预防另外以对癌症疗法具有抗性为特征的癌症(例如，抗化疗、抗放射、抗激素等的癌细胞)。本发明还提供了包含所述组合物的药物组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的本发明所述经修饰的T细胞(例如，免疫治疗性组合物)。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或延缓患者癌症发展的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含经修饰(例如遗传修饰)以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子(例如c-Jun)的T细胞与治疗有效量的TCR信号传导抑制剂(例如，为了防止T细胞衰竭)的组合。某些实施方案中，所述TCR信号传导抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂。在另一个实施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂抑制Lck激酶。TCR信号传导抑制剂可以通过任何合适的给药方式给药，但是通常是口服给药。可以向受试者施用多个治疗周期。在某些实施方案中，根据标准给药方案(例如每天或间歇地)施用所述TCR信号传导抑制剂。在另一个实施方案中，施用所述TCR信号传导抑制剂足够长的时间以恢复至少部分T细胞功能，然后终止。

鉴于本申请的公开内容，本领域技术人员将容易想到本发明的这些和其他实施方案。

附图说明

图1A-B显示了在GD2-28Z衰竭的CAR T细胞中AP-1转录因子c-Fos和c-Jun被下调。

图2A-E显示了增强的AP-1表达减少了CAR T细胞中的衰竭特征。

图3A-F显示了AP-1的功能益处主要来自于c-Jun的表达。

图4A-E显示了c-Jun的双顺反子表达与CAR一起增强了CAR T的功能活性。

图5A-C显示了c-Jun的双顺反子表达与CAR一起增强了CAR T功能活性和中央记忆表型。

图6A-F显示了c-Jun的双顺反子表达与CAR一起增强了CAR T细胞促炎细胞因子的产生并降低了IL-10。

图7A-E显示了c-Jun的双顺反子表达增强了CD19和CD22 CAR T响应于具有低抗原水平的肿瘤细胞的细胞活性。

图8A-D显示了AP-1抑制性家族成员JunB和BATF3的敲除提升了衰竭的CAR T细胞中的IL2产生。(A)CRISPR基因敲除(KO)HA-28Z衰竭的CAR T细胞中的JunB大大提升了IL2(上)和IFNg(下)在暴露于GD2+细胞系Nalm6-GD2(左)、143B骨肉瘤(中)和凯利神经母细胞瘤(右)后的产生。这种增加甚至比仅过表达(OE)c-Jun还要显著。与单独的JUNB-ko相比，双重JUNB-KO和cJUN-OE T细胞未显示任何益处。(B)CRISPR基因敲除(KO)GD2-BBZ CAR T细胞中的JunB大大提升了IL2(上)和IFNg(下)在暴露于GD2+细胞系Nalm6-GD2(左)、143B骨肉瘤(中)和凯利神经母细胞瘤(右)后的产生，但是，过表达(OE)c-Jun的GD2-BBZ CAR T细胞显示出最大的功能益处。与单独的cJUN-OE相比，双重JUNB-KO和cJUN-OE T细胞未显示任何益处。(C)CRISPR基因敲除(KO)CD19-28Z(左)或CD19-BBZ(右)CAR T细胞中的JunB不影响IL2(上)在暴露于Nalm6-GD2白血病细胞后的产生，表明JunB仅在递补性信号传导/衰竭的GD2CAR T细胞中是有效的抑制剂。(D)CRISPR基因敲除(KO)HA-28Z衰竭的CAR T细胞中的BATF3提升了IL2(上)在暴露于Nalm6-GD2(左)和凯利神经母细胞瘤(右)后的产生，同时IFNγ的产生未改变。与对照或经ZB2编辑的对照相比，使用靶向BATF3的三种独立的gRNA编辑的HA-28Z衰竭的CAR T细胞均显示出IL2产生的增加。

图9A-B显示了与未经修饰的HA-GD2 CAR T细胞相比，表达c-Jun的HA-GD2 CAR T细胞显示出优异的、有疗效的体内活性。在过继转移了2×106个CAR+或模拟(未转导)的T细胞后，使用生物发光成像技术在体内追踪稳定表达萤火虫荧光素酶的Nalm6-GD2白血病细胞的生长。(A)随时间变化的定量生物发光。(B)显示单个小鼠的图像。每组n＝5只小鼠。(比例尺均为1×104-1×106，但调整了模拟d32的比例尺)。

图10显示c-Jun修饰的GD2-BBZ CAR T细胞在侵袭性143B骨肉瘤实体瘤模型中显示出优异的体内活性。在过继转移了1×10⁷个CAR+或模拟(未转导)T细胞后，使用测径仪在体内测量肌肉内植入的143B骨肉瘤瘤细胞的生长情况。(A)随时间变化的定量的肿瘤生长，每组n＝5只小鼠。

图11A-D显示了c-Jun修饰的CD19 CAR T细胞显示出针对CD19低Nalm6白血病的增强的体内活性。将3×10⁶个CAR+T细胞静脉内递送至带有CD19-低克隆F Nalm6白血病肿瘤的小鼠中。(A-B)经CD19-BBZ CAR T细胞+/-c-Jun治疗的小鼠的肿瘤生长(A)和存活(B)。c-Jun修饰的CD19-BBZ CAR T细胞显示出肿瘤生长减少和存活率显著提高。(C-D)经CD19-28ZCAR T细胞+/-c-Jun治疗的小鼠的肿瘤生长(C)和存活(D)。c-Jun修饰的CD19-28Z CAR T细胞显示出早期的肿瘤生长减慢，但CD19阴性疾病最终在两组中均生长，并且没有存活益处(p>0.05)。

图12A-J显示HA-28z CAR T细胞表现出T细胞衰竭的表型、功能、转录和表观遗传学标志。a)在原代扩增培养过程中，HA-28z与CD19-28z CAR T细胞相比扩增减少。D0＝珠粒激活，D2＝转导。误差条(error bar)代表来自n＝10个供体的平均值±SEM。b)衰竭相关标志物的表面表达(D10)。c)CD19-28z主要包括T干细胞记忆(CD45RA+CD62L+)和中枢记忆细胞(CD45RA-CD62L+，而HA-28z主要包括CD45RA–CD62L–效应记忆细胞(D10)。d)与CD19+GD2+Nalm6-GD2白血病细胞共培养24小时后，IL-2(左)和IFNg(右)的释放。误差条代表一式三份孔的平均值±SD。各试验显示一个代表性供体。e)在培养的第7、10和14天时，初始的和CM衍生的CD19或HA CAR T细胞的整体转录谱的主成分分析(PCA)。PC1(39.3％变化幅度)将CD19与HA CAR T细胞分离开来。f)驱动PC1的前200个基因的基因表达。以上列出了各个簇中的目标基因。g)CD8+CD19和HA-28z CAR T细胞(D10)中的差异可及性染色质区域。各CAR都整合了N和CM亚类。h)CD19或HA-28z CAR T细胞(D10)中ATAC-seq染色质可及性的PCA。PC1(76.9％变化幅度)将CD19与HA CAR样品分离开来。i)亚类来源的CD19和HA-28z CAR T细胞(D10)的整体染色质可及性谱。前5000个差异可达区域(峰值)。j)CD19和HA CAR T细胞中CTLA4(上图)或IL7R(下图)基因座中的差异可及性增强子区域。N–初始，CM–中央记忆。*p<.05，**p<.01，***p<.001。ns p>.05。

图13A-E显示了在衰竭的CAR T细胞中的AP-1家族特征。a)通过chromVAR分析，第10天的HA与表达CD19-CAR的T细胞相比时的前25个转录因子基序偏离得分显示，CD4+和CD8+T细胞中有许多AP-1(bZIP)家族成员来源于N或CM亚类(D10)。b)N CD8+HA-28z CAR T细胞中的TF基序富集分析表明，AP-1(bZIP)家族基序最富集。c)CD19和HA-28z CAR T细胞中指定的AP-1(bZIP)和IRF家族成员的批量RNA序列表达(FPKM)。误差条代表3个供体间的n＝6个样品的平均值±SEM，显示了每个基因的成对的CD19与HA表达。使用Wilcoxon配对符号秩检验法生成p值。d)裂解CD19-28z和HA-28z CAR T细胞，并通过蛋白质印迹评估指定的AP-1家族蛋白的表达。在培养的第7、10和14天，证实了与CD19 CAR T细胞相比，HA-28z CAR T细胞中JunB、BATF3和IRF4的蛋白表达增加。e)使用单细胞RNA-seq分析得到的在N来源的CD8+(左)和CD4+(右)GD2-28z CAR T细胞中衰竭相关转录因子的相关性网络。被DESeq2识别为差异表达(p<0.05)的转录因子基因形成网络的节点。颜色代表log2倍数变化(FC)(GD2与CD19 CAR比较)。边缘厚度代表细胞间相关基因对之间表达相关性的大小。相关得分>0.1用于构建网络。*p<.05，**p<.01，***p<.001。ns p>.05。

图14A-K显示c-Jun的过表达增强了衰竭的CAR T细胞的功能。a)JUN-P2A-CAR表达载体的示意图。b)显示对照和JUN修饰的CAR T细胞(D10)中总c-Jun表达的细胞内流式细胞术。c)对照和JUN修饰的CD19和HA CAR T细胞(D10)中总c-Jun和磷酸-c-JunSer73的蛋白质印迹。对照(蓝色)或JUN修饰的(红色)CD19和HA CAR T细胞共培养24小时后，在响应抗原+肿瘤细胞时的(d)IL-2和(e)IFNg的产生。误差条代表一式三份孔的平均值±SD。显示了来自一个代表性供体的数据。多个供体中JUN与对照CAR T细胞相比IL-2或IFNg产量的增加倍数可见于图24。f)左：显示对照与JUN-CAR T细胞(D10)对比的代表性CD45RA/CD62L表达的流式细胞术图。右：在CD4+(上)或CD8+(下)的对照或JUN-HA-28z CAR T细胞中的效应子(E，RA+62L-)、干细胞记忆(SCM，RA+62L+)、中央记忆(RA-62L+)和效应子记忆(RA-62L-)的相对频率。来自独立实验的n＝6个供体。线表示来自同一供体的配对样品。进行了配对双尾t检验。g)在培养的第39天，将图24c中的1x106个活T细胞重新接种并在有或没有IL-2的条件下培养7天。h-j)在第46天来自(g)的对照或JUN-CD19-28z CAR T细胞的细胞表面表型。h)CD4与CD8表达对比。i)晚期扩增的CD8+JUN修饰的CD19-28z CAR T细胞具有干细胞记忆表型(CD45RA+CD62L+)。j)与对照相比，晚期扩增的CD8+JUN修饰的CD19-28z CAR T细胞具有降低的衰竭标志物表达。k)将来自g的T细胞在D10时冷冻保存、解冻并在IL-2中过夜。通过向健康的NSG小鼠静脉内注射5x10⁶个对照或JUN修饰的CD19-28z或CD19-BBz CAR T细胞。输注后第25天，通过流式细胞术定量外周血T细胞数量。误差条代表每组n＝5只小鼠的平均值±SEM。*p<.05，**p<.01，***p<.001。ns p>.05。HTM–铰链/跨膜。ICD–细胞内结构域。

图15A-J显示了对衰竭的HA-28z CAR T细胞的功能性挽救需要在慢性和急性T细胞刺激期间都存在c-Jun，并且独立于JNP。a)提出的c-Jun介导的T细胞衰竭修复的机制。AP-1-i表示AP-1抑制性复合物。b)DD调节的JUN表达载体的示意图。c)药物诱导的JUN-DD表达稳定的示意图。黄色方块–TMP稳定分子。d)通过细胞内流式细胞术(左)和蛋白质印迹(右)检测的在对照、JUN-WT和JUN-DD HA-28z CAR T细胞(D10)中的总c-Jun表达。e)在用Nalm6-GD2或143B靶细胞或单独用培养基(基线)(D10)刺激后24小时，在对照、JUN-WT或JUN-DD(OFF，ON)修饰的HA-28z CAR T细胞中IL-2(左)和IFNg(右)的产生。在d-e)中，OFF表示没有TMP，ON表示从D4开始以及在共培养期间，在存在10uM TMP的条件下培养的T细胞。在f-g)中，在T细胞扩增期间(从D4开始)加入TMF，或者仅在与肿瘤细胞共培养期间加入TMF，如f中所示。对于ON-OFF和OFF-ON条件，在共培养前18小时除去/添加TMP以确保分别在暴露于抗原之前分别进行了完全的c-Jun降解/稳定。g)IL-2在一个代表性供体中的表达(左，一式三份孔的SD)和IL-2的倍数增加(相对于OFF-OFF条件，代表3个不同供体的n＝6次独立实验的SEM)。h-j)JUN-CAR T细胞的增强的功能活性独立于Jun N末端磷酸化(JNP)。h)c-Jun蛋白示意图，其显示了N末端反式激活结构域(TAD)。星号表示在JUN-AA突变体中突变为丙氨酸的Ser63和Ser73处的JNP位点。i)对照、JUN-WT和JUN-AA HA-28z CAR T细胞中总c-Jun和c-Jun-PSer73的蛋白质印迹。j)用Nalm6-GD2或143B靶细胞或单独用培养基(基线)刺激24小时后，对照、JUN-WT和JUN-AA HA-28z CAR T细胞中IL-2(左)和IFNg(右)的释放。误差条代表一式三份孔的平均值±SD。代表3个独立实验。*p<.05，**p<.01，***p<.001。ns p>.05。HTM–铰链/跨膜，ICD–细胞内结构域，DD–来自大肠杆菌DHFR的去稳定结构域，TMP–甲氧苄啶，WT–野生型。

图16A-H显示了JUN修饰的CAR T细胞提升了针对白血病和实体瘤的体内活性。在a-c中，通过静脉注射将1x Nalm6-GD2白血病细胞接种给NSG小鼠。在d3时静脉注射3x106个模拟、HA-28z或JUN-HA-28z CAR+T细胞。使用生物发光成像监测肿瘤进展(a-b)。将所有时间点的标尺基准化。c)JUN-HA-28z CAR T细胞诱导了长期无瘤生存。误差条代表n＝5只小鼠/组的平均值±SEM。这个发现在>3个独立实验中可重现，但是，在某些实验中，由于GD2(-)Nalm6克隆的过度生长，长期生存期降低。d)JUN-Her2-BBz逆转录病毒载体构建体的示意图。e)在1:8的E:T比率时，Her2-BBz CAR T细胞对GFP+Nalm6-Her2靶细胞的裂解。误差条代表一式三份孔(triplicate wells)的平均值±SD。代表2个独立实验。在f-h中，通过肌内注射向NSG小鼠接种1x106个143b-19骨肉瘤细胞。在d7时静脉注射1x107个模拟、Her2-BBz或JUN-Her2-BBz CAR T细胞。f)通过卡尺测量监测肿瘤的生长。g)经JUN-Her2-BBz CAR T细胞治疗的小鼠保持长期无瘤生存。h)在肿瘤细胞植入后第20天，对如f中所述进行处理的小鼠中的外周血T细胞进行定量。误差条代表n＝5只小鼠/组的平均值±SEM。代表具有相似结果的2个独立实验。*p<.05，**p<.01，***p<.001。HTM–铰链/跨膜。ICD–细胞内结构域。

图17A-I显示了在次优刺激下，JUN-CAR T细胞增强T细胞功能。用固定的1A7抗CAR独特型抗体刺激对照或JUN修饰的HA-28z CAR T细胞24小时后a)IL-2和b)IFNg的产生。每条曲线均用非线性剂量应答动力学进行了拟合，以确定EC50。右侧较小的图显示了抗体浓度为0-1ug/mL的曲线。c)JUN-CD22-BBz逆转录病毒载体构建体的载体示意图。d)CD22在亲代Nalm6、Nalm6-22KO和Nalm6-22KO+CD22low上的表面表达。e)在暴露于Nalm6和Nalm6-22low的对照或JUN CD22-BBz CAR T细胞共培养后，IL-2(左)和IFNg(右)的释放。误差条代表一式三份孔的平均值±SD。代表3次独立实验。在f-i)中，在第0天用1x106个Nalm6-22low白血病细胞接种NSG小鼠。在第4天，以静脉内的方式转移3x106个对照或JUN-CD22-BBz CAR+T细胞或3x106个转导了模拟物的T细胞。通过生物发光成像(f)用图像(i)监测肿瘤的生长。g)在第23天，接受JUN-22BBz CAR T细胞的小鼠显示出增加的外周血T细胞。h)JUN的表达显著改善了CAR治疗小鼠的长期存活。在f-g中，误差条代表每组n＝5只小鼠的平均值±SEM。代表具有相似结果的2次独立实验。*p<.05，**p<.01，***p<.001。HTM–铰链/跨膜。ICD–细胞内结构域。

图18A-G显示高亲和力(HA)14g2a-GD2E101K CAR T细胞与原始14g2a-GD2 CAR相比表现出扩大的衰竭特征。a)在培养的第10天，CD19、GD2和HA-GD2E101K CAR T细胞中的表面抑制性受体的表达。与亲本GD2 CAR相比，高亲和力E101K突变导致CD4+和CD8+CAR T细胞中抑制性受体表达增加。b)在HA-GD2E101K或原始GD2-28z CAR T细胞与GD2+靶细胞共培养24小时后的IL-2分泌。HA-GD2E101K CAR T细胞的衰竭状况增加与功能活性降低相对应，这是通过刺激后产生IL-2的能力来测量的。误差条代表一式三份孔的平均值±SD。代表具有相似结果的至少4次独立实验。c)批量RNA-seq的PCA显示，HA-GD2E101K和CD19 CAR T细胞之间存在较大差异，而GD2-28z(sh)CAR T细胞处于中间位置。左侧–CD4+T细胞。右侧–初始来源的CD8+CAR T细胞。d-e)HA-GD2E101K CAR的表达导致CD4+CAR T细胞中抑制性受体的表达增强(d)和记忆形成减少(e)。(CD8+的数据在图12中)。f)来自图12e的RNA-seq PCA显示，PC2的分离是由CM相对于N的对比驱动的，而PC3的分离是由CD4相对于CD8的对比驱动的。g)GSEA：与CD19-28z CAR T细胞对比时，在第10天的HA-28z CAR T细胞中上调的基因组显示出与慢性病毒感染小鼠模型中衰竭的和记忆的CD8+比较(左)、衰竭的和效应性的CD8+比较(中)、以及衰竭的和初始的CD8+比较(右)中上调的基因(Wherry et al.Immunity,2007)显著重叠。*p<.05，**p<.01，***p<.001。PCA–主成分分析，NES–基准化富集得分。

图19A-C显示了GD2-28z CAR T细胞在单细胞水平上显示出衰竭特征。a)Venn图显示了单细胞数据(红色)的差异表达分析中的和驱动批量RNA-seq中CD19和HA-28z CAR T细胞分离的前200个基因的重叠基因。通过DESeq2分析，在GD2-28z与CD19-28z单细胞中，来自批量RNA-seq的前200个基因中有79个有差异表达。交叉部分的突出基因包括抑制性受体(CTLA4、LAG3、GITR、效应分子CD25、IFNG、GZMB和细胞因子IL13和IL1A以及AP-1/bZIP家族转录因子BATF3和IRF4。b)聚类了GD2-28z与CD19-28z单细胞转录组分析中的前50个差异表达基因的热图。每行代表一个细胞。c)描绘CD8+GD2-28z和CD19-28z单CAR T细胞中单个基因表达的小提琴图(Violin plot)。在GD2 CAR T细胞中上调的基因包括抑制性受体、效应分子和AP-1家族转录因子，而CD19 CAR T细胞具有表达升高的记忆相关基因。使用非配对双尾Wilcoxon-Mann-Whitney U检验计算在各个图上呈现的每个基因的P值。

图20A-D显示了ATAC-seq数据的质量控制。a)***长度b)对于组合样本(上)和单个样本(下)，距转录起始位点(TSS)的***距离。c)重复样品之间的相关性。d)通过峰总数(上)和总的频率(下)确定的各样品中映射峰的位置。

图21A-D显示AP-1家族包含在HA-28z衰竭的CAR T细胞中最显著富集的转录因子基序。a)CD4+CD19和HA CAR T细胞(D10)中差异可及的染色质区域。各CAR都整合了N和CM亚类。b)图1h中的PCA显示PC2的分离是由CM相对于N的对比驱动的，而PC3的分离是由CD4相对于CD8的对比驱动的。c)在HA-28z CAR T细胞中差异性可及的染色质区域中的最为富集的转录因子基序包含所有起始T细胞亚群中的AP-1/bZIP家族因子。CD8+初始亚类示于图2中。d)通过各簇中的共享调控基序(左)和转录因子基序的富集热图(右)对峰进行聚类。10个不同的簇，包括与衰竭的(EX1-EX4)或健康的(HLT1-HLT2)CAR T细胞、CM(CM)或N(初始)起始亚类、以及CD4或CD8 T细胞亚类相关的簇。各个簇中的目的基因在右侧突出显示。(N–初始，CM–中央记忆)。

图22A-C显示AP-1/bZIP家族转录因子在HA-28z CAR T细胞中被上调并形成免疫调节复合物。a)根据图2的RNA测序数据，指定的AP-1/bZIP和IRF家族基因的基因表达的倍数变化(HA/CD19)。误差条代表3个独立供体中n＝6个样品的平均值±SEM。b)通过对蛋白质印迹的光密度分析确定指定的AP-1/bZIP和IRF家族蛋白的蛋白质表达倍数变化(HA/CD19)。误差条代表3个独立供体中n＝6次实验的平均值±SEM。*p<.05，**p<.01，***p<.001。c)在输入(左列)或对c-Jun(中列)或JunB(右列)免疫沉淀后，CD19和HA-28z CAR T细胞中指定的AP-1/bZIP和IRF家族成员蛋白的蛋白质印迹分析。下面的数字代表在每种条件下HA与CD19相比的蛋白质表达增加倍数，彩色形状按大小比例代表所鉴定的复合物。IP-蛋白质印迹证明，HA-28z CAR T细胞中存在的c-Jun/JunB、c-Jun/IRF4、c-Jun/BATF和c-Jun/BATF3复合物增多。IRF4结合的比率也与JunB结合的比率类似，而BATF和BATF3显示优先与JunB形成复合物。

图23A-E显示AP1修饰的CAR T细胞的活性增强取决于c-Jun而不是c-Fos。a-c)将CAR T细胞与(AP1)或者不与(对照)同时编码AP1转录因子Fos及Jun和截短的NGFR(tNGFR)表面选择标志物的慢病毒载体共转导。a)慢病毒构建体示意图。b)通过指定的CD4+和CD8+CAR T细胞中NGFR的表面表达而测定的AP1修饰的CAR T细胞的代表性转导效率。c)用143B-19靶细胞刺激24小时后，在对照或AP1修饰的CAR T细胞中的IL-2的产生。与对照CAR T细胞相比，AP1修饰的HA-28z CAR T细胞显示出IL-2产生增加。代表具有相似结果的2次独立实验。d-e)将CAR T细胞与编码AP1转录因子Fos或Jun和截短的NGFR(tNGFR)表面选择标志物的慢病毒载体共转导。d)Fos和Jun慢病毒构建体的示意图。e)用Nalm6-GD2靶细胞刺激24小时后，在对照、Fos或Jun修饰的CAR T细胞中IL-2的产生。误差条代表一式三份孔的平均值±SD。代表具有相似结果的2次独立实验。在a和d中，*表示终止密码子。*p<.05，**p<.01，***p<.001，ns p>0.05。

图24A-C显示了JUN修饰的CAR T细胞的扩展功能评估。a-b)与指定的靶细胞共培养24小时后，在JUN与对照CD19和HA-28z CAR T细胞中IL-2(a)和IFNg(b)释放的倍数增加。每个点代表来自不同供体的一次独立实验。c)在具有3个不同的健康供体的3个独立实验中，对照或JUN修饰的CAR T细胞在体外的扩展扩增。在指定的时间点，将T细胞重新接种在新鲜的T细胞培养基+100IU/mL IL2中。计数并培养T细胞以使细胞保持在每2-3天有0.5x106/mL。对于供体-1，在第14和28天重新铺板5x106个活的T细胞。对于供体-2，在第14、28、42和56天重新铺板5x106个活的T细胞。对于供体-3，在第10、17、24和31天重新铺板5x106个活的T细胞。

图25A-E显示c-Jun的过表达降低了抑制性AP-1家族成员JunB、BATF和BATF3的普遍性和复合性。a)通过蛋白质印迹评估的JUN-DD CAR T细胞中药物诱导的c-Jun稳定性的动力学。在时间0，将10uM TMP加入未处理的细胞中(ON)或从先前处理的细胞中洗出(OFF)。在1、2、4、8、24和48小时从每种条件下取出细胞，并准备用于蛋白质印迹以分析c-Jun的表达。观察到的条带对应于JUN-DD的大小。b)对来自(a)的印迹进行光密度分析，并对上样对照进行基准化。将表达相对于时间作图，并且将一级动力学曲线与数据拟合以确定OFF和ON动力学的t1/2。c)对对照和JUN-CAR T细胞(D10)中的指定的AP-1/bZIP和IRF家族成员蛋白进行蛋白质印迹分析。下面的数字代表与CD19相比蛋白质表达的倍数变化。d)与HA-28z相比，JUN-HA-28z CAR T细胞中BATF、BATF3和JUNB的mRNA表达相应降低。n＝3个供体，对CD19mRNA进行了基准化。e)IP-蛋白质印迹分析显示，c-Jun的过表达降低了抑制性JunB/BATF和JunB/BATF3复合物。对照或JUN-HA-28z CAR T细胞中的输入(左列)、c-Jun(中列)或JunB(右列)的免疫沉淀。IRF4的蛋白、mRNA以及与c-Jun的复合未改变。

图26A-E显示了JUN-CAR T细胞增强实体瘤中的GD2-BBz CAR T细胞功能。a)JUN-GD2-BBz逆转录病毒载体构建体的载体示意图。b)用Nalm6-GD2或143B靶细胞刺激24小时后，在JUN修饰的(红色)或对照(蓝色)的GD2-BBz CAR T细胞中IL-2(左)和IFNg(右)的产生。c)在1:1(左)或1:4(右)的E:T比率时，GD2-BBz CAR T细胞对GFP+Nalm6-GD2靶细胞的裂解。在a-c中，误差条代表一式三份孔的平均值±SD。代表至少3次独立实验。在d-e中，通过肌肉注射将0.5x106个143B-19骨肉瘤细胞接种到NSG小鼠中。在第3天静脉注射1x107个模拟、GD2-BBz或JUN-GD2-BBz CAR T细胞。d)通过卡尺测量监测肿瘤的生长。e)肿瘤植入后第14天的外周血CD4+(上)或CD8+(下)T细胞计数。误差条代表每组n＝5只小鼠的平均值±SEM。代表2次独立实验，但是由于早期死亡(与肿瘤大小无关)，这两个模型中都没有生存曲线。*p<.05，**p<.01，***p<.001。HTM–铰链/跨膜。ICD–细胞内结构域。

图27A-E显示了c-Jun的N末端突变能够挽救衰竭的HA-28z CAR T细胞。a)将不同的c-Jun突变克隆到HA-28z CAR T细胞载体中。b)与GD2+143B骨肉瘤靶细胞共培养24小时后，IL-2(上)和IFNg(下)的分泌情况。c)在5天内以1:1、1:2或1:4的效应细胞：靶细胞(E:T)比率测量了GFP+Nalm6-GD2或143B靶细胞的体外裂解。在低E:T比率和较晚的时间点时，与JUN-De、JUN-Dbasic、JUN-DLeu和JUN-DbZIP CAR T细胞相比，JUN-WT、JUN-AA、JUN-Dd和JUN-DTAD表现出更好的肿瘤生长控制能力。d)用Nalm6-GD2刺激5小时后，通过细胞内细胞因子染色和流式细胞术，在CD4+和CD8+HA-28z CAR T细胞中都证实了细胞因子产生的增加。e)在将T细胞输注到携带Nalm6-GD2白血病的NSG小鼠中后12天，对外周T细胞数进行定量。

图28显示了IRF4的敲除显著提升了衰竭的HA-28z CAR T细胞的功能活性。

图29A-C显示转录突变体(JUN-AA)也挽救了CD19 CAR T细胞中的功能活性和增殖能力。

图30显示c-Jun修饰的HA-28z CAR T细胞的体内功能增强不能通过离体提供IL-2来重复。

图31A-E显示c-Jun在抑制性实体瘤微环境中增强了Her2-BBz CAR T细胞活性。

图32显示c-Jun的过表达提升了对衰竭性HA-28z CAR T细胞的TGFβ介导的抑制的抗性。

图33A-D显示c-Jun修饰的细胞中的转录变化与衰竭减少和记忆形成增加一致。

定义

出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。如果以下列出的任何定义与通过引用并入本申请的任何文件相冲突，则以以下列出的定义为准。

如本申请所用，除非另有说明，否则术语“疾病”和“病理状况”可互换使用，以描述偏离于被认为是物种或群体成员(例如人)的正常或平均状况的状况，并且所述偏离在对该物种或种群的大多数个体无害的条件下，对受影响的个体有害。这种偏离可能表现为与对正常受试者的正常状态的任何损害或干扰或改变正常功能的执行的任何器官或组织的损害相关的状态、体征和/或症状(例如腹泻、恶心、发烧、疼痛、水泡、烫伤、皮疹、免疫抑制、炎症等)。疾病或病理状况可能是由与微生物(例如，病原体或其他感染性因子(例如，病毒或细菌))的接触引起或导致的，可能会对环境因素(例如，营养不良、工业危害和/或气候)产生应答，可能会对生物体的固有或潜在缺陷(例如遗传异常)或这些因素和其他因素的组合产生应答。

术语“宿主”、“受试者”或“患者”在本申请可互换使用，是指要通过本发明所述的组合物和方法治疗(例如给药)的个体。受试者包括，但不限于，哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、猴子、马、牛、猪、狗、猫等)。在本发明的上下文中，术语“受试者”通常是指将被施用或已经被施用一种或多种本发明所述组合物(例如，本申请所述的经修饰或改造的(例如，遗传上改造的)T细胞)的个体。

“T细胞衰竭”是指T细胞功能丧失，其可能由于感染(例如，慢性感染)或疾病导致发生。T细胞衰竭与PD-1、TIM-3和LAG-3的表达增加、细胞凋亡以及细胞因子分泌减少有关。因此，术语“减轻T细胞衰竭”、“抑制T细胞衰竭”、“减少T细胞衰竭”等是指以以下一种或多种为特征的T细胞功能恢复的状态：PD-1、TIM-3和LAG-3中的一种或多种的表达和/或水平降低；记忆细胞形成增加和/或记忆标记物(例如CD62L)的维持；预防细胞凋亡；抗原诱导的细胞因子(例如IL-2)产生和/或分泌增加；增强的杀伤能力；对具有低表面抗原的肿瘤靶标的识别增强；应对抗原时的增殖增强。

术语“缓冲液”或“缓冲剂”是指当被添加到溶液中时引起溶液抵抗pH变化的材料。

如本申请所用，术语“癌症”和“肿瘤”是指包含丧失控制生长和增殖能力的细胞的组织或生长。癌细胞和肿瘤细胞通常以失去接触抑制为特征，可能是侵袭性的，并且可能表现出转移的能力(例如，它们已经失去了粘附至其他细胞/组织的能力)。本发明不受癌症类型或治疗类型(例如，预防性和/或治疗性治疗)的限制。事实上，可用本申请所述的组合物和方法可治疗多种癌症，包括但不限于，脑癌或中枢神经系统的其他癌症、黑色素瘤、淋巴瘤、骨癌、上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、黑色素瘤、肾癌、***癌、肉瘤、癌(carcinomas)、和/或其组合。

如本申请所用，“转移”是指癌症从起源部位扩散或转移到身体的其他区域同时在新位置处发展出类似癌性病变的过程。“转移性”或“转移”细胞是失去与相邻细胞的粘附性接触，并通过血液或淋巴从疾病的主要部位迁移以侵入机体其他部位的组织的细胞。

如本申请所用，术语“抗癌剂”是指用于治疗过度增生性疾病如癌症(例如，在哺乳动物如人中)的任何治疗剂(例如，化学治疗化合物和/或分子治疗化合物)、反义疗法、放射疗法等。

“有效量”是指药物组合物、抗癌剂或其他药物有效达到所需的治疗或预防效果(例如缓解所治疗的疾病的某些或全部症状)时所需的剂量和时间段条件下的量。

如本申请所用，术语“治疗有效量”是指足以导致改善一种或多种疾病症状，或预防疾病进展或引起疾病消退的治疗剂的量。例如，关于癌症的治疗，在一个实施方案中，治疗有效量是指降低肿瘤生长速率(例如，减轻和/或消除患者的肿瘤负担)、减少肿瘤质量、减少转移数量、减少肿瘤进展或使生存时间延长至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的治疗剂的量。

如本申请所用，术语“致敏”和“敏化”是指通过施用第一试剂使动物或动物内的细胞对第二试剂的生物学效应(促进或延缓细胞功能的一个方面，包括但不限于，细胞***、细胞生长、增殖、侵袭、血管生成、坏死或凋亡)更易感，或更具应答性。可以将第一试剂对靶细胞的敏化作用测定为在施用或不施用所述第一试剂的条件下施用第二试剂时观察到的预期生物学效应(促进或延缓细胞功能的一个方面，包括但不限于，细胞生长、增殖、侵袭、血管生成或凋亡)的差异。敏化细胞的应答可以比在不存在第一试剂的条件下的应答增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％或至少约500％。

如本申请所用，术语“纯化的”或“纯化”是指从样品或组合物中去除污染物或不想要的化合物。如本申请所用，术语“基本上纯化的”是指从样品或组合物中去除约70-90％，最高达100％的污染物或不想要的化合物。

如本申请所用，术语“给药”和“施用”是指将组合物施用给受试者的动作。对人体的示例性施用途径包括，但不限于，通过眼睛(眼内)、口腔(口服)、皮肤(经皮)、鼻(鼻腔)、肺(吸入)、口腔粘膜(口腔片)、耳、直肠施用、通过注射(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肿瘤内等)施用、局部施用等。在一个实施方案中，本发明所述T细胞的施用经由静脉内输注进行。

如本申请所用，术语“共同给药”和“共同施用”是指将至少两种试剂(例如，遗传修饰的免疫细胞和一种或多种其他试剂如抗癌剂)或疗法施用给受试者。在一些实施方案中，两种或更多种试剂或疗法的共同给药是同步的。在其他实施方案中，第一试剂/疗法在第二试剂/疗法之前施用。在一些实施方案中，共同给药可以经由相同或不同的给药途径。本领域技术人员应当理解，所使用的各种试剂或疗法的制剂和/或给药途径可以变化。本领域技术人员容易确定共同给药的合适剂量。在一些实施方案中，当共同施用试剂或疗法时，所述试剂或疗法各自以比适用于其单独给药的剂量更低的剂量施用。因此，在试剂或疗法的共同施用能降低潜在有害(例如，有毒的)药剂的必需剂量，和/或两种或多种试剂的共同施用导致受试者对所述试剂中的一种的有益效应由于另一种试剂的共同给药而敏化的实施方案中，特别优选共同施用。

如本申请所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当被施用于受试者时基本上不产生不良反应(例如，毒性、***性或其他免疫学反应)的组合物。

如本申请所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准的药物载体，包括但不限于，磷酸盐缓冲盐溶液、水和各种类型的润湿剂(例如月桂基硫酸钠)，任何以及全部的溶剂、分散介质、包被剂、月桂基硫酸钠、等渗和吸收延迟剂、崩解剂(例如马铃薯淀粉或甲淀粉钠)、聚乙二醇等。该组合物还可包含稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的实例已被描述并且是本领域已知的(参见，例如，Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences,15th Ed.,Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(1975)，其通过引用并入本申请)。

如本申请所用，术语“药学上可接受的盐”是指在目标受试者中生理耐受的本发明所述组合物的任何盐(例如，通过与酸或碱反应获得的盐)。本发明所述组合物的“盐”可以衍生自无机或有机酸和碱。酸的实例包括但不限于，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-对磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘2-磺酸、苯磺酸等。其他酸，例如草酸，虽然其本身不是药学上可接受的，但是可用于制备用作中间体以获得本发明所述组合物的盐及其药学上可接受的酸加成盐。碱的实例包括，但不限于，碱金属(例如钠)的氢氧化物、碱土金属(例如镁)的氢氧化物、氨以及化学式NW4+的化合物(其中W为C 1-4烷基)等。

盐的实例包括，但不限于：乙酸盐、己二酸、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、氟庚烷酸盐、六氟乙酸盐、二硫酸硫酸盐、半硫酸盐、半硫酸盐、羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一碳酸盐等。盐的其他实例包括与合适的阳离子例如Na+、NH4+和NW4+(其中W为C1-4烷基)等复合的本发明所述化合物的阴离子。对于治疗用途，本发明所述化合物的盐被认为是药学上可接受的。但是，非药学上可接受的酸和碱的盐也可用于，例如，制备或纯化药学上可接受的化合物。

对于治疗用途，本发明所述组合物的盐被认为是药学上可接受的。但是，非药学上可接受的酸和碱的盐也可以用于，例如，制备或纯化药学上可接受的组合物。

如本申请所用，术语“具有疾病风险”是指易患特定疾病(例如，传染病)的受试者。该易感性可能是遗传的(例如，经历疾病的特定遗传趋势，例如遗传性疾病)，或者是由其他因素(例如，环境条件，暴露于环境中存在的有害化合物等)引起的。因此，无意于将本发明限制于任何特定风险(例如，受试者仅仅通过暴露于他人并与他人互动就可能“处于疾病风险中”)，也无意于将本发明限制于任何特定疾病(例如癌症)。

如本申请所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。在免疫治疗剂的情况下，这样的递送系统包括允许将免疫原性试剂和/或支持材料(例如，关于使用材料的书面说明等)进行存储、运输或从一个位置递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包括一个或多个包含相关免疫治疗剂(例如，修饰的T细胞和/或支持材料)的外壳(例如，盒子)。如本申请所用，术语“单独的试剂盒”是指包含两个或更多个单独的容器的递送系统，每个容器包含全部试剂盒组分的一部分。容器可以一起或分开地递送给预期的接收者。例如，第一容器可容纳包含用于特定用途的免疫治疗组合物的组合物，而第二容器可容纳第二试剂(例如化学治疗剂)。事实上，术语“单独的试剂盒”中包括任何包含两个或更多个单独容器的输送系统，每个容器包含全部试剂盒组分的一部分。相反，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳各个所需组件的单个盒子中)包含特定用途所需的所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括单独的和组合的试剂盒。

如本申请所用，术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指结合特定抗原上的一个或多个表位的蛋白质。免疫球蛋白包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，以及以下类别的Fab片段和F(ab')₂片段：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和分泌的免疫球蛋白(sIg)。免疫球蛋白通常包含两条相同的重链和两条轻链。但是，术语“抗体”和“免疫球蛋白”也涵盖单链抗体和双链抗体。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体变化最大的部分并包含抗原结合位点。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，所述多肽接头使得scFv能够形成用于结合抗原的结构。有关scFv的综述，请参见例如Pluckthun,in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York,1994),pp 269-315。

如本申请所用，术语“抗原结合蛋白”是指与特定抗原结合的蛋白质。“抗原结合蛋白”包括，但不限于，免疫球蛋白，包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体；Fab片段，F(ab')2片段和Fab表达文库；和单链抗体。

如本申请所用，术语“表位”(epitope)是指抗原中与特定免疫球蛋白接触的部分。

当涉及抗体(或其部分(例如，scFv))和蛋白质或肽的相互作用时而使用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指所述相互作用取决于蛋白质上存在特定的序列或结构(例如，抗原决定簇或表位)；换句话说，抗体(或其部分(例如，scFv))识别并结合至特定的蛋白质序列或结构，而非笼统的蛋白质。例如，如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A(或游离的，未标记的A)的蛋白质的存在将减少标记的A与所述抗体结合的量。

如本申请所用，当涉及抗体与蛋白质或肽的相互作用时而使用的术语“非特异性结合”和“背景结合”是指不依赖于特定结构的存在的相互作用(即，抗体笼统地结合蛋白质，而不是结合特定的结构，例如表位)。

如本申请所用，术语“疑似患有癌症的受试者”是指表现出一种或多种指示癌症的症状(例如，明显的包块或肿块)或正在筛查癌症(例如，在常规体检期间)的受试者。疑似患有癌症的受试者还可能具有一种或多种发展为癌症的风险因素。疑似患有癌症的受试者通常没有进行癌症测试。但是，“疑似患有癌症的受试者”包括已接受初步诊断(例如，CT扫描显示有肿块)但尚未进行确认检查(例如，活检和/或组织学检查)或者其癌症的类型和/或阶段未知的个人。该术语还包括先前患有癌症的人(例如，缓解阶段的个体)。“疑似患有癌症的受试者”有时被诊断为癌症，有时被发现没有癌症。

如本申请所用，术语“被诊断患有癌症的受试者”是指已经做过了测试并发现具有癌细胞的受试者。可以用任何合适的方法来诊断癌症，包括但不限于，活检、X射线、血液测试等。

如本申请所用，术语“手术后肿瘤组织”是指已经从受试者(例如，在手术期间)去除的癌组织(例如，器官组织)。

如本申请所用，术语“处于癌症风险中的受试者”是指具有一种或多种发展为特定癌症的风险因素的受试者。风险因素包括，但不限于，性别、年龄、遗传易感性、环境暴露以及先前的癌症发生、原有的非癌症疾病和生活方式。

如本申请所用，术语“表征受试者的癌症”是指鉴定受试者中癌症样品的一种或多种性质，包括但不限于，良性、癌前或癌性组织的存在以及癌症阶段。

如本申请所用，术语“表征受试者的组织”是指鉴定组织样品的一种或多种性质(例如，包括但不限于，癌性组织的存在、可能会癌变的癌前组织的存在、以及可能转移的癌组织的存在)。

如本申请所用，术语“癌症阶段”是指对癌症进展水平的定性或定量评估。用于确定癌症阶段的标准包括，但不限于，肿瘤的大小、肿瘤是否扩散到身体的其他部位以及癌症扩散的部位(例如，在同一个器官或身体部位或到另一器官)。

如本申请所用，术语“原代肿瘤细胞”是指从哺乳动物的肿瘤中分离的并且尚未在体外广泛培养的癌细胞。

如本申请所用，术语“治疗”、“治疗用途”或“医学用途”是指本发明所述组合物和方法的任何和所有用途，所述用途可纠正疾病状态或症状，或不管以什么方式预防、阻碍、延缓或逆转疾病或其他不良症状的进展。例如，本申请中的术语“癌症的治疗”或“肿瘤的治疗”或语法上的等同物是指原有癌症或肿瘤的抑制、消退、或部分或完全消失。该定义旨在包括原有癌症或肿瘤的尺寸、侵袭性或生长率的任何减小。

如本申请所用，涉及癌症的术语“改善的治疗结果”和“增强的治疗功效”是指癌细胞或实体瘤的生长减慢或减弱，或癌细胞总数或总的肿瘤负荷的减少。“改善的治疗结果”或“增强的治疗功效”是指根据任何临床可接受的标准，个体的状况有所改善，包括已形成的肿瘤的逆转、预期寿命的增加或生活质量的改善。

如本申请所用，术语“基因转移系统”是指将包含核酸序列的组合物递送至细胞或组织的任何方式。例如，基因转移系统包括但不限于，载体(例如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒和其他基于核酸的递送系统)、裸核酸的显微注射、基于聚合物的递送系统(例如，基于脂质体和基于金属颗粒的系统)、基因枪注射(biolistic injection)，基于转座酶的系统进行转导用于基因整合、Crispr/Cas9介导的基因整合、非整合载体(例如RNA或腺相关病毒)等。

如本申请所用，术语“病毒基因转移系统”是指包含病毒成分(例如，完整的病毒、修饰的病毒和病毒组分如核酸或蛋白质)的基因转移系统，以促进将样品递送至所需的细胞或组织。可用于本发明所述的组合物和方法中的病毒基因转移系统的非限制性实例为慢病毒和逆转录病毒基因转移系统。

如本申请所用，术语“位点特异性重组靶序列”是指为重组因子提供识别序列以及提供重组发生位置的核酸序列。

如本申请所用，术语“核酸分子”是指任何包含核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。该术语涵盖包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，包括但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、叠氮基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基伪尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌氨酸、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基肌氨酸、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁氧嘧啶(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、肌氨酸、2硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯和2,6-二氨基嘌呤。

如本申请所用，术语“异源基因”是指不在其天然环境中的基因。例如，异源基因包括来自被引入到另一物种的一个物种的基因。异源基因还包括对于生物体来说是天然的基因，所述基因已经以某种方式发生了改变(例如，被突变、被加入了多个拷贝、与非天然调控序列连接等)。异源基因与内源基因的区别在于，异源基因序列通常与DNA序列连接，所述DNA序列在自然状态下与染色体中的基因序列不相关，或者与不是自然存在的染色体部分相关(例如，在自然状态下不表达基因的位点处表达的基因)。包含异源基因的细胞在本申请中被描述为“修饰的”或“改造的”细胞。例如，含有异源AP-1转录因子基因(例如，异源AP-1转录因子基因表达构建体(例如，用于在T细胞中过表达AP-1转录因子))和/或异源受体基因(例如，异源T细胞受体基因表达构建体或异源嵌合抗原受体基因表达构建体)的T细胞在本申请中被描述为修饰的和/或改造的T细胞。

如本申请所用，术语“基因表达”是指通过基因的“转录”(即，通过RNA酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，以及对于编码蛋白质的基因，通过RNA的“翻译”将基因中编码的遗传信息转化为蛋白质。基因表达可以在该过程的许多阶段进行调节。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)产量的调控，而“下调”或“抑制”是指降低产量的调控。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)通常分别被称为“激活因子”和“阻遏因子”。

除了包含内含子外，基因的基因组形式还可以包括位于RNA转录子上的序列的5'和3'末端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录子的非翻译序列的5'或3')。5'侧翼区可包含调控序列，例如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3'侧翼区可包含指导转录终止、转录后切割和聚腺苷酸化的序列。

如本申请所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指脱氧核糖核苷酸沿脱氧核糖核酸链的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了多肽(蛋白质)链上氨基酸的顺序。因此，DNA序列编码氨基酸序列。

如本申请所用，术语“具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸”和“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”是指包含基因的编码区的核酸序列，或者换句话说，编码基因产物的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的(即有义链)或双链的。如果需要，可以将适当的控制元件如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等放置在基因的编码区附近，以允许适当地开启转录和/或正确加工初级RNA转录物。或者，用于本发明所述表达载体的编码区可以包含内源性增强子/启动子、剪接点、***序列、聚腺苷酸化信号等，或内源性和外源性控制元件两者的组合。

如本申请所用，术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指以产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式进行的核酸序列的连接。所述术语还指以这个方式进行的氨基酸序列的连接，使得产生功能性蛋白质。

涉及核酸时而使用的术语“分离的”，以及涉及核酸序列时而使用的术语“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中的一样，是指从在其天然来源中通常与其相关的至少一种组分或污染物中鉴别并分离出来的核酸序列。如此，分离的核酸以不同于其在天然条件下的存在形式或情形的形式或情形存在。相反，非分离的核酸是在其天然存在的状态下存在的核酸如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(例如基因)存在于宿主细胞染色体上邻近的相邻基因处；RNA序列(例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)以与许多其他编码多种蛋白质的mRNA的混合物的形式存在于细胞中。但是，编码给定蛋白质的分离的核酸包括，例如，通常表达所述给定蛋白质的细胞中的此类核酸，其中所述核酸处于与天然细胞的染色***置不同的染色***置，或者被不同于自然界中发现的核酸序列的核酸序列侧接。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸被利用来表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸将至少包含有义链或编码链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但可以同时包含有义链和反义链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。

如本申请所用，术语“天然蛋白质”表示不包含由载体序列编码的氨基酸残基的蛋白质；也就是说，天然蛋白质仅包含自然存在于蛋白质中的那些氨基酸。天然蛋白质可以通过重组方式产生，或者可以从自然产生的来源分离得到。

如本申请所用，术语“部分”在涉及蛋白质时(如在“给定蛋白质的一部分”中)是指该蛋白质的片段。片段的大小范围可以从四个氨基酸残基到整个氨基酸序列减去一个氨基酸。

如本申请所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA，其中可以连接其他DNA区段。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入有它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。可以使用慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如，将编码一种或多种AP-1转录因子和/或CAR构建体的DNA引入细胞(例如，T细胞中)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后，可以整合到所述宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这些载体在本申请中被称为“重组表达载体”，或简称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。

如本申请所用，术语“表达载体”是指重组DNA分子，其包含所需的编码序列和特定宿主生物中表达编码序列所必需的与之可操作地连接的合适的核酸序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选)和核糖体结合位点，通常与其他序列一起。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。

如本申请所用，术语“转染”是指将外源DNA引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的多种方法来完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、多聚烯介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪方法。

术语“稳定转染”或“稳定地转染”是指将外源DNA引入并整合到被转染细胞的基因组中。术语“稳定转染子”是指已将外源DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。术语“瞬时转染”或“瞬时地转染”是指将外源DNA引入细胞，在所述细胞中外源DNA不能整合到被转染细胞的基因组中。外源DNA在被转染细胞的细胞核中持续存在(例如，持续数天)。在此期间，外源DNA受到能控制染色体中内源基因表达的调节性控制。术语“瞬时转染子”是指已摄取外源DNA但未能整合该DNA的细胞。

如本申请所用，术语“可选择的标志物”是指基因的使用，所述基因编码能赋予在缺乏必需营养素的培养基中生长的能力的酶活性；另外，可选择的标志物可以在表达所述可选择的标志物的细胞上赋予对抗生素或药物的抗性。可选择的标志物可以是“显性”的；显性的可选择标志物编码能够在任何真核细胞系中检测到的酶活性。显性的可选择标志物的例子包括赋予哺乳动物细胞对药物G418的抗性的细菌氨基糖苷3'-磷酸转移酶基因(也称为neo基因)、赋予对抗生素潮霉素抗性的细菌潮霉素G磷酸转移酶(hyg)基因和赋予在霉酚酸存在的条件下生长的能力的细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(也称为gpt基因)。其他可选择的标志物并不是显性的，因为它们必须与缺乏相关酶活性的细胞系结合起来使用。非显性可选择的标志物的例子包括与tk阴性(tk-)细胞系结合使用的胸苷激酶(tk)基因、与CAD缺陷细胞结合使用的CAD基因和与hprt阴性(hprt–)细胞系结合使用的哺乳动物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因。Sambrook,J.et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(1989)pp.16.9-16.15提供了关于可选择的标志物在哺乳动物细胞系中的使用的综述。

如本申请所用，术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成，但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”是指自然环境(例如动物或细胞)以及在自然环境中发生的过程或反应。

如本申请所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。该术语包括连续细胞系(例如，具有永生的表型)、原代细胞培养物、转化的细胞系、有限的细胞系(例如，非转化的细胞)以及在体外维持的任何其他细胞群。

如本申请所用，术语“样品”以其最广的意义使用。从某种意义上说，它意味着包括从任何来源，以及生物学和环境样品获得的样本或培养物。生物样品可以从动物(包括人)获得且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，例如血浆、血清等。然而，这些实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。

具体实施方式

本发明基于以下发现：经修饰(例如，遗传修饰)以过表达和/或包含升高(例如，超过生理学)水平的一种或多种AP-1转录因子(例如，c-Jun)的T细胞显示出降低的T细胞衰竭水平(例如，与表达正常水平的AP-1转录因子的未修饰T细胞相比)。如本申请中的详细描述，AP-1转录因子fos和c-Jun的表达在衰竭的T细胞中较低/被下调，并且被修饰以过表达和/或包含升高水平的c-Jun或其他AP-1转录因子的T细胞显示降低的T细胞衰竭水平。例如，AP-1转录因子(特别是c-Jun)的过表达防止了T细胞衰竭的发展并维持了T细胞的功能性(例如，即使在暴露于高水平的抗原之后)(参见实施例1-6)。表达水平升高的AP-1转录因子(尤其是c-Jun)的GD2 CAR T细胞显示出减少的衰竭特征(包括更低的衰竭标志物、增加的记忆形成和增加的细胞因子产生)，表明经修饰以过表达和/或包含升高(例如，超过生理学)水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞在多个恶性肿瘤中显示出增强的临床功效(参见，例如，实施例1-6)。此外，经修饰以过表达c-Jun的CD19 CAR T细胞和经修饰以过表达c-Jun的CD22 CAR T细胞均显示出CAR T细胞对具有低表面抗原水平的白血病靶细胞的识别增强(参见，例如，实施例6)。通过使用cJUN修饰的CAR T细胞，经修饰以过表达AP-1转录因子的CAR T细胞在三种不同的体内肿瘤模型中显示出降低的T细胞衰竭和增强的功能性(请参见实施例8)。因此，AP-1转录因子(特别是c-Jun)的过表达阻止了T细胞衰竭的发展，并维持了T细胞的功能性。总而言之，这些发现表明，本发明所述的组合物和方法可广泛应用，并解决了许多现有的成功进行CAR T细胞疗法的障碍。

因此，本发明提供了在未经修饰T细胞呈现T细胞衰竭的条件下维持功能性的经修饰的T细胞(例如，遗传和/或功能修饰的，例如，以过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性)。以这种方式，本发明所述的组合物和方法可用于预防改造的T细胞(例如，被改造成表达特定的T细胞受体，或被改造成表达嵌合抗原受体(CAR))的衰竭和预防未改造的T细胞(例如，天然或自然的T细胞(例如，从受试者体内分离))的衰竭，从而增强改造的以及未改造的T细胞功能性。

修饰T细胞以使其过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子可以预防T细胞中AP-1转录因子的耗竭(例如，随T细胞的衰竭而发生的AP-1转录因子的耗竭(参见，例如，实施例1))和/或导致AP-1转录因子水平升高(例如，超过生理学水平)。AP-1转录因子(例如c-Jun)是在T细胞活化后诱导产生的，并参与T细胞产生和分泌细胞因子(例如，白细胞介素-2)。表达CAR的T细胞由于受体的聚集而经历了递补，不依赖于抗原的信号传导，并复制了T细胞衰竭的基本生物学特性，表现为较高的PD-1、TIM-3和LAG-3的表达水平，减少了抗原诱导的细胞因子的产生和过度的程序性细胞死亡。AP-1转录因子被鉴定并表征为在衰竭的T细胞中减少(参见，例如，实施例1)。修饰T细胞以使其过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子显著增强了T细胞在暴露于诱导T细胞衰竭的条件下的功能性(参见，例如，实施例2-5)。虽然不需要理解机制来实施本发明，并且虽然本发明不限于任何特定的作用机制，但是T细胞内的AP-1转录因子水平(例如，c-Jun的水平)的维持和/或升高可预防与T细胞衰竭相关的T细胞功能障碍(例如，在未衰竭的T细胞中观察到AP-1转录因子过表达的微小影响表明c-Jun的相对或绝对缺乏是与T细胞衰竭相关的功能障碍中的重要因素)。

在一些实施方案中，T细胞被修饰以过表达和/或含有升高水平的一种或多种突变的和/或截短的AP-1转录因子，以防止所述T细胞中AP-1转录因子的耗竭。在本申请实施方案的开发过程中进行的实验表明，AP-1家族蛋白(例如c-Jun)的一部分可以被突变和/或截短，同时不会影响所述突变/截短的AP-1因子介导挽救功能障碍性T细胞的能力。例如，与c-Jun相比，具有N末端缺失和突变(例如，在反式激活结构域中)的c-Jun多肽保持其挽救HA-28z衰竭的CAR T细胞功能的能力并保持同等的细胞因子产生的增加。在一些实施方案中，AP-1(例如，c-Jun)多肽在反式激活和/或δ结构域中包含突变或缺失。在一些实施方案中，AP-1(例如，c-Jun)多肽包含使反式激活和/或δ结构域失活或不存在的突变或缺失。在一些实施方案中，突变/截短的AP-1(例如，c-Jun)多肽包含与野生型AP-1转录因子(例如，c-Jun)的C末端氨基酸残基(例如，50个残基、75个残基、100个残基、150个残基、200个残基或250个残基、或它们之间的范围)、C末端部分(例如，四分之一、三分之一、二分之一)或C末端结构域(例如，ε、bZIP及其氨基酸的C末端)具有70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其之间的范围)或更高的序列同一性。在一些实施方案中，野生型AP-1转录因子(例如，c-Jun)的N末端氨基酸残基(例如，50个残基、75个残基、100个残基、150个残基、或它们之间的范围)、N末端部分(例如，四分之一、三分之一、二分之一)或N末端结构域(例如，δ、反式激活结构域及其氨基酸的N末端)被缺失、突变或以其他方式失活。本申请涉及AP-1转录因子而描述的任何实施方案可以包含突变的/截短的AP-1(例如，c-Jun)多肽，例如与上文一致。

虽然增强的AP-1转录因子(如c-Fos和c-Jun)的表达增强了经修饰的T细胞的功能，但在衰竭的活化T细胞中还表达其他抑制性AP-1家族成员。AP-1抑制性复合物成员的抑制/敲低(例如，以提升经典AP-1因子的可用度)也减少了T细胞衰竭(例如，参见实施例7)。特别地，AP-1抑制性复合物成员的抑制/敲除导致衰竭的T细胞的T细胞功能显著增强(例如，细胞因子的产生和/或表达增强)，但在健康T细胞中则没有显著增强T细胞功能(例如，参见图8A-D)。因此，在某些实施方案中，本发明提供了通过抑制AP-1抑制性复合物成员(例如BATF3和其他BATF家族成员(BATF 1和2)、IRF4、IRF8和其他IRF家族成员(IRF 1、2、3、5、6、7或9)和ATF家族成员(ATF 1、2、3、4、5、6或7))的表达和/或活性来抑制T细胞衰竭的组合物和方法。本发明不限于抑制AP-1抑制性复合物成员(例如基因)的表达和/或活性的方法。例如，在一些实施方案中，抑制AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性发生在基因组水平上(例如，通过破坏基因表达)。在其他实施方案中，抑制AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性发生在蛋白质表达和/或活性水平上(例如，通过破坏蛋白质表达和/或活性)。用于抑制AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性的示例性组合物和方法包括，但不限于，核酸酶破坏、CRISPR-Cas9系统、锌指核酸酶靶向、TALEN基因组编辑、shRNA、siRNA、miRNA靶向、degron可调节启动子、蛋白质抑制剂(例如，化学抑制剂、小分子抑制剂、抗体等)、显性失活(dominant negatives)的表达等。下表1中提供了用于抑制AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性的示例性组合物。CAS代表化学文摘服务(Chemical Abstracts Service)，是分配给每种化学物质的唯一数字标识符。

因此，本发明提供了用于减少T细胞衰竭的组合物和方法，所述组合物和方法包含经修饰以过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或经修饰以降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员的表达和/或活性的T细胞。本发明不受可以使用本发明所述的经修饰的T细胞以进行治疗的疾病或病症的限制。事实上，本申请提供的组合物和方法可用于治疗增加的T细胞活性能对之提供治疗益处的任何疾病。

因此，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含经修饰以过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或经修饰(例如，遗传修饰)以降低一种或多种AP-1抑制性复合物成员(例如，JunB、BATF3和其他BATF家族成员、IRF4、IRF8和其他IRF家族成员以及ATF家族成员)的表达和/或活性的T细胞。如本申请中的详细描述，T细胞可以是改造的或未改造的T细胞(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL))。此外，本发明不限于经修饰以过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞的类型。在一些实施方案中，所述T细胞是CD3+T细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞的组合)。在某些实施方案中，所述T细胞是CD8+T细胞。在其他实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是自然杀伤(NK)T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+和CD8T+细胞的组合(例如，CD3+的T细胞)。在某些实施方案中，所述T细胞是记忆T细胞。在某些实施方案中，所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK T细胞、记忆T细胞和/或γδT细胞的组合。在一些实施方案中，所述T细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞。在一些实施方案中，所述T细胞被改造以表达嵌合抗原受体。在另一个实施方案中，所述T细胞被改造以表达特异性T细胞受体(例如，对肿瘤抗原或传染病抗原具有特异性)。在一些实施方案中，所述T细胞是抗肿瘤T细胞。所述组合物可以包含药学上可接受的载体(例如，缓冲液)。所述组合物还可以包含一种或多种其他试剂(例如，化学治疗剂(例如，本申请描述的化学治疗剂)和/或抗微生物剂。示例性的抗微生物剂包括，但不限于，抗体、苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、鲸蜡基吡啶鎓氯化物、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫汞撒(thimersol)和/或其组合。所述组合物可以任选地包含一种或多种其他试剂，例如用于治疗T细胞衰竭的其他药物(例如，抗PD-1检查点抑制剂(例如纳武利尤单抗(nivolumab))或其他用于治疗受试者的与T细胞衰竭相关的感染或疾病的药物(例如抗病毒药、抗生素药、抗微生物药或抗癌药)。

抗菌治疗剂可以用作本发明所述组合物中的治疗剂。可以使用能杀死、抑制或减弱微生物功能的任何试剂，以及可以预期具有这种活性的任何试剂。抗菌剂包括，但不限于，天然的和合成的抗生素、抗体、抑制性蛋白质(例如防御素)、反义核酸、膜破坏剂等，可以单独使用或组合使用。事实上，可以使用任何类型的抗生素，包括但不限于抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂等。

用于靶向肿瘤抗原的几种策略是本领域已知的。例如，靶向GD2的免疫疗法目前正处于几种疾病的临床和临床前研究中，包括神经母细胞瘤、骨肉瘤和黑色素瘤(参见，例如，Thomas et al.,PLoS One,2016.11(3):p.e0152196；Long et al.,Nature Medicine,2015.21(6):第581-590页；Long et al.,Cancer Immunology Research,2016.4(10):第869-880页；Yu et al.,N Engl J Med,2010.363(14):第1324-34页；Perez Horta et al.,Immunotherapy,2016.8(9):第1097-117页；Heczey et al,Molecular Therapy)。与无法有效穿越血脑屏障的mAb不同，活化的CAR T细胞在过继转移后能有效渗透CNS。因此，在一个实施方案中，可以根据本发明所述的组合物和方法修饰任何CAR T细胞(例如，经修饰以过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子(例如，从而增强CAR T细胞的功能性和/或抑制CAR T细胞的衰竭))。

例如，如本申请所述，本发明所述的经修饰的T细胞(例如，经修饰以过表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子和/或经修饰(例如，遗传修饰)以降低一个或多个AP-1抑制性复合物成员(例如，JunB和BATF3以及其他BATF家族成员，IRF4和ATF家族成员)的表达和/或活性)也可以被改造为包含CAR，所述CAR包含靶标特异性结合元件，其也被称为抗原结合部分。对部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以将抗原结合结构域选择为能识别配体，所述配体充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物。可以充当本发明所述CAR中的抗原部分结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞相关的细胞表面标志物。

例如，可以通过将特异性结合肿瘤细胞上的抗原的所需抗原结合部分进行改造来将CAR改造成靶向目标肿瘤抗原。如本申请所用，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖性疾病相关的抗原”或“癌抗原”是指特定的过度增殖性疾病例如癌症中常见的抗原。作为示例，包括本申请提及的示例性抗原。该列表不旨在是排他的，并且其他示例对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的能够引起免疫反应特别是T细胞介导的免疫反应的蛋白质。因此，可以基于要治疗的癌症的特定类型选择抗原结合部分。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括，例如，神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜***、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、***特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、***素、PSMA、Her2/neu、存活蛋白和端粒酶、***癌肿瘤抗原1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

肿瘤抗原可以包含与恶性肿瘤相关的一种或多种抗原性癌抗原/表位。恶性肿瘤表达多种可以充当用于免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP100，以及***癌中的***酸性磷酸酶(PAP)和***特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于与转化有关的分子群，例如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胎抗原，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，该抗原是单个肿瘤所特有的。B细胞分化抗原(如CD19、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。

肿瘤抗原也可以是肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen,TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所特有的，不会在体内其他细胞上发生。TAA不是肿瘤细胞特有的，而是还能在无法诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在某些正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能对抗原作出反应的条件下发生。TAA可以是在免疫系统不成熟且无法应答的胚胎发育过程中在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是通常以极低的水平存在于正常细胞上但以很高的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。

TSA或TAA的实例包括，但不限于，分化抗原如MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因如p53、Ras、HER-2/neu；染色体易位导致的独特肿瘤抗原；例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，例如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人***瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO-1、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.291\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

根据要靶向的期望抗原，可以将CAR改造为包括特异性针对期望抗原靶标合适的特异性抗原结合部分。例如，如果CD19是要靶向的期望抗原，则可以将针对CD19的抗体用作抗原结合部分，以整合到本发明所述的CAR中。

治疗方法

在另一个方面，本申请提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向患有所述疾病或病症的所述受试者(例如患者)施用有效量的经修饰以表达和/或包含升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞。本发明不受所治疗的疾病或病症类型的限制。事实上，通过施用T细胞可治疗(例如，在治疗后疾病的症状或症状得到改善)的任何疾病或病症均可以通过使用本发明所述的组合物和方法(含有和/或使用经修饰以表达和/或包含升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞)以改善的且更有效的方式治疗。在一个实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在另一个实施方案中，所述疾病或病症是传染病。本发明不受癌症类型或传染病类型的限制。事实上，本领域已知的任何将T细胞疗法用于治疗的癌症均可以使用本发明所述的组合物和方法来治疗。类似地，本领域已知的任何将T细胞疗法用于治疗的传染病均可以使用本发明所述的组合物和方法来治疗。在一个实施方案中，向患有疾病或病症的受试者(例如患者)施用有效量的经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞可抑制所述受试者的T细胞衰竭(例如，当向所述受试者施用相同量的未经修饰的T细胞时会发生的T细胞衰竭)。例如，在某些实施方案中，所述方法包括治疗患有对采用过继细胞疗法的治疗有应答的疾病或病状的受试者的方法。在某些实施方案中，所述治疗患有对采用过继细胞疗法的治疗有应答的疾病或病状的受试者的方法包括施用包含有效量的经遗传修饰以表达水平升高的一种或多种AP-1转录水平的T细胞的组合物的步骤，其中与表达正常水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞相比，所述经遗传修饰以表达升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞显示出降低的T细胞衰竭水平。在某些实施方案中，所述疾病或病症包括癌症。

在一个方面，本发明提供了通过使用经修饰/改造以表达一种或多种AP-1转录因子的T细胞来治疗癌症/肿瘤的方法。在本发明的各个方面，提供了治疗癌症/肿瘤的方法，所述方法包括向患有这种癌症或肿瘤的患者施用有效量的经修饰/改造以表达一种或多种AP-1转录因子的T细胞。本发明不受所治疗的癌症和/或肿瘤的类型的限制。如本申请所用，术语“癌症”是指各种类型的恶性肿瘤，其中大多数可以侵入周围组织，并且可以转移至不同部位(参见，例如，PDR Medical Dictionary，第1版(1995)，其全部内容出于所有目的通过引用并入本申请)。术语“肿瘤(neoplasm)”和“肿瘤(tumor)”是指异常组织，所述异常组织通过细胞增殖生长的比正常更快，并且在去除了引发增殖的刺激之后继续生长。这种异常组织显示出结构组织以及与正常组织的功能协调的部分或完全缺失，其可以是良性的(即良性肿瘤)或恶性的(即恶性肿瘤)。癌症的一般类别的例子包括，但不限于，癌(例如，源自上皮细胞的恶性肿瘤，例如，乳腺癌、***癌、肺癌和结肠癌的常见形式)、肉瘤(例如，源自***或间充质细胞的恶性肿瘤)、淋巴瘤(例如，源自造血细胞的恶性肿瘤)、白血病(例如，源自造血细胞的恶性肿瘤)、生殖细胞肿瘤(例如，源自全能细胞的肿瘤。在成年人中最常见于睾丸或卵巢；在胎儿、婴儿和幼儿中，最常见于身体中线，尤其是在尾骨的尖端)、胚性肿瘤(例如，典型的类似于不成熟或胚胎组织的恶性肿瘤)等。可以使用本发明所述的组合物和方法治疗的肿瘤和/或赘生物(neoplasm)的其他例子包括但不限于与神经组织、血液形成组织、乳腺、皮肤、骨、***、卵巢、子宫、子宫颈、肝、肺、脑、喉、胆囊、胰腺、直肠、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、免疫系统、头颈部、结肠、胃、支气管和/或肾脏的癌症相关的肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是隐匿性癌症、先前诊断过的原发性癌症或转移性癌症。

在某些实施方案中，经修饰的T细胞(例如，CAR T细胞(例如，与未修饰的T细胞相比))中一种或多种AP-1转录因子水平升高的存在使得相比于用未经修饰以含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞(例如CAR T细胞)进行治疗能够更有效地治疗(杀伤和/或抑制进展)癌症/肿瘤。

在某些实施方案中，本发明提供了使用经遗传改造以过表达和/或包含升高(例如，超过生理性)水平的一种或多种AP-1转录因子以及经改造以表达能识别肿瘤表面抗原(例如，CD19、CD20、CD22、ROR1、GD2、EBV蛋白质或抗原、叶酸受体、间皮素、人癌胚抗原、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、NY-ESO-1、MAGE-A3、MART-1、GP1000和/或p53)的受体并传递激活T细胞以诱导T细胞扩增和/或肿瘤杀伤的信号的T细胞(例如，CD3+T细胞)来治疗(例如，抑制生长和/或杀死)癌症和/或肿瘤的方法。受体的一个非限制性例子是嵌合抗原受体(CAR)，其整合有源自能识别GD2的mAb的scFv，以及跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。CAR可以进一步被改造成整合有在遇到肿瘤细胞抗原(例如GD2抗原)后能促进所述经改造的细胞的扩增的其他信号传导元件以及使得所述经改造的细胞能够长期持久的元件。本发明进一步提供了包含所述遗传改造的细胞的组合物(例如，以足以到达癌症和/或肿瘤的量产生和施用的免疫治疗组合物)。

经修饰的T细胞的构建。

如本申请所述，本发明提供了包含经修饰(例如遗传修饰(例如，经转导))以表达(例如异源表达)一种或多种AP-1转录因子的T细胞的组合物。例如，本发明提供了转导的T细胞。“转导的细胞”是已经使用分子生物学技术引入了核酸分子的细胞。经修饰/转导以表达一种或多种异源AP-1转录因子的T细胞可通过能将核酸分子引入此类细胞的任何技术进行转导，包括，但不限于，用病毒载体(例如，逆转录病毒、慢病毒或其他病毒载体)转染、通过基于CRISPR/Cas9的系统、用质粒载体转化、和/或通过电穿孔、脂质和粒子枪加速引入裸露的DNA。病毒和/或质粒载体可用于体外、体内和/或离体表达。AP-1转录因子可以与改造的TCR或CAR共表达，同时转录因子和TCR和/或CAR可以从不同的病毒载体中共表达。在另一个实施方案中，它们通过使用双顺反子载体从单一载体构建体中表达。C-Jun(和/或其他AP-1转录因子)可以组成性表达或以受调控的方式进行表达(例如，使用通过小分子进行远程调控表达的系统或使用内源调控系统)。在另一个实施方案中，可以使用逆转录病毒、慢病毒或其他病毒载体或经由基于CRISPR/Cas9的系统将c-Jun和/或其他AP-1转录因子基因遗传整合到细胞DNA中。在又一个实施方案中，c-Jun和/或其他AP-1转录因子经由RNA或溶瘤病毒或本领域已知的其他瞬时表达系统表达。C-Jun和/或其他AP-1转录因子可以离体递送到T细胞中(例如，其中所述T细胞用于过继转移)，或通过体内遗传转移来递送。

本发明不受在T细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)的限制(例如，本发明方法中使用的CAR构建体)。在一个实施方案中，所述CAR包含与肿瘤抗原(例如GD2)特异性结合的免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区(例如，单链可变片段(scFv))的融合蛋白。本领域普通技术人员知道scFv是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，其与连接肽(例如，具有约10至约25个氨基酸的连接肽)连接。本发明不受连接肽类型的限制。在一些实施方案中，所述连接肽富含甘氨酸(例如，为了柔性)。在一些实施方案中，所述连接肽包含丝氨酸和/或苏氨酸(例如，为了溶解度)。在一些实施方案中，所述连接肽包含富含甘氨酸的部分和包含丝氨酸和/或苏氨酸的部分。

与肿瘤抗原(例如GD2)特异性结合的任何抗体/免疫球蛋白均可用于构建CAR(例如，使用VH和VL区域构建融合蛋白scFv)，以在本发明所述治疗方法中使用的免疫细胞中表达。对于GD2，此类抗体/免疫球蛋白的实例包括但不限于：14G2a、ch14.18、hu14.18K322A、m3F8、hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG4、HM3F8、UNITUXIN、DMAb-20或与GD2特异性结合的任何其他抗体(例如，本领域已知或已有描述的，或尚待鉴定的)。肿瘤抗原(例如，GD2)CAR可以包含整合有肿瘤抗原(例如，GD2)抗体的scFv内变体的受体，所述抗体被产生用来增强亲和力和/或减少递补性信号传导。肿瘤抗原(例如，GD2)CAR可以整合有可变长度的铰链区(例如，在scFv和信号传导域之间)和/或变化的跨膜结构域。本发明不受所使用的跨膜结构域的限制。事实上，可以使用任何跨膜结构域，包括但不限于，TCRζ链(CD3ζ)、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137/TNFRSF9、FcERIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132或CD40的全部或部分跨膜结构域。

本发明所述的CAR构建体可以包括将配体结合转导至细胞内信号(例如，激活(例如，部分激活)T细胞)的细胞内信号传导域(例如，天然T细胞受体复合物的CD3ζ和/或其他信号传导域(例如，MyD88信号传导域))。在缺乏共刺激信号的情况下，受体-配体结合常常不足以完全激活T细胞并使其增殖。因此，CAR构建体可以包含一个或多个共刺激结构域(例如，提供第二信号以刺激完全T细胞活化的结构域)。在一个实施方案中，使用共刺激结构域，其提升CAR免疫T细胞细胞因子的产生。在另一个实施方案中，使用共刺激结构域，其促进T细胞复制。在又一个实施方案中，使用共刺激结构域，其防止CAR T细胞衰竭。在另一个实施方案中，使用共刺激结构域，其提升T细胞的抗肿瘤活性。在另一个实施方案中，使用共刺激结构域，其增强CAR T细胞(例如，输注至患者后)的存活。可用于提供共刺激信号的蛋白质或其结构域或部分的实例包括，但不限于，B7-1/CD80；CD28；B7-2/CD86；CTLA-4；B7-H1/PD-L1；ICOS/CD278；ILRB/CD122；IL-2RG/CD132；B7-H2；PD-1；B7-H3；PD-L2；B7-H4；PDCD6；BTLA；4-1BB/TNFRSF9/CD137；FcERIγ；CD40配体/TNFSF5；4-1BB配体/TNFSF9；GITR/TNFRSF18；BAFF/BLyS/TNFSF13B；GITR配体/TNFSF18；BAFF R/TNFRSF13C；HVEM/TNFRSF14；CD27/TNFRSF7；LIGHT/TNFSF14；CD27配体/TNFSF7；OX40/TNFRSF4；CD30/TNFRSF8；OX40配体/TNFSF4；CD30配体/TNFSF8；TACl/TNFRSF13B；CD40/TNFRSF5；2B4/CD244/SLAMF4；CD84/SLAMF5；BLAME/SLAMF8；CD229/SLAMF3；CD2 CRACC/SLAMF7；CD2F-10/SLAMF9；NTB-A/SLAMF6；CD48/SLAMF2；SLAM/CD150；CD58/LFA-3；CD2；Ikaros；CD53；整合素α4/CD49d；CD82/Kai-1；整合素α4β1；CD90/Thy1；整合素α4β7/LPAM-1；CD96；LAG-3；CD160；LMIR1/CD300A；CRTAM；TCL1A；DAP12；TIM-1/KIM-1/HAVCR；Dectin-1/CLEC7A；TIM-4；DPPIV/CD26；TSLP；EphB6；TSLP R；和HLA-DR。在一个实施方案中，在本发明所述的组合物和方法中使用的表达在T细胞中的CAR构建体包括CD28内结构域、4-1BB内结构域和/或OX40内结构域。在某些实施方案中，对本发明所述的肿瘤抗原(例如GD2)具有特异性的CAR构建体包含与肿瘤抗原(例如GD2)特异性结合的抗体的scFv、跨膜结构域(例如CD8)、T细胞受体胞内信号传导域(例如，TCRζ链(CD3ζ))和至少一个共刺激结构域(例如，4-1BB)。

本发明不限于在T细胞中遗传表达TCR、CAR和/或一种或多种AP-1转录因子的手段。事实上，可以使用本领域已知的和/或本申请描述的任何手段。遗传改造T细胞的方法的非限制性例子包括但不限于，逆转录病毒或慢病毒介导的转导、用基于转座酶的系统转导以进行基因整合、Crispr/Cas9介导的基因整合、非整合载体如RNA或腺相关病毒，或本申请所述的其他方法。包含改造的T细胞的组合物可以整合有未改造的T细胞或其他免疫细胞，或为更大的扩增或持久能力而选择的T细胞亚类。为了减少毒性，可以整合允许杀死改造的细胞的元件。为了减少毒性和/或增强功效，可以包括允许整合能调节改造的细胞中的蛋白质表达的元件。

癌症治疗、组合物和联合疗法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗或延缓个体中癌症的进程，或用于治疗或延缓传染病的进程的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本发明所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述治疗导致在停止治疗后个体的持续应答。本申请描述的方法可用于治疗需要增强免疫原性的病症，例如提升肿瘤免疫原性以用于治疗癌症。本申请还提供了增强患有癌症的个体的免疫功能的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本发明所述经修饰的T细胞。在这些方法中可以使用经遗传修饰以表达本领域已知或本申请描述的CAR和/或TCR的任何类型的T细胞。

在一些实施方案中，所述个体患有对一种或多种其他形式的抗癌治疗(例如，化学疗法、免疫疗法等)具有抗性(例如，已经证实具有抗性)的癌症。在一些实施方案中，抗性包括癌症或难治性癌症的复发。复发可能是指治疗后在原始部位或新部位再次出现癌症。在一些实施方案中，抗性包括用化学疗法治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，抗性包括对用化疗剂进行的传统疗法或常规疗法无反应的癌症。癌症在治疗开始时可能是耐药的，或者在治疗过程中可能变成耐药的。在一些实施方案中，所述癌症处于早期或晚期。

在某些实施方案中，本发明提供了使患有癌症/肿瘤的动物(例如人)暴露于治疗有效量的包含经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞的免疫治疗组合物能彻底地抑制此类癌细胞的生长和/或使这样的细胞成为更易受癌症治疗药物或放射疗法影响(例如，受其细胞死亡诱导活性的影响)的群体。本发明所述的免疫治疗组合物和方法可用于治疗、改善或预防疾病，例如任何类型的癌症。

在某些实施方案中，将包含经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞的免疫治疗组合物用于治疗、改善或预防以对一种或多种常规癌症疗法具有抗性为特征的癌症(例如，具有抗化学性、抗放射性、抗激素性的癌细胞等)。如本申请所述，经遗传修饰以表达肿瘤特异性CAR的任何T细胞均可用于本发明所述的免疫治疗组合物和方法。

本发明所述的免疫治疗组合物(例如，包含经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞)和本发明所述的方法可用于诱导针对肿瘤细胞的细胞毒活性和/或促进细胞的存活和功能(例如，经修饰的免疫细胞的存活和功能)。例如，本发明所述的免疫治疗组合物和方法可用于诱导白介素2(IL-2)以促进T细胞存活；用于诱导Fas配体(FasL)和/或肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)(例如，以诱导肿瘤细胞凋亡)；和/或用于诱导干扰素(IFN)-γ(例如，以激活先天免疫应答(例如，针对癌症))。在一些实施方案中，本发明所述的组合物和方法用于诱导细胞周期停滞和/或凋亡，并且还用于单独地或在应答其他细胞凋亡诱导信号时增强细胞周期停滞和/或凋亡的诱导。在一些实施方案中，经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞使癌细胞对细胞周期停滞和/或凋亡的诱导敏感，包括通常对这种诱导刺激具有抗性的细胞。

在一些实施方案中，本发明所述的组合物和方法可用于治疗动物(例如哺乳动物患者，包括但不限于人和伴侣动物)中的病变细胞、组织、器官或病理状况和/或疾病状态。在这方面，使用本发明所述的方法和组合物可以治疗或预防各种疾病和病理。在一些实施方案中，被治疗的癌细胞是转移性的。在其他实施方案中，所述被治疗的癌细胞对抗癌剂具有抗性。

本发明的一些实施方案提供了施用有效量的经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞和至少一种其他治疗剂(包括但不限于化疗抗肿瘤药、细胞凋亡调节剂、抗微生物药、抗病毒药、抗真菌药和抗炎药)和/或治疗技术(例如手术干预和/或放射疗法)的方法。在一个特定的实施方案中，所述其他治疗剂是抗癌剂。

许多合适的抗癌剂可被考虑用于本发明所述的方法。实际上，本发明考虑，但不限于，施用多种抗癌剂，例如：诱导凋亡的试剂；多核苷酸(例如反义、核酶、siRNA)；多肽(例如酶和抗体)；生物模拟物；生物碱；烷基化剂；抗肿瘤抗生素；抗代谢物；激素；铂化合物；单克隆或多克隆抗体(例如与抗癌药、毒素、防御素偶联的抗体)，毒素；放射性核素；生物反应修饰剂(例如干扰素(例如IFN-α)和白介素(例如IL-2))；过继免疫治疗剂；造血生长因子；诱导肿瘤细胞分化的药物(例如全反式维甲酸)；基因治疗试剂(例如反义治疗试剂和核苷酸)；肿瘤疫苗；血管生成抑制剂；蛋白酶体抑制剂：NF-κB调节剂；抗CDK化合物；HDAC抑制剂等。适合与所公开的化合物共同施用的化疗化合物和抗癌疗法的许多其他实例是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，抗癌剂包括诱导或刺激凋亡的试剂。诱导凋亡的试剂包括，但不限于，放射(例如，X射线、γ射线、UV)；肿瘤坏死因子(TNF)相关因子(例如TNF家族受体蛋白、TNF家族配体、TRAIL、TRAIL-R1或TRAIL-R2的抗体)；激酶抑制剂(例如表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂、血管生长因子受体(VGFR)激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)激酶抑制剂、血小板源性生长因子受体(PDGFR)激酶抑制剂和Bcr-Abl激酶抑制剂(例如GLEEVEC))；反义分子抗体；抗体(例如HERCEPTIN、RITUXAN、ZEVALIN和AVASTIN)；抗***(例如，雷洛昔芬和他莫昔芬)；抗雄激素(例如，氟他胺、比卡鲁胺、非那雄胺、氨基谷氨酰胺、酮康唑和皮质类固醇)；环氧合酶2(COX-2)抑制剂(例如，塞来昔布、美洛昔康、NS-398和非甾体类抗炎药(NSAIDs))；抗炎药(例如，丁唑烷定、DECADRON、DELTASONE、***、***增强醇、DEXONE、HEXADROL、羟氯喹、METICORTEN、ORADEXON、ORASONONE、氧苯丁酮、PEDIAPRED、苯基丁酮、PLAQUENIL、***龙、***、PRELONE和TANDEARIL)；和癌症化学治疗药物(例如，伊立替康(CAMPTOSAR)、CPT-11、氟达拉滨(FLUDARA)、达卡巴嗪(DTIC)、***、米托蒽醌、MYLOTARG、VP-16、顺铂、卡铂、奥沙利铂、5-FU、阿霉素、吉西他滨、硼替佐米、吉非替尼、贝伐单抗、TAXOTERE或TAXOL)；细胞信号分子；神经酰胺和细胞因子；星形孢菌素等。

在其他实施方案中，本发明所述的组合物和方法与选自以下的至少一种抗过度增殖或抗肿瘤剂一起使用：烷基化剂、抗代谢物和天然产物(例如，草药和其他植物和/或动物衍生的化合物)。

适用于本发明所述组合物和方法的烷基化剂包括，但不限于：1)氮芥(例如，甲乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-肌溶素)和苯丁酸氮芥)；)乙炔亚胺和甲基三聚氰胺(例如六甲基三聚氰胺和噻替帕)；3)烷基磺酸盐(例如，白消安)；4)亚硝基脲(例如卡莫司汀(BCNU)；洛莫司汀(CCNU)；司马汀(甲基-CCNU)；和链脲霉素(streptozotocin))；和5)三氮烯(例如，达卡巴嗪(DTIC；二甲基三氮烯酰亚胺-唑甲酰胺)

在一些实施方案中，适用于本发明所述组合物和方法的抗代谢物包括但不限于：1)叶酸类似物(例如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤))；2)嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FudR)和阿糖胞苷(阿糖胞苷))；和3)嘌呤类似物(例如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)、硫代鸟嘌呤(6-硫代鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2'-去氧助间霉素)。

在其他实施方案中，适用于本发明所述组合物和方法的化学治疗剂包括，但不限于：1)长春花生物碱(例如，长春碱(VBL)、长春新碱)；2)表鬼臼毒素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)；3)抗生素(例如，放线菌素(放线菌素D)，柔红霉素(道诺霉素；红霉素)、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素(丝光霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C))；4)酶(例如，L-天冬酰胺酶)；5)生物反应调节剂(例如，干扰素-α)；6)铂配位配合物(例如，顺铂(cis-DDP)和卡铂)；7)蒽二酮(例如，米托蒽醌)；8)取代的脲(例如，羟基脲)；9)甲基肼衍生物(例如，丙咔嗪(N-甲基肼；MIH))；10)肾上腺皮质激素抑制剂(例如，米线烷(o，p’-DDD)和氨基谷氨酰胺)；11)肾上腺皮质类固醇(例如，***)；12)孕激素(例如，己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸孕甾酮)；13)***(例如，己烯雌酚和炔雌醇)；14)抗***药(例如，他莫昔芬)；15)雄激素(例如，丙酸***和氟***)；16)抗雄激素(例如，氟他胺)：和17)***释放激素类似物(例如，亮丙瑞林)。

在癌症治疗中常规使用的任何溶瘤剂也可以用于本发明所述的组合物和方法中。例如，美国食品和药物管理局(US.Food and Drug Administration)拥有一批在美国被批准使用的溶瘤剂配方。美国F.D.A.的国际对应机构拥有类似的配方。

抗癌剂还包括已被确定具有抗癌活性的化合物。实例包括，但不限于，3-AP、12-O-十四烷酰基佛波尔-13-乙酸盐、17AAG、852A、ABI-007、ABR-217620、ABT-751、ADI-PEG 20、AE-941、AG-013736、AGRO100、阿拉诺新、AMG 706、抗体G250、抗肿瘤药、AP23573、阿帕奇醌、APC8015、阿替莫德、ATN-161、阿曲生(atrasenten)、阿扎胞苷、BB-10901、BCX-1777、贝伐单抗、BG00001、比卡鲁胺、BMS 247550、硼替佐米、bryostatin-1、布舍瑞林(buserelin)、骨化三醇、CCI-779、CDB-2914、头孢克肟(cefixime)、西妥昔单抗(cetuximab)、CG0070、西仑吉肽(cilengitide)、氯法拉滨(clofarabine)、CP-675,206、CP-724,714、CpG 7909、姜黄素、地西他滨(decitabine)、DENSPM、度骨化醇(doxercalciferol)、E7070、E7389、海鞘素743、乙丙昔罗(efaproxiral)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、EKB-569、恩扎妥林(enzastaurin)、埃罗替尼(erlotinib)、依昔舒林(exisulind)、芬维A胺(fenretinide)、夫拉平度(flavopiridol)、氟达拉滨、氟他胺、福莫司汀(fotemustine)、FR901228、G17DT、加利昔单抗(galiximab)、吉非替尼、染料木素(genistein)、葡磷酰胺(glufosfamide)、GTI-2040、组胺瑞林(histrelin)、HKI-272、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)、HSPPC-96、hu14.18-白细胞介素-2融合蛋白、伊洛前列素(iloprost)、咪喹莫特(imiquimod)、英夫利昔单抗(infliximab)、白细胞介素-12、IPI-504、伊罗夫文(irofulven)、伊沙匹隆(ixabepilone)、拉帕替尼(lapatinib)、来那度胺(lenalidomide)、来他替尼(lestaurtinib)、亮丙瑞林、LMB-9免疫毒素、洛那法尼(lonafarnib)、鲁昔单抗(luniliximab)、马磷酰胺(mafosfamide)、MB07133、MDX-010、MLN2704、单克隆抗体3F8、单克隆抗体J591、莫特沙芬(motexafin)、MS-275、MVA-MUC1-IL2、尼鲁米特(nilutamide)、硝基喜树碱(nitrocamptothecin)、诺拉曲沙二盐酸盐(nolatrexed dihydrochloride)、诺瓦得士(nolvadex)、NS-9、O6-苯甲基鸟嘌呤、奧利默森钠(oblimersen sodium)、ONYX-015、奥戈伏单抗(oregovomab)、OSI-774、帕尼单抗(panitumumab)、伯尔定(paraplatin)、PD-0325901、培美曲塞(pemetrexed)、PHY906、吡格列酮(pioglitazone)、吡非尼酮(pirfenidone)、匹克生琼(pixantrone)、PS-341、PSC 833、PXD101、吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)、R115777、RAD001、豹蛙酶(ranpirnase)、蝴蝶霉素(rebeccamycin)类似物、rhu血管抑素蛋白质、rhuMab 2C4、罗格列酮(rosiglitazone)、鲁比替康(rubitecan)、S-1、S-8184、赛特铂(satraplatin)、SB-15992、SGN-0010、SGN-40、索拉非尼(sorafenib)、SR31747A、ST1571、SU011248、辛二酰苯胺异羟肟酸、苏拉明(suramin)、塔拉司他(talabostat)、他仑帕奈(talampanel)、他立喹达(tariquidar)、替西罗莫司(temsirolimus)、TGFa-PE38免疫毒素、沙利度胺、胸腺法新(thymalfasin)、替吡法尼(tipifarnib)、替拉扎明(tirapazamine)、TLK286、曲贝替定(trabectedin)、三甲曲沙葡萄糖醛酸盐(trimetrexate glucuronate)、TroVax、UCN-1、丙戊酸、长春氟宁(vinflunine)、VNP40101M、伏洛昔单抗(volociximab)、伏立诺他(vorinostat)、VX-680、ZD1839、ZD6474、齐留通(zileuton)、以及左苏奎达三盐酸盐(zosuquidar trihydrochloride)。

本发明提供了与放射疗法(例如，在其之前、期间或之后)一起施用本发明所述的组合物和方法的方法。本发明不受类型、量或用于将治疗剂量的放射递送给动物的递送和给药系统的限制。例如，动物可以接受光子放射疗法、粒子束放射疗法、其他类型的放射疗法及其组合。在一些实施方案中，使用线性加速器将所述放射递送至所述动物。在其他实施方案中，使用伽马刀来递送放射。

放射源可以在动物的外部或内部。外部放射疗法是最常见的且涉及使用例如线性加速器将高能射线束穿过皮肤引导至肿瘤部位。当放射束定位在肿瘤部位时，几乎不可能避免正常健康组织的暴露。但是，动物通常可以很好地耐受外部放射。内部放射疗法涉及将放射发射源(例如珠、金属丝、小球、胶囊、颗粒等)植入到肿瘤部位处或其附近的体内，包括使用专门靶向癌细胞的递送系统(例如，使用附着在癌细胞结合配体上的颗粒)。此类植入物可以在治疗后去除，或者以没有活性的状态留在体内。内部放射疗法的类型包括，但不限于，近距离放射疗法、间质放射、腔内放射、放射免疫疗法等。

动物可任选地接受放射增敏剂(例如，甲硝唑、米索硝唑、动脉内Budr、静脉内碘代脱氧尿苷(IudR)、硝基咪唑、5-取代的-4-硝基咪唑、2H-异吲哚二酮、[[((2-溴乙基)-氨基]甲基]-硝基-1H-咪唑-1-乙醇、硝基苯胺衍生物、DNA亲和性缺氧选择性细胞毒素、卤代DNA配体、1,2,4苯并三嗪氧化物、2-硝基咪唑衍生物、含氟硝基唑衍生物、苯甲酰胺、烟酰胺、吖啶-嵌入剂、5-硫代叔唑衍生物、3-硝基-1,2,4-***、4,5-二硝基咪唑衍生物、羟基化特沙弗林、顺铂、丝裂霉素、替利帕明、亚硝基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、博来霉素、长春新碱、卡铂、表柔比星、阿霉素、环磷酰胺、长春地碱、依托泊苷、紫杉醇、热(高热)等)、放射防护剂(例如半胱胺、氨基烷基二氢硫代磷酸酯、氨磷汀(WR 2721)、IL-1、IL-6等)。放射增敏剂增强了对肿瘤细胞的杀伤力。放射防护剂可保护健康组织免于放射的有害效应。

可以向动物施用任何类型的放射，只要动物能够耐受放射剂量而并且没有不可接受的负面副作用即可。合适的放射疗法类型包括，例如，电离(电磁)放射疗法(例如，X射线或γ射线)或粒子束放射疗法(例如，高线性能量辐射)。电离辐射被定义为包括具有足以产生电离的能量(即电子的获得或损失)的粒子或光子的辐射(例如，在美国专利5,770,581中进行了描述，所述专利的全部内容通过引入并入本申请)。放射的效应可以至少部分地由临床医生控制。在一个实施方案中，将放射剂量进行分剂，以获得最大靶细胞暴露和降低的毒性。

在一个实施方案中，施用于动物的放射线的总剂量为约0.01格雷(Gy)至约100Gy。在另一个实施方案中，在治疗期间施用约10Gy至约65Gy(例如，约15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy、50Gy、55Gy或60Gy)。虽然在一些实施方案中，可以在一天的过程中施用完整的放射剂量，但是最好将总剂量分批并在几天内施用。理想情形下，放疗在至少约3天的过程中施用，例如至少5、7、10、14、17、21、25、28、32、35、38、42、46、52或56天(大约1-8周)。因此，每日放射剂量应包括约1-5Gy(例如，约1Gy、1.5Gy、1.8Gy、2Gy、2.5Gy、2.8Gy、3Gy、3.2Gy、3.5Gy、3.8Gy、4Gy、4.2Gy或4.5Gy)或1-2Gy(例如1.5-2Gy)。每日放射剂量应足以引起对靶细胞的破坏。在一个实施方案中，如果时间延长，不会每天施用放射，从而使动物休息并实现治疗效果。例如，对于每周治疗，理想的是连续5天进行放射治疗，而不是在2天施用，从而允许每周休息2天。但是，可根据动物的应答性和任何潜在的副作用，1天/周、2天/周、3天/周、4天/周、5天/周、6天/周或全部7天/周进行放射治疗。可以在治疗期间的任何时间开始放射治疗。在一个实施方案中，放射在第1周或第2周开始，并在治疗期的剩余时间内施用。例如，对于治疗例如实体瘤，放射可在包括6周治疗的治疗期的第1-6周或第2-6周中进行施用。或者，放射可在包括5周的治疗期的第1-5周或第2-5周中进行施用。但是，这些示例性放疗给药时间表并非旨在限制本发明。

在本发明的一些实施方案中，在以下一种或多种条件下向动物施用经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞和一种或多种治疗剂或抗癌剂：以不同的周期、以不同的持续时间、以不同的浓度、通过不同的给药途径等。在一些实施方案中，经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞在治疗剂或抗癌剂之前施用，例如在施用所述治疗剂或抗癌剂之前的0.5、1、2、3、4、5、10、12、18小时或更多，1、2、3、4、5、6或更多天，或1、2、3、4、5、6或更多周施用。在一些实施方案中，经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞在治疗剂或抗癌剂之后施用，例如在施用所述抗癌剂之后的0.5、1、2、3、4、5、10、12、18或更多小时，1、2、3、4、5、6或更多天，或1、2、3、4、5、6或更多周施用。在一些实施方案中，经修饰以表达和/或包含升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞和治疗剂或抗癌剂可以同时但以不同的时间表施用，例如，经修饰的免疫细胞每天施用而所述治疗剂或抗癌剂每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或更多周一次施用。在其他实施方案中，经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞每周施用一次，而所述治疗剂或抗癌剂每天、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或更多周一次施用。

在本发明范围内的组合物包括所有组合物，其中经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞以能有效实现其预期目的的量包含在其中。虽然个体需求变化，但是对各组分的有效量的最佳范围的确定在本领域技术范围内。在一个非限制性实例中，可将经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞施用于哺乳动物，例如人，从而每天为人提供1000至10¹⁰个T细胞(例如，用于治疗癌症)。在另一个实施方案中，施用1000至10¹⁰个经修饰的T细胞以治疗、改善或预防癌症(例如，预防癌症的转移、复发和/或进展)。单位剂量可以以每天一次或多次(例如，连续1、2、3、4、5、6或更多天或数周)给药进行施用。

T细胞可以作为药物制剂的一部分进行施用，所述药物制剂包含合适的药学上可接受的载体，所述载体包括有助于将经修饰的细胞加工和/或施用为可药用的制剂的赋形剂和助剂。T免疫细胞和/或包含其的药物制剂可以静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内、腹膜内、鞘内或心室内施用。可以施用有效量的T细胞和/或包含其的药物制剂以预防或治疗疾病。可以基于要治疗的疾病的类型、经修饰的T细胞的类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应以及主治医师的裁量权确定适当的剂量。

可以在本领域已知的各种模型中，例如临床或临床前模型中测试本申请所述的任何方法的功效(例如，将经修饰以表达和/或含有升高水平的一种或多种AP-1转录因子的T细胞与本申请所述的一种或多种化学治疗剂联合治疗)。合适的临床前模型在本申请中举例说明。对于任何示例性模型，在产生肿瘤之后，将小鼠随机招募至接受治疗的治疗组或对照治疗组中。在治疗过程中测量肿瘤大小(例如，肿瘤体积)，并且还监测总体存活率。

在一些实施方案中，在用T细胞治疗(例如，单独的或与本申请描述的另一种疗法组合)之前获得样品，作为用于测量对治疗的反应的基线。在一些实施方案中，所述样品是组织样品(例如，***固定的和石蜡包埋的(FFPE)、存档的、新鲜的或冷冻的)。在一些实施方案中，所述样品是全血。在一些实施方案中，所述全血包含免疫细胞、循环肿瘤细胞及其任何组合。

对治疗的应答性可以是指下述中的任何一项或多项：延长生存期(包括总体生存期和无进展生存期)；导致客观应答(包括完整应答或部分应答)；或改善癌症的体征或症状。在一些实施方案中，应答性可以是指根据已发表的用于确定癌症患者中的肿瘤状态的一组RECIST指南的一种或多种因素的改善，即应答、稳定或进展。有关这些准则的更详细讨论，请参见Eisenhauer et al.,Eur J Cancer 2009；45:228-47；Topalian et al.,N EnglJ Med 2012；366:2443-54；Wolchok et al.,Clin Can Res 2009；15:7412-20；和Therasse,P.,et al.J.Natl.Cancer Inst.92:205-16(2000)。应答性受试者可以是指例如根据基于RECIST标准的一种或多种因素，其癌症显示出改善的受试者。无应答的受试者是指例如根据基于RECIST标准的一种或多种因素，其癌症没有显示出改善的受试者。

传统的应答标准可能不足以表征免疫治疗剂的抗肿瘤活性，这可能会产生延迟的应答，其可能始于最初明显的放射学进展，包括新病变的出现。因此，已开发出修改后的应答标准，该标准考虑了新病变的可能出现，并在随后的评估中证实放射学进展。因此，在一些实施方案中，应答性可以指根据免疫相关反应标准2(immune-related responsecriteria2,irRC)的一种或多种因素的改善。参见，例如，Wolchok et al.,Clin Can Res2009；15:7412-20。在一些实施方案中，将新的病变加入到确定的肿瘤负荷中，并随后跟踪，例如，在随后的评估中用于放射学进展的跟踪。在一些实施方案中，非靶标病变的存在包括在完全应答的评估中，但不包括在放射学进展的评估中。在一些实施方案中，放射学进展可以仅基于可测量的疾病来确定和/或可以通过从首次记录的日期起>4周的连续评估来确认。

本说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。根据前面的描述，除了本申请中示出和描述的之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。本申请引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本申请。

实施例

下列实施例解释但不限制本发明所述的化合物、组合物和方法。对于临床治疗中通常遇到的并且对于本领域技术人员而言显而易见的各种条件和参数的其他合适的修改和适应在本发明的精神和范围内。

材料与方法

病毒载体的构建

先前描述了编码以下CAR的MSGV逆转录病毒载体：CD19-28z、CD19-BBz、GD2-28z、GD2-BBz、Her2-BBz和CD22-BBz。为了创建HA-28z CAR，将点突变引入GD2-28z CAR质粒的14G2a scFv中以创建E101K突变。将“4/2NQ”突变46引入IgG1间隔区的CH2CH3结构域中，以减少Fc受体的识别，以便在体内使用HA-28z CAR T细胞。通过IDT合成密码子优化的编码c-Jun(JUN)、c-Fos(FOS)和截短的NGFR(tNGFR)的cDNA，并将其克隆到慢病毒表达载体中以创建JUN-P2A-FOS，以及在单独的PGK启动子下共表达tNGFR的JUN和FOS单表达载体中。然后使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara)在CAR前导序列上游将JUN-P2A亚克隆到MSGV CAR载体的XhoI位点，以创建JUN-P2A-CAR逆转录病毒载体。对于JUN-AA，引入点突变以将Ser63和Ser73转化为Ala。将大肠杆菌DHFR-DD序列***到Jun的上游以创建JUN-DD构建体。在某些情况下，还将GFP cDNA亚克隆到CAR的上游，以创建GFP-P2A-CAR载体对照。

病毒载体的产生

如前所述，在293GP包装细胞系中产生了逆转录病毒上清液。简而言之，使用Lipofectamine 2000将70％融合的293GP 20cm平板与20ug MSGV载体质粒和10ug RD114包膜质粒DNA共转染。在转染后24和48小时更换培养基。收集48HR和72HR病毒上清液，离心除去细胞碎片，并在-80℃冷冻以备将来使用。如前所述，在293T包装细胞系中产生了第三代自灭活的慢病毒上清液。简而言之，使用Lipofectamine 2000，用18ug pELNS载体质粒和18ug pRSV-Rev、18ug pMDLg/pRRE(Gag/Pol)和7ug pMD2.G(VSVG包膜)包装质粒DNA共转染70％融合的293T 20cm平板。转染后24小时更换培养基。收获24HR和48HR病毒上清液，合并，并通过在28,000RPM下超离心2.5小时进行浓缩。将浓缩的慢病毒原液在-80℃下冷冻以备将来使用。

T细胞的分离

使用RosetteSep人T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)从健康供体中分离原代人T细胞。血沉棕黄层(Buffy coats)购自斯坦福血液中心，并根据制造商的方法使用Lymphoprep密度梯度培养基和SepMate-50管进行处理。将分离的T细胞以每瓶2×10⁷个T细胞冷冻保存在CryoStor CS10冷冻保存培养基(Stem Cell Technologies)中。

CAR T细胞的产生

将冷冻保存的T细胞解冻并在同一天用人T-Expander CD3/CD28 Dynabeads(Gibco)以3:1的珠粒:细胞比率在T细胞培养基(补充有5％FBS、10mM HEPES、2mMGlutaMAX、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的AIMV(Gibco))中活化。以100U/mL提供重组的人IL-2(Peprotech)。在活化后第2天和第3天，用逆转录病毒载体转导T细胞，并将其以0.5-1x10⁶细胞/mL维持在含IL-2的T细胞培养基中。除非另有说明，否则在活化后第10-11天将CAR T细胞用于体外测定或转移到小鼠中。

逆转录病毒转导

将经非组织培养物处理的12孔板用1mL的25ug/mL Retronectin(Takara)PBS溶液在4℃下包被过夜。用PBS洗涤板，并用2％BSA封闭15分钟。以每孔～1mL的速度添加解冻的逆转录病毒上清液，并在32℃以3200RPM离心2小时，随后添加细胞。

细胞系

凯利神经母细胞瘤、EW8尤因氏肉瘤、143b和TC32骨肉瘤细胞系最初从ATCC获得。用GFP和萤火虫荧光素酶(GL)稳定转导了一些细胞系。David Barrett提供了CD19+CD22+Nalm6-GL B-ALL细胞系。通过将Nalm6-GL与GD2合酶和GD3合酶的cDNA共转导而创建Nalm6-GD2。然后选择单个细胞克隆用于高表达GD2。Nalm6-22KO和22low之前已经描述过，并由Terry Fry友情提供。所有细胞系均在完全培养基(补充有10％FBS、10mM HEPES、2mMGlutaMAX、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的RPMI(Gibco))中培养。

流式细胞术

使用人CD22-Fc和Her2-Fc重组蛋白(R&D)检测CD22和Her2 CAR。将独特型抗体和Fc融合蛋白与Dylight488和/或650抗体标记试剂盒(Thermo Fisher)偶联。使用以下抗体评估T细胞表面表型：

来自BioLegend：CD4-APC-Cy7(克隆OKT4)、CD8-PerCp-Cy5.5(克隆SK1)、TIM3-BV510(克隆F38-2E2)、CD39-FITC或APC-Cy7(克隆A1)、CD95-PE(克隆DX2)、CD3-PacBlue(克隆HIT3a)、来自eBioscience：PD1-PE-Cy7(克隆eBio J105)、LAG3-PE(克隆3DS223H)、CD45RO-PE-Cy7(克隆UCHL1)、CD45-PerCp-Cy5.5(克隆HI30)，来自BD：CD45RA-FITC或BV711(克隆HI100)、CCR7-BV421(克隆150503)、CD122-BV510(克隆Mik-b3)、CD62L-BV605(克隆DREG-56)、CD4-BUV395(克隆SK3)、CD8-BUV805(克隆SK1)。

细胞因子的产生

将1x10⁵个CAR+T细胞和1x10⁵个肿瘤细胞在96孔平底板中的200uL CM中培养24小时。对于独特型刺激，使1A7的系列稀释液在Nunc Maxisorp 96孔ELISA平板(ThermoScientific)上于1X包被缓冲液(BioLegend)中交联过夜。用PBS洗涤孔一次，并将1x10⁵个CAR+T细胞在200uL CM中铺板并培养24小时。对于每种条件，一式三份地铺板。收集培养上清液，并通过ELISA(BioLegend)分析IFNg和IL-2。

裂解分析

将5x10⁴个GFP+白血病细胞或2.5x10⁴个GFP+粘附的肿瘤细胞在96孔平底板中与CAR T细胞在200uL CM中共培养长达96小时。对于每种条件，一式三份地铺板。使用IncuCyte ZOOM活细胞分析系统(Essen Bioscience)每2-3小时对板成像一次。在每个时间点以10倍放大收集4张图像。将每孔的总的整合GFP强度评估为对活的GFP+肿瘤细胞的定量测量。将值对起始测量值进行基准化并绘制时间关系图。在图注中示出E:T比。

免疫印迹和免疫沉淀

在非变性缓冲液(150mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-pH8、1％NP-10、0.25％脱氧胆酸钠)中获得全细胞蛋白裂解物。通过Bio-Rad比色测定法估计蛋白质浓度。通过将20μg的蛋白质上样到11％PAGE凝胶上，然后转移到PVF膜上进行免疫印迹。通过增强的化学发光(Pierce)或用Odyssey成像系统检测信号。显示了代表性的印迹。以下使用的第一抗体从Cell Signaling购得：c-Jun(60A8)、P-c-JunSer73(D47G9)、JunB(C37F9)、BATF(D7C5)和IRF4(4964)。BATF3(AF7437)抗体来自R&D。在100mg全细胞蛋白裂解物的150μL非变性缓冲液和7.5mg琼脂结合的抗体c-Jun(G4)或JunB(C11)(Sant Cruz Biotechnology)中进行免疫沉淀。在4℃孵育过夜后，将珠粒用非变性缓冲液洗涤3次，然后将蛋白质在Laemmli样品缓冲液中洗脱、煮沸，然后上样到PAGE凝胶上。用上述试剂和抗体来检测免疫沉淀的蛋白。

小鼠

免疫受损的NOD/SCID/IL2Rg-/-(NSG)小鼠购自JAX，并在实验室内部繁殖。所有小鼠均按照斯坦福大学IACUC(APLAC)批准的方案进行饲养、安置和处理。6-8周龄小鼠通过静脉内(IV)注射接种1x10⁶个Nalm6-GL白血病细胞或通过肌肉(IM)注射接种0.5-1x10⁶个143B骨肉瘤细胞。所有CAR T细胞都静脉内注射。时间和治疗剂量示于图注中。使用IVIS成像系统通过生物发光成像测量白血病的进展。使用Living Image软件分析数值。使用卡尺测量注射的腿部区域来追踪实体瘤的进展。每个实验中每组治疗5只小鼠，每个实验如所示重复2或3次。将小鼠随机分组以确保在CAR T细胞治疗之前具有相等的治疗前肿瘤负荷。

血液和组织分析

在指定的时间点，在异氟烷麻醉下通过眶后采血进行外周血采样。将50μL血液用CD45、CD3、CD4和CD8标记，使用BD FACS裂解液裂解，并使用BD Fortessa流式细胞仪上的CountBright绝对计数珠(Thermo Fisher)进行定量。

ATAC-seq

如前所述⁴⁸制备ATAC-seq文库。简而言之，将来自每个样品的100,000个细胞通过FACS分选到CM中，在4℃下以500g离心，然后重悬于补充有0.1％NP-40、0.1％Tween-20和0.01％洋地黄皂苷的ATAC-seq重悬液(RSB)(10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl₂)中。在所有后续步骤之前，将样品分成两个重复样品。将样品在冰上孵育3分钟，然后用补充有0.1％Tween-20的1mL RSB洗出。细胞核在4℃下以500g沉淀10分钟。将细胞核沉淀重悬于50μL转座混合物(25μl 2x TD缓冲液、2.5μl转座酶(Illumina)、16.5μl PBS、0.5μl 1％digitonin、0.5μl 10％Tween-20、5μl H₂O)中并在30℃下在以1000RPM摇动的热混合器中孵育30分钟。使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒清除反应。

如前所述²⁰，使用NEBNext Hi-Fidelity PCR Master Mix和定制引物(IDT)对文库进行PCR扩增。如qPCR荧光曲线所示²⁰，经过5个PCR循环后，文库已被充分扩增。用QiagenMinElute PCR纯化试剂盒纯化文库，并用KAPA文库定量试剂盒定量。在斯坦福功能基因组学研究所(Stanford Functional Genomics Facility)的Illumina NextSeq上对文库进行测序，配对末端为75bp的读数。使用SeqPurge修剪衔接子序列，并使用bowtie2将其与hg19基因组比对。然后使用Picard工具将这些读数针对线粒体读数、低定位质量(Q>＝20)和PCR重复进行过滤。然后，我们将bam转换为床，并获得Tn5校正的***位点(“+”链+4bp，“-”链-5bp)。为了识别峰，我们使用***床使用MACS2“--shift-75--extsize 150--nomodel--call-summits--nolambda--keep-dup all-p 0.00001”为每个样品调用峰。为了获得一个联合峰集，我们(1)将所有峰顶扩展到500bp，(2)合并所有峰床文件，然后(3)使用床具簇(bedtools cluster)并选择MACS2得分最高的峰。然后通过ENCODE hg19黑名单(https://www.encodeproject.org/annotations/ENCSR636HFF/)对它进行过滤，以去除超出染色体末端的峰。然后，我们使用HOMER注释这些峰，并使用带有chromVARMotifs HOMER集的R中的motifmatchr计算了TF基序的发生。为了创建测序轨迹，我们将经过Tn5校正的***位点读入R，并使用rtracklayer创建每100bp间隔的覆盖率堆积。然后，我们对落在每个峰内的所有***进行计数，以获得计数矩阵(峰值x样本)。为了确定差异峰，我们首先使用标注为“TSS”的峰作为对照基因，或者使用DESeq2的“管家峰”，然后通过此基准化计算差异峰。使用来自DESeq2的规则化对数变换值执行所有聚类。如前所述²¹，使用chromVAR进行转录因子基序偏差分析。使用R中的超几何测试来计算TF基序富集，所述超几何测试测试了亚类峰相对于所有峰的基序表示(来自上述motifmatchr)。

亚类RNA-seq

对于T细胞亚类特异性RNA-seq，如上所述，从健康的供体血沉棕黄层中分离出T细胞。激活之前，使用以下标记物用BD FACSAria细胞分选仪(Stem Cell FACS Core，斯坦福大学医学院)分离初始和中央记忆性CD4+或CD8+亚类：初始(CD45RA+CD45RO-、CD62L+、CCR7+、CD95-和CD122-)，中央记忆(CD45RA-CD45RO+、CD62L+、CCR7+)。将分选的起始群体激活、转导，并如上文所述进行培养。在培养的第7、10和14天，分选CAR+CD4+和CD8+细胞，并使用Qiagen mRNEasy试剂盒分离RNA。由Stanford Functional Genomics Core通过配有Illumina NextSeq的末端平台对样品进行文库制备和测序。

批量RNA-seq(Bulk RNA-seq)

对于批量RNA分离，如所述制备健康的供体T细胞。在培养的第10天或第11天，使用Qiagen RNEasy Plus mini分离试剂盒从2x 10⁶个批量CAR T细胞中分离了总mRNA。通过BGI America(Cambridge，MA)使用单端50bp读长，每个样品30x 10⁶个读次的BGISEQ-500平台，进行批量RNA测序。使用stats软件包执行主成分分析，并使用R(版本3.5)⁴⁹中的ggplot2软件包进行绘图。如之前所述^50,51，使用GSEA软件(Broad Institute)进行基因集富集分析。

单细胞RNA-seq

为了比较单个CD19-CAR和GD2-CAR T细胞中的基因表达，我们在第0天对初始的T细胞亚类进行了分选，用于在第10天使用Chromium平台(10x Genomics)以及根据制造商的说明使用Chromium Single Cell 3’v2试剂盒进行单细胞分析。分别为CD19-CAR和GD2-CAR细胞制备cDNA文库，并且每次运行中将CD4+细胞和CD8+细胞合并在一起，以在下游进行生物信息学分离。在Illumina NextSeq系统上进行测序(配对末端，读数1为26bp，读数2为98bp)，每个单元的读取深度>100,000。将单细胞RNA测序读数比对至基因组参照序列联盟人类构建38(Genome Reference Consortium Human Build 38，GRCh38)，进行批效应标准化，并使用Cell Ranger软件(10X Genomics)过滤细胞事件。总共对804个CD19-CAR和726个GD2-CAR T细胞进行了测序，使每个细胞平均有350,587个基准化后的读数。如之前所述⁵²，使用Cell Ranger R Kit软件(10X Genomics)进一步处理细胞-基因矩阵。简而言之，我们首先在任何给定的细胞中选择具有≥1个唯一分子标识符(UMI)计数的基因。然后对每个细胞将UMI计数对UMI总和进行基准化，然后乘以细胞间的中值UMI计数。接下来，通过对所得数据矩阵取自然对数来转换数据。

统计分析

除非另有说明，否则使用GraphPad Prism7用非配对的双尾t检验在不假设具有一致的SD的条件下对组之间的显著差异进行统计学分析。对于图2C中的批量RNA-seq，使用了非参数威氏配对符号秩次检验。使用对数秩Mantel-Cox检验比较生存曲线。可以在补充材料中找到具有完整的统计分析，包括准确的p值、t比率和dof的表格。

实施例1

T细胞衰竭的基因表达分析

嵌合抗原受体(CAR)的抗原非依赖性递补性信号传导可提升T细胞的分化和衰竭，从而限制其效力。例如，已经描述了GD2特异性CAR在缺乏抗原的情况下自聚集，从而导致慢性下游T细胞活化信号级联反应的活化。虽然集合了CD28共刺激结构域的GD2-CAR迅速发展出T细胞衰竭的标志性特征，而集合了4-1BB共刺激结构域的GD2-CAR尽管具有相似的聚集和信号传导，却显示出较少的T细胞衰竭的证据并保留了更大的功能性。在表达GD2-28z的T细胞中，T细胞衰竭的最显著特征包括抑制性受体(例如PD1、TIM3、LAG3、CD39)的表面表达增加，记忆标志物(例如CD62L和CCR7)的表达减少，以及在抗原刺激时细胞因子的产生(特别是IL2)减少。

在本发明的实施方案的开发过程中进行了实验，以评估衰竭的和未衰竭的T细胞中的基因转录分析。与GD2-BBZ(未衰竭的CAR)相比，在GD2-28Z CAR T细胞中发现了AP-1家族成员的表达减少(参见图1a)。通过RNA测序分析发现，与健康的CD19-28Z CAR T细胞相比，经典的AP-1伴侣FOS和JUN也位于GD2-28Z CAR T细胞中下调最大的基因之中(参见图1b)。转录因子的AP-1家族在TCR信号传导的下游被激活，并调节广泛多样的关键性T细胞功能，包括生长、凋亡、细胞因子产生和效应子功能。在本发明实施方案的开发过程中，进行了其他实验，以评估和表征AP-1家族成员在CAR T细胞中的功能作用(例如，CAR T细胞中AP-1家族成员的缺乏是否有助于形成它们的CAR T细胞表型)。

实施例2

强制表达c-Jun和c-Fos的CAR T细胞的构建

为了确定替换AP-1是否可以缓解GD2-28Z CAR T细胞中的衰竭症状，构建了在组成性启动子下强制表达c-Jun和c-Fos的慢病毒表达构建体(见图2a)。该构建体还编码截短的神经生长因子受体(NGFR(tNGFR))表达盒，作为T细胞转导的表面标志物。随后用CD19、GD2-BBZ或具有(AP-1)或不具有(wo)AP-1表达载体的高亲和力(HA)GD2-28Z CAR转导活化的原代人T细胞。

实施例3

c-Jun和c-Fos在CAR T细胞中的表达

在T细胞培养的第8天，使用NGFR对AP-1转导的CD4或CD8 CAR T细胞进行分选。在CD4(参见图2b)和CD8(参见图2c)CAR T细胞中，AP-1的组成性表达降低了衰竭相关的抑制性受体PD1、TIM3、LAG3和CD39的频率，提升了记忆标志物CD62L的频率。将CAR T细胞在有(AP-1)或没有(wo)AP-1共转导的条件下与表达CD19和GD2抗原的肿瘤细胞共培养，以评估AP-1转导的CAR T细胞的功能变化。在大多数情况下，与没有AP-1转导的CAR T细胞相比，AP-1转导的CAR T细胞释放更多的IL2(参见图2d)和IFNg(参见图2e)。

实施例4

具有强制性c-Jun或c-Fos表达的CAR T细胞

为了评估AP-1表达的功能益处是否需要c-Fos和c-Jun的表达，创建了单独的慢病毒载体，其单独编码c-Jun或c-Fos(参见图3a)。用编码c-Fos或c-Jun的载体转导CAR T细胞。

在用抗原阳性的肿瘤细胞刺激CAR T细胞后，只有表达c-Jun的CAR T细胞导致了IL2升高，而仅c-Fos表达则不足以导致IL2升高(参见图3b)。c-Jun过表达对IFNg分泌的影响相似但没那么大(参见图3c)。为了在单个细胞水平上证实表达c-Jun的CAR T细胞中细胞因子表达的增加，在用抗原阳性的肿瘤细胞刺激T细胞6小时后，通过流式细胞术进行了细胞内细胞因子染色(ICS)。在大多数情况下，发现c-Jun转导的CAR T细胞中IL2(参见图3d)、IFNg(参见图3e)和TNFa(参见图3f)的频率和/或平均荧光强度(MFI)相较于没有c-Jun转导(wo)的CAR T细胞有所升高，而c-Fos转导通常导致与对照相比细胞因子产生的减少。这些数据表明，c-Jun的过表达可以提升CAR T细胞响应抗原刺激的频率以及单个CAR T细胞遇到抗原时产生的细胞因子的水平。

实施例5

共表达来自同一载体的c-Jun和CAR的双顺反子载体的构建

由于c-Jun被显示主要负责AP-1转导的CAR T细胞活性的增加，因此创建了共表达来自同一载体的c-Jun和CAR的双顺反子逆转录病毒载体，c-Jun和CAR被病毒2A核糖体跳过肽序列(ribosomal skipping peptide sequence)隔开(参见图4a)。这些构建体确保了任何CAR+T细胞也可以共表达c-Jun，并且无需共转导和分选即可获得纯的双阳性种群。将八个不同的CAR载体分别克隆到c-Jun骨架中：CD19-28Z、CD19-BBZ、CD22-28Z、CD22-BBZ、GD2-28Zshort、GD2-28ZLong、HA(GD2)-28ZLong和GD2-BBZ，以测试c-Jun的重新表达对多种抗原特异性和肿瘤适应症的功能影响。

c-Jun的表达与大多数CAR组合导致表面衰竭标志物表达降低(参见图4b和5a)。与共表达GFP的对照CAR T细胞相比，在共表达c-Jun的GD2 CAR T细胞中观察到增强的细胞因子分泌(参见图4d-e、5c和6a-b)。

c-Jun介导对白血病(Nalm6-GD2)以及GD2+儿科实体瘤尤因肉瘤(EW8)、骨肉瘤(143B)和神经母细胞瘤(Kelly)应答时细胞因子分泌的增加，从而凸显了c-Jun增强的GD2CAR T细胞的广泛临床适用性。另外，c-Jun的过表达促进了中央记忆CAR T细胞的频率增加(参见图5b)。通过使用细胞内细胞因子染色(ICS)，在CD4+和CD8+c-Jun-CAR T细胞中的单个细胞水平上也观察到了促炎性细胞因子的产生增加(图4c和6c-e)。我们还注意到，与对照相比，还发现c-Jun CAR T细胞中抗炎细胞因子IL10的产生减少(参见图6f)，这表明增强的c-Jun表达可能有助于增强的Th1细胞因子谱。

实施例6

不同CAR T细胞中的c-Jun替换和功能活性

如本申请中所详述，衰竭的CAR T细胞(例如GD2 CAR T细胞)中的c-Jun替换可以改善CAR T细胞中的衰竭。但是，在健康的CD19 CAR T细胞中也观察到了更低的衰竭标志物和更高的功能活性趋势。虽然CD19 CAR T细胞已在B-ALL患者中介导了显著的临床反应，但在高达30％的具有较低或阴性CD19的疾病患者中复发越来越多。CD22 CAR是一种靶向B细胞恶性肿瘤的替代策略，也可能会受到某些患者白血病细胞中CD22抗原密度低的限制。因此，在本发明的实施方案的开发过程中进行了实验，以评估和表征c-Jun-CD19和c-Jun-CD22 CAR T细胞对表达正常(Nalm6)或低抗原表达的肿瘤细胞(对于CD19而言为Nalm6-F和Z，或Nalm6-22low)的活性(参见图7)。

虽然c-Jun并未增强针对Nalm6上高抗原水平的CD19 CAR活性，但在应答CD19-低的Nalm6克隆Z和F时，IL2(参见图7a)和IFNg(参见图7b)有了显著改善。在INCUCYTE免疫细胞杀伤试验中(参见图7c)，将3个GFP+Nalm6细胞系与CAR T细胞共培养92小时。所有4种CD19 CAR均可杀死最初的Nalm6肿瘤(通过GFP强度随时间损失来衡量)。CD19-28Z和c-Jun-CD19-28Z都能够杀死CD19-低的肿瘤细胞克隆F和Z，但是CD19-BBZ CAR T细胞仅具有中等作用。与单独的19-BBZ相比，添加c-Jun-CD19-BBZ CAR T细胞显示出对CD19低克隆的杀伤力显著增加。在应答亲本Nalm6和Nalm622low两者时，观察到共表达c-Jun的CD22 CAR T细胞(特别是CD22-BBZ)的细胞因子分泌增强(参见图7d-e)。

实施例7

抑制AP-1抑制性复合物成员能减少T细胞衰竭

虽然c-Fos和c-Jun的表达增加可以提升经修饰的T细胞的功能，但在衰竭的活化T细胞中还表达有其他抑制性AP-1家族成员。因此，在本发明的实施方案的开发过程中进行了实验，以确定和表征AP-1抑制性复合物成员的抑制/敲除(例如，以提升经典AP-1因子的可用率)是否可以减少T细胞衰竭(例如，提升T细胞功能)。设计了CRISPR-Cas9 gRNA系统以靶向潜在的抑制性AP-1成员。评价了JUNB和BATF3基因编辑(敲除，KO)过的CAR T细胞的细胞因子产生。JUNB的敲除极大地增强了衰竭的HA-GD2-28Z和GD2-BBZ CAR T细胞的IL2和IFNg的产生，但它不影响CD19 CAR T细胞(参见图8A-C)。这表明，JUNB的敲除对衰竭的T细胞(而非健康的T细胞)有积极影响。类似地，与对照编辑的T细胞相比，BATF3的敲除还增加了IL2(而非IFNg)从衰竭的HA-28Z CAR T细胞的产生(参见图8D)。

实施例8

c-Jun修饰的CAR T细胞的体内功效

在几种不同的肿瘤模型中评估了c-Jun修饰的CAR T细胞的体内功效。在被改造成表达GD2的Nalm6白血病模型(N6-GD2)中，表达c-Jun的HA-GD2衰竭的CAR T细胞与未修饰的HA-GD2 CAR T细胞相比显示出优异的有疗效的体内活性(参见图9)。c-Jun修饰的GD2-BBZCAR T细胞在侵袭性骨肉瘤实体瘤模型中显示出优异的体内活性(参见图10)。最后，具有c-Jun表达的CD19 CAR T细胞显示出针对低抗原密度Nalm6-克隆F的增强的体内活性(参见图11)。

实施例9

HA-28z CAR在人T细胞中的表达迅速诱导T细胞衰竭的标志性特征

GD2-28z CAR是人T细胞在表达整合有GD2特异性14g2a scFv、TCRζ和CD28内结构域的CAR后的一种衰竭表型，所述表型是由通过抗原非依赖性聚集介导的递补性信号传导导致的(参考文献9；其全部内容在此参考并入)。在本申请实施方案的开发过程中进行的实验表明，含有具有E101K点突变的14g2a scFv的CAR的表达使得与GD219(HA-28z CAR)发生具有更高亲和力(HA)的相互作用，类似地在人T细胞中诱导了衰竭，但是表型更严重(图12和18a-c)。不同于CD19-28z CAR T细胞，HA-28z CAR T细胞表现出显著的衰竭表型和功能标志，包括培养物中扩增减少(图12a)，抑制性受体PD-1、TIM-3、LAG-3和CD39的表面表达增加(图12b和18d)，过度的效应子分化和较差的记忆形成(图12c和18e)，以及在用CD19+GD2+Nalm6白血病刺激时，IFN-g减少且IL-2的生成显著降低(图12d)。

为了更好地阐明该系统中T细胞衰竭的分子基础，将HA-28z的转录组与CD19-28zCAR T细胞进行了比较。用HA或CD19-28z CAR转导纯化的初始(N)和中央记忆(CM)T细胞，然后在培养的第7、10和14天分离RNA。通过对预先选择的亚类进行分选，可以评估T细胞分化状态以及CD4和CD8衰竭间的差别在该模型的T细胞衰竭发展中的影响。所有24个样本的主成分分析(PCA)表明，变异的最强驱动因素是HA-与CD19-28z CAR的存在(PC1，变化幅度39.3％，图12e)，这与HA-28z CAR T细胞中的递补性信号传导驱动所有研究的T细胞亚类中的衰竭的模型一致。但是，基于起始分化状态观察到了区别，因为在PC2中反应了N与CM的差异(变化幅度22.88％)(图18f)以及CD4与CD8群体之间的差异，其驱动了PC3(变化幅度11.9％)(图12e和18f)。

在驱动PC1的前200个基因(在所有亚类的HA-和CD19-28z CAR T细胞中差异最大)(图12f)中，有与激活(IFNG、GZMB、IL2RA)、抑制性受体(LAG3、CTLA4)和某些炎症趋化因子/细胞因子(CXCL8、IL13、IL1A)相关的基因，而在HA-28z CAR T细胞中下调的基因包括与初始和记忆性T细胞相关的基因(IL7R、TCF7、LEF1和KLF2)。通过使用GSEA，证明了在第10天HA-28z相较于CD19-28z CAR T细胞上调的基因与先前在慢性LCMV小鼠模型中描述¹³的与衰竭相关的基因组重叠(图18g)。虽然GD2-28z CAR T细胞中的衰竭程度不太严重，但是单细胞GD2-28z与CD19-28z CAR T细胞之间的差异基因表达分析揭示了相似的基因表达谱(图19)。这些数据证实表达HA-28z和GD2-28z的T细胞是用于研究人T细胞衰竭的模型。

在小鼠模型和患有慢性病毒感染和癌症的人类患者中，T细胞衰竭与染色质可及性的变化有关(参考文献12,17；在此通过引用全文并入)。使用N或CM衍生的CD4+和CD8+HA-28z与CD19-28z CAR T细胞的ATAC-seq20(图20)进行染色质可及性分析显示，在培养的第10天，表观遗传特征发生了显著变化(图12g)，CD8+HA-28z CAR T细胞显示出>20,000个独特的染色质可及区域(峰)，而CD8+CD19-28z CAR T细胞中为<3,000个独特的峰(FDR<0.1和log₂FC>1)。在CD4+T细胞中，这些衰竭诱导的染色质可及性变化模式比较相似(图21a)。与转录组学分析类似，PCA显示HA-与CD19-CAR是差异性的染色质状态的最强驱动力(PC1变化幅度79.6％，图12h)，而观察到的N与CM细胞之间的(PC2变化幅度7.4％)以及CD4与CD8亚类之间的(PC3变化幅度6.5％)(图21b)差异较弱，但仍是显著性差异。都将前5000个差异最大的可及性区域(峰)聚集在一起，揭示了不论起始亚类如何，在HA-28z CAR T细胞中具有总体上相似的染色质可达性(图12i)。HA-28z CAR T细胞在与衰竭相关的基因(如CTLA4)附近的调控位点表现出较高的染色质可及性，而在与记忆相关的基因(如IL7R)附近的调控位点中的可及性降低(图12j)。

实施例10

表观遗传和转录分析揭示衰竭的CAR T细胞中的强烈的AP-1特征

为了鉴定被预测由在衰竭的T细胞中诱导的表观遗传变化导致失调的转录程序，比较了衰竭的和健康的CAR T细胞开放染色质的转录因子(TF)基序偏差。通过使用ChromVAR分析(参考文献21；其全部内容在此参考并入)，鉴定出了所有8个样品中差异最大的25个基序，发现其中许多基序属于AP-1(bZIP)家族(图13a)。同样，TF基序富集分析揭示了AP-1/bZIP和bZIP/IRF结合基序是衰竭的CAR T细胞中最显著富集的基序(图13b和图21c)。

通过共享的TF基序富集将差异性可及的峰聚类，鉴定出了与衰竭的HA-28z CAR T细胞相关的4个簇(图21d，EX1-EX4)。与衰竭相关的簇包含BTLA、CD39、IFNG和CTLA4等基因附近的峰，表明TF常对衰竭相关基因的调控。所有4个衰竭相关的簇都显示出对AP-1和AP-1相关家族TF的强烈富集，这暗示了AP-1TF对衰竭相关的基因的广泛调控。在某些衰竭簇中还观察到了NFkB、NFAT和RUNX TF家族基序的强富集，这表明衰竭相关基因的亚类可能受到这些转录程序的调控，并重现了在其他模型中观察到的衰竭的表观遗传特征(参考文献12、17、22；通过引用整体并入本申请)。与健康的CD19-28z CAR T细胞(HLT1-2)相关的簇显示出和与初始起始亚类强烈相关的簇的相似的特征。该观察结果与以下观点一致：即健康的CAR T细胞保持与初始来源的T细胞更相似的一种表观遗传学特征，后者是与过继性T细胞疗法中持久性和有效性增强相关的亚类(参考文献23；其全部内容在此参考并入)，而慢性的抗原刺激会导致广泛各异的表观遗传重编程。

与AP-1相关的TF通过在共同bZIP结构域中的相互作用而协调形成多种多样的同二聚体和异二聚体组，并且可以与IRF转录因子二聚体化(参考文献14、24；通过引用整体并入本申请)。AP-1因子复合物竞争结合含有核心TGA-G/C-TCA共有基序的DNA元件。激活复合物，例如包含经典描述的AP-1异二聚体c-Fos和c-Jun的复合物，可以驱动IL-2的转录。相反，其他AP-1和IRF家族成员可以直接拮抗c-Jun的活性和/或驱动T细胞中的免疫调节基因表达(参考文献14、24-29；这些文献通过引用整体并入本申请)。为了评估结合AP-1的染色质的可及性变化是否与激活和抑制性bZIP和IRF TF的可用性增加有关，在本申请实施方案的开发过程中进行了实验，以通过使用RNA-seq比较衰竭的HA-28z和健康的CD19-28z CART细胞中bZIP和IRF家族成员的转录水平。对3个不同供体的配对RNA-seq分析揭示了bZIP和IRF家族成员过表达的一致模式，这方面JUNB、FOSL1、BATF、BATF3、ATF3、ATF4和IRF4最为显著(图13c和图22a)。蛋白质印迹分析证实了HA-相较于CD19 CAR T细胞的JunB、IRF4和BATF3的持续性蛋白质过表达(图13d和图22b)，并且免疫调节性BATF/IRF TF相较于c-Jun显示出更高的表达水平。Jun免疫沉淀物(IP)的蛋白质印迹揭示HA-28z衰竭的CAR T细胞中有几个抑制性家族成员与c-Jun和JunB直接复合，这进一步表明了抑制性bZIP/IRF家族成员水平升高的生物学意义(图22c)。通过对表达CD19-28z与GD2-28z CAR的CD8+T细胞进行单细胞RNA-seq分析比较TF谱，证实了bZIP家族成员JUN、JUNB、JUND和ATF4是衰竭的GD2-28z CAR T细胞网络中表达差异最大且连接最广泛的成员(图13e和图19)。

实施例11

c-Jun的过表达(OE)减少CAR T细胞中的功能衰竭

有证据表明衰竭的CAR T细胞表现出非常差的IL-2的产生(图12d)并优先过表达能驱动免疫调节和衰竭相关程序的bZIP和IRF转录因子，基于此，认为衰竭的细胞中的T细胞功能异常可能归因于驱动IL-2转录所必需的c-Jun/c-Fos异二聚体的相对缺乏。HA-28z和CD19-28z CAR T细胞共转导双顺反子慢病毒载体以过表达c-Jun和c-Fos。经改造以过表达AP-1的HA-28z CAR T细胞证实在抗原刺激后IL-2的产生增加(图23a-c)。但是，在HA-28zCAR T细胞中仅在c-Jun OE时观察到使用单一表达载体能增强功能性，而用c-Fos单表达载体转导并没有产生一致的功能改善(图23d-e)。

为了进一步研究c-Jun增强衰竭的CAR T细胞功能的潜力并确保所有表达CAR的T细胞中的组成性c-Jun表达，创建了双顺反子载体，所述载体共表达由病毒P2A跳过肽(viral P2A skipping peptide)隔开的c-Jun和CAR转基因(JUN-CAR，图14a)。这些表达载体提升了CD19和HA-28z CAR T细胞中的c-Jun表达(图14b)，尽管c-Jun优先在JUN-HA CART细胞中被激活(磷酸化)(图14c)，这与在经由由HA-28z CAR30传播的递补TCR信号级联反应下游被激活的JNK蛋白导致的c-JNK N末端磷酸化(JNP)相一致。在受到GD2+肿瘤细胞系的刺激后，与对照HA-28z CAR T细胞相比，JUN-HA-28z CAR T细胞的IL-2和IFNg产量显著增加(图14d-e)。JUN-HA CAR T细胞在c-Jun OE条件下细胞因子产生的倍数增加比JUN-CD19 CAR T细胞显著更大(图24a-b)。同样，与HA-28z CAR T细胞相比，JUN-HA CAR T细胞显示出SCM/CM相对于E/EM亚类的更高的频率(图14f)，而在培养第10天时，在CD19和JUN-CD19 CAR T细胞之间未观察到亚类组成的显著差异。总之，这些数据与这样的模型一致：其中c-Jun OE在过表达抑制性bZIP和IRF TF的衰竭的T细胞中在功能上更为重要。

为了评估c-Jun OE是否能增强与实体瘤中的抗肿瘤效应相关的长期增殖能力(参考文献31；其全部内容在此参考并入)，并测试c-Jun OE是否能增强没有递补性信号传导的CAR T细胞中的(CD19-28z、CD19-BBz)或递补性信号传导水平较低的CAR T细胞(GD2-BBz)中的功能，在延长的时间段内从3个不同的健康供体中测量了JUN-CAR T细胞的体外扩增(图24c)。在c-Jun OE存在的情况下，观察到了一致的长期增殖能力增强模式，该模式保持对IL-2的依赖，因为这些细胞在没有IL-2的情况下立即停止了扩增(图14g)。与c-Jun诱导抗衰竭的能力相一致，晚期扩增的CD8+JUN-CD19-28z CAR T细胞相较于在同一时间点测试的对照CD19-28z CAR T细胞显示出衰竭标志物的表达减少，并维持带有干细胞记忆(SCM)表型的稳健的细胞亚类(CD45RA+CD62L+)(图14h-j)。评估了过继转移至无肿瘤NSG小鼠体内的JUN-CAR T细胞的稳态扩增。在输注后的第25天，与对照组相比，经JUN-CD19-28z和JUN-CD19-BBz CAR T细胞治疗的小鼠中外周血T细胞数量均有所增加(图14k)，这导致了经JUN-CD19-BBz CAR T细胞治疗的小鼠中的GVHD加速。数据共同表明，c-Jun OE可以缓解众多测试的CAR(包括整合了CD28或4-1BB共刺激域的CAR)中的T细胞衰竭，并且与衰竭是由强制的长期扩增还是递补性信号传导所驱动无关。

实施例12

c-Jun介导的挽救CAR T细胞衰竭的分子要求

在本申请的实施方案的开发过程中进行了实验，以确定c-Jun OE是否可以通过两种互不排斥的不同机制挽救衰竭的T细胞。c-Jun OE可以通过提升Fos/Jun或Jun/Jun二聚体的可用性直接增强AP-1介导的基因转录，或者可以通过破坏驱动衰竭相关基因的表达的抑制性AP-1/IRF转录复合物(AP-1-i)^14,24间接起作用(图15a)。为了更好地了解c-Jun OE缓解T细胞衰竭的机制，将源自大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)的去稳定结构域(DD)融合至c-Jun的N末端，以暂时调节c-Jun的表达(JUN-DD，图15b)。在存在细胞可渗透小分子甲氧苄啶(TMP)的情况下，DD是稳定的并导致稳定的c-Jun表达，但在没有TMP的情况下，DD失去稳定，从而导致整个融合蛋白的蛋白酶体降解(图15c)。在存在TMP时，JUN-DD CAR T细胞迅速提升c-Jun的表达(在暴露于药物后的6.76小时时为最大值的1/2)，而在没有TMP的情况下，JUN-DD迅速变得无法被检测到(t_1/2为1.84小时)(图15d和图25a-b)。JUN-DD-CAR T细胞仅在存在TMP的条件下介导IL-2和IFNg产生的增加，证实了c-Jun水平在调节CAR T细胞功能中的关键作用(图15e)。有理由认为，c-Jun对转录的直接效应可以很快实现，因此测试了当将HA-28z CAR T细胞中的c-Jun OE限制在急性抗原刺激期间时是否会发生功能性挽救(OFF-ON)。相反，如果在诱导衰竭的过程中，c-Jun OE有必要与AP-1抑制性复合物(AP-1i)竞争，则在T细胞扩增期间可能需要更长时间的暴露(ON-OFF)(图15f)。与从未经历过c-JunOE(OFF-OFF)的HA-28z CAR T细胞相比，这两种情况都介导了部分挽救，但是，IL-2功能的完全挽救需要在T细胞扩增和抗原刺激过程中均有c-Jun OE(ON-ON)(图15g)。该发现与以下模型一致：在该模型中，c-Jun OE不仅在遇到抗原后的下游的急性刺激过程中直接增强基因转录，而且在衰竭发展过程中间接调节分子重编程。另外，在c-Jun过表达(图25c-d)以及通过IP减少JunB/BATF复合物(图25e)时，观察到JUNB和BATF/BATF3家族成员的蛋白质和mRNA表达均降低。

c-Jun介导的AP-1抑制性复合物破坏的间接模型应独立于直接的c-Jun转录激活。为了测试直接的c-Jun介导的基因激活对于T细胞衰竭的功能挽救是否必要，创建了JNP缺陷型c-Jun，其在c-Jun反式激活结构域中用丙氨酸取代了Ser63和Ser73以防止这些位点处的磷酸化(c-JunAA)，所述磷酸化已被证明对c-Jun介导的基因转录很重要(参考文献33、34；这些文献通过引用整体并入本申请)(图15h-i)。与野生型JUN-CAR T细胞相比，JUNAA-HA-28z CAR T细胞表现出同等的IL-2和IFNg产量增加(图25j)。总的来说，此数据与c-Jun介导的衰竭挽救不需要直接的基因激活的模型是一致的。

实施例13

JUN-CAR T细胞在体内介导增强的抗肿瘤活性

在本申请的实施方案的开发过程中进行了实验，以确定JUN-CAR T细胞是否会表现出增强的体内活性。将Nalm6-GD2+白血病细胞移植到小鼠中，并在第3天用对照HA-28z或JUN-HA-28z CAR T细胞进行处理。虽然HA-28z CAR T细胞表现出一定的抗肿瘤活性，但治疗最终由于所有小鼠死于疾病而失败(中位生存期d59)。相反，JUN-HA-28z CAR T细胞在第24天介导了肿瘤的完全消退，并提供了长期的无肿瘤存活(图16a-c)。为了解决c-Jun OE是否可以增强靶向实体瘤的CAR的功能，使用整合了4-1BB共刺激结构域的靶向Her2和GD2的CAR评价了JUN-CAR的效应，所述4-1BB共刺激结构域已成为赋予长期持久性的优选信号域(参考文献35-37；这些文献通过引用整体并入本申请)。在对143b骨肉瘤的长期体外杀伤试验中，JUN-Her2-BBz CAR T细胞在1:8的效应物:靶(E:T)比率时表现出显著更强的杀伤活性，这与基于每个细胞的效力增强一致(图16d-e)。同样地，JUN-Her2-BBz CAR T细胞阻止了体内肿瘤的生长，并导致长期存活率显著提高，这与体内T细胞扩增的增加有关(图16f-h)。当针对143b骨肉瘤比较GD2-BBz和JUN-GD2-BBz CAR T细胞时，观察到相似的结果(图26)，证实了c-Jun OE在应答实体瘤的CAR T细胞和整合了4-1BB信号域的CAR T细胞中的益处。

实施例14

c-Jun的过表达降低了CAR T细胞活化阈值，并允许识别具有较低抗原密度的肿瘤细胞

衰竭的CAR T细胞中抑制性AP1家族成员水平的升高提出了这样的观点，即，衰竭的CAR T细胞中的功能障碍至少部分地与更高的激活阈值有关，这可以通过修复激活性与抑制性AP1家族成员的平衡来恢复正常。为了测试这一点，比较了HA-CAR和JUN-HA-CAR T细胞在对与板结合的1A7(一种结合14g2a scFv的抗独特型抗体)的系列稀释液应答时的细胞因子的产生，从而可以控制刺激强度。c-Jun OE大大增强了IL-2和IFNg的最大产量，并且还大大降低了诱导IL-2分泌所需的1A7的量，这与JUN-HA-CAR T细胞的活化阈值降低是一致的(图17a-b)。

越来越认识到限制肿瘤细胞上靶抗原的表达水平能限制CAR功能性(参考文献5、6、38；这些文献通过引用整体并入本申请)。最近有报道说，对CD22 CAR疗法产生最初反应后，白血病患者CD22dim复发。由于c-Jun OE降低了HA-28z CAR T细胞中递补性信号传导的激活阈值，因此评估了JUN-CAR是否会识别并杀死具有较低抗原密度的肿瘤细胞，所述较低抗原密度的肿瘤细胞可能逃避了对照CAR T细胞的识别。当用CD22low白血病细胞(图17d)攻击JUN-CD22-BBz CAR T细胞(图17)时，JUN-CAR T细胞表现出体外细胞因子产生的增加(图17e)以及体内抗肿瘤活性的急剧增加(图17f-i)。当以3x10⁶个CAR T细胞的剂量给予时，对照CD22-BBz CAR T细胞表现出初始活性，但是这种治疗最终未能控制肿瘤的生长(平均存活d45)。相反，JUN-CD22-BBz CAR T细胞介导了显著的抗肿瘤效应，并且是完全有疗效的。因此，c-Jun OE在4种肿瘤模型中显示出显著改善的抗肿瘤控制，并且与改善的扩增、抗衰竭和改善识别低抗原靶标的能力有关。

实施例15

截短的JUN蛋白

在本申请的实施方案的开发过程中进行了实验，以确定负责介导挽救功能性T细胞的JUN的必要结构域。产生了一系列缺失了多个结构域的JUN突变体(图27a)。具有N末端缺失和截短的JUN突变(JUN-AA、JUN-Dd和JUN-DTAD)保持了其挽救HA-28z衰竭的CAR T细胞功能的能力，而ε和bZIP结构域中的C末端突变是非功能性的挽救。JUN-AA、JUN-Dd和JUN-DTAD构建体与JUN-WT相比保留了相等的细胞因子产量增长(图27b，d)，与JUN-De、JUN-Dbasic、JUN-DLeu和JUN-DbZIP突变相比改善了在低E:T比率时的长期杀伤力(图27c)。与它们改善的体外功能活性相一致的是，输注到患有N6-GD2白血病的小鼠中时，表达JUN-WT和JUN-DTAD的HA-28z CAR T细胞与JUN-DLeu和JUN-DbZIP相比显示出更高的体内增殖。

实施例16

IRF4的敲除显著提升衰竭的HA-28z CAR T细胞的功能活性。

进行了针对9种不同的bZIP/IRF家族组分来优化CRISPR gRNA的实验，并测试了敲除以挽救衰竭的HA-28z CAR T细胞功能活性(细胞因子分泌)的能力。图28提供了显示使用健康供体的3-6次独立实验的结果的汇总数据。如图28所示，虽然JunB和BATF3敲除改善了某些供体的功能活性，但IRF4敲除显著改善了所有测试的供体中经刺激的HA-28z CAR T细胞的IL-2分泌(左和中)。IRF4-KO CAR T细胞甚至显示出来自递补性信号传导的IL-2基线分泌的改善。

实施例17

转录突变体(JUN-AA)还能挽救CD19 CAR T细胞的功能活性和增殖能力。

进行了涉及在CD19 CAR T细胞中创建JUN-AA突变的实验。JUN-AA保留了针对低抗原密度的增强的反应性(图29A)以及在培养物中的增强的长期增殖(图29B)。在体内，c-Jun证实了经低剂量“压力测试”剂量的CD19 CAR T细胞治疗的Nalm6-白血病小鼠的存活率提高(图29C)。

实施例18

c-Jun修饰的HA-28z CAR T细胞的体内功能增强不能通过离体提供IL-2来复制。

虽然IL-2的产生是抗衰竭细胞的极佳的生物标志物，但JUN-CAR T细胞的功能增强无法仅靠IL-2来复制(图30)。在肿瘤植入后第7、9、11、13和15天以腹膜内的方式给予250,000IU/小鼠。在第7天静脉内给予1x10⁶个CAR+T细胞。图30显示了具有相似发现的3个独立实验的代表。

实施例19

c-Jun在抑制性实体瘤微环境中增强了Her2-BBz CAR T细胞的活性。

JUN-CAR T细胞在体内显示出减少的衰竭和增强的功能活性。通过肌肉注射将143B骨肉瘤异种移植物植入NSG小鼠。在可测量实体瘤块后(肿瘤接种后第14天)，静脉给予1x10⁷个Her2-BBz对照(蓝色)或JUN-Her2-BBz(红色)CAR T细胞。图31A显示，JUN-Her2-BBzCAR T细胞介导了已建立的大的143B实体瘤的消退，而Her2-BBz CAR T细胞相较于模拟的未转导T细胞未显示出任何控制。T细胞注射后两周(在JUN小鼠中肿瘤被完全消灭之前)，对小鼠实施安乐死并提取实体瘤组织并进行机械分离(每组n＝6-8只小鼠)。图31B显示来自经JUN治疗的小鼠的实体瘤消化物包含显著更高的CD8+T细胞百分比(全部活细胞的频率)，并保留了更高频率的CAR+CD8+T细胞。图31C显示了定位于肿瘤的CD8+T细胞在JUN-Her2-BBz中表现出与衰竭相关的抑制性受体PD-1和CD39的表达(以及共表达)减少(每组n＝6只小鼠，左边)(代表性的流动图(flow plot)位于右边)。

接下来进行实验，通过用Nalm6-Her2+靶细胞进行离体再刺激来评估定位于肿瘤的CAR T细胞的功能能力(图31D和E)。如图31D所示，用5x10⁴个靶细胞再次刺激5x10⁴个FACS分选的CD45+T细胞，并在24小时后通过ELISA测量IL-2的分泌。如图31E所示，在存在莫能菌素和CD107a抗体的条件下，用3x10⁵个Nalm6-Her2+的分离T细胞对3x10⁵个单细胞肿瘤消化物再次刺激6小时。6小时之后，通过细胞内细胞因子染色评估CD107a、IL-2、IFNγ和TNFα的单细胞产生。与Her2-BBz对照相比，经离体刺激的JUN-Her2-BBz CAR T细胞展示出频率显著更高的产生CD107a、IL-2、IFNγ、TNFα的细胞以及产生双细胞因子的细胞。

实施例20

c-Jun的过表达增加了对衰竭性HA-28z CAR T细胞的TGFβ介导的抑制的抗性。

在存在或不存在5nM TGFβ的情况下，用Nalm6-GD2靶细胞刺激对照和JUN-WT或JUN-AA修饰的HA-28z CAR T细胞。如图32左图所示，通过ELISA测量了IL-2的分泌，显示了一个代表性供体。如图32右图所示，在TGF+条件下比在没有TGF的条件下的IL-2的分泌成倍减少(n＝来自3个独立实验的3个独立供体)。

实施例21

c-Jun修饰的细胞中的转录变化与衰竭减少和记忆形成增加是一致的。

图33A显示了在添加c-Jun过表达后，在衰竭的HA-28z CAR中差异调节的基因的热图(c-Jun下调了193个基因，c-Jun上调了176个基因，p(adj)<0.05。n＝3个独立供体)。目的基因突出显示在右侧。在Jun细胞中下调的基因包括抑制性受体(LAG3、ENTPD1)和其他潜在的AP-1抑制性家族成员(BATF3、JUNB)以及与衰竭相关的其他基因(IL13、GZMB、LTA、TNFRSF9)。经c-Jun上调的基因与初始和记忆T细胞相关(IL7R、SELL(CD62L)、CD44和转录因子LEF1和FOXP1)。

图33B描绘了显示在c-Jun-HA-28z CAR T细胞中下调的基因与PC1中驱动衰竭的基因的重叠的Venn图，而图33C显示在c-Jun中上调的基因与健康(CD19)CAR T细胞相关的基因重叠(下部)。驱动健康T细胞与衰竭T细胞之间差异的前列基因中的约25％可被c-Jun的过表达调节，这表明AP-1家族可能占该模型衰竭表型的～25％。

图33D示出了显示来自b-c的重叠区域中的50个基因在所有12个样品中的基因表达(每种条件n＝3个供体)。

表2提供了被c-Jun改变的基因的完整列表。

表2

实施例22

抑制IRF4可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF4抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF4抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例23

抑制IRF8可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF8抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF8抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例24

抑制BATF可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示BATF抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用BATF抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例25

抑制BATF3可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示BATF3抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用BATF3抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例26

抑制JUNB可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示JUNB抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用JUNB抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例27

抑制IRF1可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF1抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF1抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例28

抑制IRF2可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF2抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF2抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例29

抑制IRF3可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF3抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF3抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例30

抑制IRF5可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF5抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF5抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例31

抑制IRF6可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF6抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF6抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例32

抑制IRF7可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF7抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF7抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

实施例33

抑制IRF9可减少T细胞衰竭

使对照T细胞和衰竭T细胞与有效量(0.1-1000μM)的表1所示IRF9抑制剂接触。收集样品并进行处理，以进行细胞因子和干扰素产生的分析。与对照T细胞相比，在用IRF9抑制剂处理的衰竭T细胞中观察到了细胞因子IL2和/或干扰素IFNγ产生的增加。

以上说明书中提到的所有出版物和专利都通过引用并入本申请。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员应是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地受限于这样的特定实施方案。事实上，对于相关领域的技术人员来说显而易见的对用于实施本发明的所述方式的各种修改都在所附权利要求的范围之内。

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以下参考文献通过引用整体并入本申请，其中一些参考文献在上文中通过数字进行引用(例如，参考文献X)。

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