一种铱(iii)聚吡啶复合脂质体及其在抗肿瘤药物中的应用
阅读说明：本技术 一种铱(iii)聚吡啶复合脂质体及其在抗肿瘤药物中的应用 (Iridium (III) polypyridine composite liposome and application thereof in antitumor drugs ) 是由 刘四红 谢富丽 伍勇 刘云军 白兰 朱建伟 徐绘华 于 2021-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,具体公开了一种铱(III)聚吡啶复合脂质体及其在抗肿瘤药物中的应用。铱(III)聚吡啶复合脂质体包含铱(III)聚吡啶聚合物,铱(III)聚吡啶聚合物的通式如式(I)所示。铱(III)聚吡啶聚合物可以抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞在G0/G1期停滞、自噬,降低线粒体膜电位并增加ROS含量,从而促进肿瘤细胞凋亡；本发明的铱(III)聚吡啶复合脂质体通过引起线粒体功能障碍和激活PI3K/AKT信号通路,可以更强烈地抑制肿瘤细胞的生长,并且具有更好的抗肿瘤作用。(The invention relates to the technical field of biological medicines, and particularly discloses an iridium (III) polypyridine composite liposome and application thereof in antitumor medicines. The iridium (III) polypyridine composite liposome comprises an iridium (III) polypyridine polymer, and the general formula of the iridium (III) polypyridine polymer is shown as a formula (I). The iridium (III) polypyridine polymer can inhibit the proliferation of tumor cells, induce the arrest and autophagy of the tumor cells in the G0/G1 phase, reduce the mitochondrial membrane potential and increase the ROS content, thereby promoting the apoptosis of the tumor cells; the iridium (III) polypyridine complex liposome can more strongly inhibit the growth of tumor cells by causing mitochondrial dysfunction and activating a PI3K/AKT signal pathway, and has better anti-tumor effect.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种铱(III)聚吡啶复合脂质 体及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
胃癌是世界上排名第五位的恶性肿瘤，近一半的胃癌病例和一半以上的胃 癌死亡病例发生在亚洲。对于晚期胃癌患者，化疗是提高生活质量和延长生存 期的重要方法。尽管化疗是多种癌症的常用治疗方法，但其副作用，毒性和耐 药性极大地限制了其临床应用。1965年，Barnett Rosenberg及其同事首先指出 铂(IV)复合物可抑制细胞分裂，后来发现顺铂具有抗肿瘤活性，但是铂类药 物水溶性差，缓解期短，排泄缓慢，并伴有严重毒副作用，长期使用会产生耐 药性。顺铂的临床成功应用极大鼓舞了研究人员探索其他金属抗癌化合物。在 过去的几十年中，研究人员越来越热衷于过渡金属配合物的研究。铱是排名第三的低自旋d6金属离子，其结构和电子与顺铂相似。近年来，铱配合物因其低 副作用，良好的光物理性质和抗肿瘤活性而被认为是潜在的抗癌金属药物。
随着纳米技术的发展，纳米级药物的递送越来越受到关注。铱配合物可以 负载在纳米颗粒、胶束和脂质体中，以发挥最大的抗肿瘤作用。脂质双层或其 脂质体的亲水和疏水区室可以通过多种配体或功能进行修饰，以增加通透性和 增强(EPR)效果，被广泛用于靶向药物递送。
目前，铱配合物对肿瘤细胞的抑制作用还较弱，因此，还有改善空间。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种铱(III)聚吡 啶聚合物及铱(III)聚吡啶复合脂质体，铱(III)聚吡啶聚合物可以抑制细胞 增殖，诱导肿瘤细胞在G0/G1期停滞、自噬，降低线粒体膜电位并增加ROS含 量，从而促进细胞凋亡；铱(III)聚吡啶复合脂质体通过引起线粒体功能障碍 和激活PI3K/AKT信号通路，可以更强烈地抑制肿瘤细胞的生长，并且具有更 好的抗肿瘤作用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种铱(III)聚吡啶聚合物，所述铱(III)聚吡 啶聚合物的通式如式(I)所示：
R1、R2为H原子或共同形成苯环；R3、R4为氢原子或共同形成苯环。
作为本发明所述铱(III)聚吡啶聚合物的优选实施方式，所述铱(III)聚 吡啶聚合物的化学式为[Ir(ppy)2(BIP)]PF6或[Ir(piq)2(BIP)]PF6，其中 [Ir(ppy)2(BIP)]的结构式为式(II)所示，[Ir(piq)2(BIP)]+的结构式为式(III)所示；
其中，ppy为2-phenylpyridine，piq为1-苯基异喹啉，BIP为2-([1,1'-联 苯]-4-基)-1H-咪唑并[4,5-f][1,10]菲咯啉。
第二方面，本发明提供了一种铱(III)聚吡啶聚合物的制备方法，包括以 下步骤：
(1)合成BIP配体
在冰乙酸中加入1,10-菲啰啉-5,6-二酮、4-苯基苯甲醛和醋酸铵，加热回流， 冷却，用氨水调pH值至中性，沉淀析出，抽滤得到米黄色固体，干燥，得BIP 配体；
(2)合成铱(III)聚吡啶聚合物[Ir(ppy)2(BIP)]PF6
将步骤(1)制备的BIP配体与Cis-[Ir(ppy)2Cl]2混合溶于二氯甲烷和甲醇的 混合溶剂中，加热回流，冷却，加入过量的六氟磷酸胺搅拌，抽滤得滤液I，滤 液I进行减压旋蒸，得固体混合物，将固体混合物溶于二氯甲烷中，抽滤，得滤 液II，再将滤液II旋蒸减压，得酒红色固体粗产物，将酒红色固体粗产物真空 干燥，纯化，洗脱，收集橘黄色产物，制得铱(III)聚吡啶聚合物[Ir(ppy)2(BIP)]PF6；
或者，
(2)合成铱(III)聚吡啶聚合物[Ir(piq)2(BIP)]PF6
将步骤(1)制备的BIP配体与Cis-[Ir(piq)2Cl]2混合溶于二氯甲烷和甲醇的 混合溶剂中，加热回流，冷却，加入过量的六氟磷酸胺搅拌，抽滤得滤液III， 滤液III进行减压旋蒸，得固体混合物，将固体混合物溶于二氯甲烷中，抽滤， 得滤液IV，再将滤液IV旋蒸减压，得酒红色固体粗产物，将酒红色固体粗产物 真空干燥，纯化，洗脱，收集酒红色固体产物，制得铱(III)聚吡啶聚合物 [Ir(piq)2(BIP)]PF6。
作为本发明所述铱(III)聚吡啶聚合物的制备方法的优选实施方式，所述 BIP配体与Cis-[Ir(piq)2Cl]2的摩尔比为1:0.5，所述BIP配体与Cis-[Ir(piq)2Cl]2的摩尔比为1:0.5。
更优选地，二氯甲烷和甲醇混合的体积为2:1。
第三方面，本发明提供了一种铱(III)聚吡啶复合脂质体，包含上述铱(III) 聚吡啶聚合物。
作为本发明所述铱(III)聚吡啶复合脂质体的优选实施方式，所述铱(III) 聚吡啶复合脂质体还包括卵磷脂，胆固醇和DSPE-MPEG。
作为本发明所述铱(III)聚吡啶复合脂质体的优选实施方式，所述铱(III) 聚吡啶复合脂质体采用乙醇注入法制备而成。
第四方面，本发明提供了上述铱(III)聚吡啶聚合物在制备抗肿瘤药物中 的应用。
第五方面，本发明提供了上述铱(III)聚吡啶复合脂质体在制备抗肿瘤药 物中的应用。
第六方面，本发明提供了上述的铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶 复合脂质体在制备抗SGC-7901肿瘤药物中的应用。
采用MTT法检测肿瘤细胞(A549，HepG2，SGC-7901，Bel-7402，HeLa) 和正常细胞(NIH3T3)，结果表明本发明的铱(III)聚吡啶复合脂质体对SGC-7901 的细胞毒性最强，IC50值为5.8±0.2μM。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明提供的铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体可以 抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞在G0/G1期停滞、自噬，降低线粒体膜电 位并增加ROS含量，从而促进肿瘤细胞的凋亡。
2)铱(III)聚吡啶聚合物[Ir(ppy)2(BIP)]PF6和[Ir(piq)2(BIP)]PF6的产率分 别为72％和78％；
3)本发明的铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体在A549， HepG2，SGC-7901，Bel-7402，HeLa和NIH3T3细胞中均显示出明显的细胞活 性，铱(III)聚吡啶复合脂质体对SGC-7901细胞的毒性最强，IC50值为5.8± 0.2μM。
附图说明
图1为本发明铱(III)聚吡啶聚合物主要合成线路图；
图2为本发明铱(III)聚吡啶复合脂质体的粒径图；
图3为本发明铱(III)聚吡啶复合脂质体悬浮液的外观状态图；
图4为本发明铱(III)聚吡啶复合脂质体悬浮液的体外释放曲线图；
图5为本发明铱(III)聚吡啶复合脂质体的胞吞实验结果图I；
图6为本发明铱(III)聚吡啶复合脂质体的胞吞实验结果图II；
图7为本发明铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体抑制肿 瘤细胞增殖的结果图；
图8为本发明铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体影响肿 瘤细胞中FAK蛋白(125KD)的表达情况图；
图9为本发明铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体处理癌 细胞在G0/G1期的分布图；
图10为本发明铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体诱导细 胞周期停滞并影响细胞周期蛋白CD4和p21的表达图；
图11为采用膜联蛋白-V/PI双重染色定量分析不同浓度的铱(III)聚吡啶 聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体对SGC-7901细胞的凋亡诱导结果图；
图12为本发明铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体处理肿 瘤细胞后凋亡蛋白的表达图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一种铱(III)聚吡啶聚合物，该铱(III)聚吡啶聚合物的化学式为 [Ir(ppy)2(BIP)]PF6或[Ir(piq)2(BIP)]PF6，其中[Ir(ppy)2(BIP)]的结构式为式(II) 所示，[Ir(piq)2(BIP)]+的结构式为式(III)所示；
实施例1、铱(III)聚吡啶聚合物的制备
(1)合成BIP配体
精确称量0.42g(2mmol)的1,10-菲啰啉-5,6-二酮、0.3644g(2mmol)的4-苯 基苯甲醛和3.08g(40mmol)的醋酸铵，然后放置在反应瓶中，并加入20mL 的冰乙酸充分混合均匀，130℃加热回流2h。待反应结束，反应瓶冷却至室温后， 将溶液转移至烧杯中，使用氨水调PH至中性，有沉淀析出，经真空抽滤后得到 米黄色固体，真空干燥后得BIP配体，BIP配体的产率为83％。
(2)合成铱(III)聚吡啶聚合物[Ir(ppy)2(BIP)]PF6
准确称取BIP配体(0.1862g，0.5mmol)与Cis-[Ir(ppy)2Cl]2(0.268g，0.25mmol)，从一侧加入到三颈瓶中，然后制备二氯甲烷和甲醇(体积比为2：1)混合液， 并加入三颈瓶中混合均匀；在氩气保护条件下，40℃加热回流6h；待反应结束， 反应瓶冷却至室温，接着加入过量的六氟磷酸胺，搅拌30min；然后对反应溶液 进行抽滤，二氯甲烷将布氏漏斗润洗至无色，得到的滤液I进行减压旋蒸，得固 体混合物；接着加入适量的二氯甲烷溶液对固体混合物进行充分溶解和润洗， 对反应液进行再次抽滤，获得滤液II，最后减压旋蒸后将滤液II除去，得到酒 红色固体粗产物，真空干燥后待用；之后通过中性氧化铝柱进一步纯化，使用 二氯甲烷:丙酮(1:3，v/v)为洗脱剂，收集中间橘黄色目的条带液体，减压旋蒸后 制得铱(III)聚吡啶聚合物[Ir(ppy)2(BIP)]PF6(命名为Ir1)。[Ir(ppy)2(BIP)]PF6 的产率为72％，Anal.Calcd for C47H32N6IrPF6.1H NMR(DMSO-d6,500MHz): δ9.16(d,2H,J＝8.0Hz),8.41(d,2H,J＝8.5Hz),8.26(d,2H,J＝8.0Hz),8.10(d, 2H,J＝5.0Hz),8.02(dd,2H,J＝5.0,J＝5.0Hz),7.95(d,2H,J＝7.5Hz),7.90(d, 2H,J＝8.0Hz),7.87(d,2H,J＝7.0Hz),7.98(d,2H,J＝7.5Hz),7.52(dd,4H,J＝ 7.0,J＝6.0Hz),7.42(t,1H,J＝7.5Hz),7.06(t,2H,J＝8.5Hz),7.00(t,2H,J＝7.0 Hz),6.95(t,2H,J＝7.5Hz),6.30(d,2H,J＝7.0Hz).13C NMR(DMSO-d6,125 MHz):168.98,152.68,151.04,149.59,146.06,145.74,142.99,141.40,140.66, 134.06,133.27,132.26,131.08,129.89,129.18,129.08,128.68,128.60,127.05, 125.83,124.33,121.96.HRMS(CH3CN):m/z＝873.5396[(M-PF6)+]。
或者，
(2)合成铱(III)聚吡啶聚合物[Ir(piq)2(BIP)]PF6
准确称取BIP配体(0.1862g，0.5mmol)与Cis-[Ir(piq)2Cl]2(0.268g，0.25mmol)，从一侧加入到三颈瓶中，然后制备二氯甲烷和甲醇(体积比为2：1)混合液， 并加入三颈瓶中混合均匀；在氩气保护条件下，40℃加热回流6h；待反应结束， 反应瓶冷却至室温，接着加入过量的六氟磷酸胺，搅拌30min；然后对反应溶液 进行抽滤，二氯甲烷将布氏漏斗润洗至无色，得到的滤液III进行减压旋蒸，得 固体混合物；接着加入适量的二氯甲烷溶液对固体混合物进行充分溶解和润洗， 对反应液进行再次抽滤，获得滤液IV，最后减压旋蒸后将滤液IV除去，得到酒 红色固体粗产物，真空干燥后待用；之后通过中性氧化铝柱进一步纯化，使用 二氯甲烷:丙酮(1:3，v/v)为洗脱剂，收集酒红色固体产物，减压旋蒸后制得铱(III) 聚吡啶聚合物[Ir(piq)2(BIP)]PF6(命名为Ir2)。产率为78％，Anal.Calcd forC55H36N6IrPF6.1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ9.16(d,2H,J＝8.0Hz),9.02 (d,2H,J＝8.0Hz),8.41(t,4H,J＝6.5Hz),8.00-7.94(m,6H),7.87(d,6H,J＝6.0 Hz),7.77(d,2H,J＝7.0Hz),7.51(t,2H,J＝7.5Hz),7.44(d,2H,J＝6.5Hz),7.40 (d,3H,J＝6.5Hz),7.17(t,2H,J＝7.0Hz),6.96(t,2H,J＝8.0Hz),6.31(d,2H,J＝ 7.5Hz).13C NMR(DMSO-d6,125MHz):169.91,156.20,149.26,147.38,145.45, 142.65,141.49,138.49,134.07,134.01,133.73,132.61,132.53,131.36,131.06, 129.68,129.06,128.63,128.43,127.58,124.28,124.17.HRMS(CH3CN):m/z＝ 973.5829[(M-PF6)+]。
上述过程的主要合成线路为图1所示。
实施例2、铱(III)聚吡啶复合脂质体的制备
准确称取卵磷脂30mg(60mg/ml，500μL)、胆固醇6mg、DSPE-MPEG2000 5mg和实施例1制备的铱(III)聚吡啶聚合物1mg(1mg/ml，1ml)，超声使其 完全溶解；然后，在55℃环境下使用微量进样器将溶液匀速注入PBS(5ml， pH＝7.4)中，并且磁子以380rpm的转速均匀搅拌；待样品全部注入后，继续搅 拌15-20min，直至无水乙醇全部挥发干净；接着将溶液转移至容量瓶并用PBS 定容到5ml，混匀溶液转移至西林瓶进行探头超声5min；随后用0.22μm的微孔 滤膜整粒，再用高速冷冻离心机离心(4℃，10000rpm，10min)，取上清液即为 铱(III)聚吡啶复合脂质体，分别命名为Ir1Lipo和Ir2Lipo，放置在4℃冰箱待 用。
实施例3、Ir1、Ir2、Ir1Lipo和Ir2Lipo的表征
(1)标准曲线的建立：精确称取Ir1Lipo、Ir2Lipo各10mg，溶解于无水乙 醇中(10ml)，配制成1mg/ml溶液。然后取0.5ml(1mg/ml)于容量瓶中，用无 水乙醇定容到10ml，配制成50μg/ml的母液。从母液中分别取0.5ml、0.75ml、 1.0ml、1.25ml、1.5ml、2.0ml溶液于容量瓶中，无水乙醇定容到5ml，最终得到 浓度为5，7.5，10，12.5，15，20μg/ml的溶液。测定前将配置好的溶液混合均 匀，并使用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后在最大吸收波长处测得5，7.5，10， 12.5，15，20μg/ml浓度溶液的紫外吸光值，用于标准曲线的绘制。
(2)粒径电位的测量：电动电位(Zeta potential)、粒径大小及分散系数使 用纳米粒度ZETA电位分析仪测定。每组实验重复三次，取平均值。
从图2可以看出，Ir1Lipo和Ir2Lipo的平均粒径分别为91.8nm和87.9nm， Ir1Lipo和Ir2Lipo的多分散指数(PDI)分别为0.161和0.153。Ir1Lipo和Ir2Lipo 可通过增强通透性保留效应(EPR效应)来主动靶向肿瘤细胞。
制备的Ir1Lipo、Ir2Lipo和空白脂质脂质体样品的状态如图3所示。从图中 可以看出，Ir1Lipo和Ir2Lipo分别是淡黄色和橙色透明且透明的液体，具有微带 乳白色。Ir1Lipo和Ir2Lipo的ζ电位分别为-7.12±1.32mV和-14.33±1.95mV。
当ZP值大于±30mV时，Ir1Lipo和Ir2Lipo具有高稳定性，而ZP值在 ±10-30mV范围内，表明Ir1Lipo和Ir2Lipo具有良好的稳定性。而且，PEG可以 在低Zeta电位下促进纳米颗粒的稳定性。因此，Ir1Lipo和Ir2Lipo在低Zeta电 位下也表现出良好的稳定性。Ir1Lipo和Ir2Lipo的包封率分别为70.3％和82.5％。 高包封率表明大多数Ir1或Ir2可以被脂质体包封。
综上，Ir1Lipo和Ir2Lipo具有良好的稳定性，可以用作潜在的抗肿瘤脂质体 剂。
实施例4、Ir1Lipo和Ir2Lipo的释放测试
使用透析法对铱(III)聚吡啶复合脂质体的混悬液进行体外释放研究，进 而推测其在体内的释放过程。简单地说，将制备好的Ir1Lipo和Ir2Lipo(4ml) 溶液装入活化好的透析袋(MWCO＝8-14KDa)中，两端使用黑线绑紧。将透析 袋放入盛有36ml含有0.5％Tween80(w/v)的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液的锥形瓶 中，37℃条件下进行摇床(100rpm)。然后在不同时间点(0、1、2、4、8、10、 12、24、48、72、96h)时快速取样，每次取样2ml并及时补充2ml配置好的 PBS缓冲液(0.5％Tween 80)。待取点完成后，使用紫外分光光度计测定样品吸 光度值，并根据标准曲线测定缓冲液中Ir浓度，根据下式计算出对应的累积释 放率：
累积释放率＝(C_n V_0+∑_(i＝1)^(n-1)C_i V)/M×100％
参照图4，0～24小时，铱(III)聚吡啶复合脂质体迅速释放，而24小时 后，脂质体缓慢释放，在此期间没有爆炸性释放。因此，具有稳定和持续释放 性的铱(III)聚吡啶复合脂质体可用于体内控制释放，而且其对正常组织的不 良影响较小。
实施例5、体外细胞毒性试验
药物的抗肿瘤活性可以通过体外细胞毒性来测量：用MTT比色法检测不同 的肿瘤细胞(A549，HepG2，SGC-7901，Bel-7402，HeLa)和正常细胞(NIH3T3) 的活性。每组至少进行3个平行实验，测得的IC 50值示于表1。
表1
complex
A549
HepG2
SGC-7901
Bel-7402
HeLa
NIH3T3
Ir1
〉100
〉200
20.9±2.7
〉200
〉200
〉100
Ir2
〉200
〉200
36.8±6.1
〉200
〉200
〉200
Ir1Lipo
8.1±0.4
9.7±0.3
5.8±0.2
11.6±0.2
9.2±0.2
55.7±2.2
Ir2Lipo
14.3±0.4
13.0±0.6
9.1±1.9
25.1±0.5
15.5±0.5
19.9±0.3
从表1可以看出，Ir1和Ir2具有良好的抗肿瘤活性而对正常细胞SGC-7901 没有抑制作用，表明其细胞毒性低。Ir1Lipo和Ir2Lipo对检测的细胞系均显示不 同程度的抗肿瘤活性，表明铱(III)聚吡啶聚合物被脂质体包被后可进入细胞 并其增强其毒性。Ir1Lipo对SGC-7901胃癌细胞具有最强的抗肿瘤活性，IC50 值为5.8±0.2μM，与正常细胞相比，其抗肿瘤活性毒性最强。
实施例6、胞吞试验
DAPI可以使细胞核染成蓝色，并可用荧光显微镜观察。SGC-7901细胞用 Ir1Lipo(5.8μM)和Ir2Lipo(9.1μM)处理一天。用DAPI染色后，在荧光显微 镜下观察药物进入细胞。
结果如图5所示，细胞形态处于明视场中；本发明的铱(III)聚吡啶聚合 物发出绿色荧光点；DAPI染色后，核发出蓝色荧光，绿色和蓝色荧光重叠。在 铱(III)聚吡啶复合脂质体Ir1Lipo和Ir2Lipo组中明显观察到绿色荧光。
此外，将Ir1Lipo(5.8μM)和Ir2Lipo(9.1μM)孵育细胞7小时后，收集 细胞，用60％硝酸消化，然后通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测量 SGC-7901细胞中脂质体Ir复合物的含量。
结果如图6所示：SGC-7901细胞中Ir1Lipo和Ir2Lipo的摄入量分别为7.5 和3.1ng/107细胞。铱(III)聚吡啶复合脂质体可促进细胞膜运输，摄入的药物 越多，细胞的体外毒性越强。上述数据证实铱(III)聚吡啶复合脂质体Ir1Lipo 和Ir2Lipo可以进入SGC-7901细胞，其诱导的细胞毒性强于Ir1和Ir2组。
实施例7、本发明的铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体抑制肿瘤细 胞迁移试验
测试Ir1，Ir2，Ir1Lipo和Ir2Lipo抑制肿瘤细胞增殖的能力。
如图7所示，在对照组中观察到细胞生长正常，Ir1(20.9μM)，Ir2(36.8μM)，Ir1Lipo(5.8μM)和Ir2Lipo(9.1μM)处理24小时后，细胞增殖降低。尤其是 Ir1Lipo和Ir2Lipo组的肿瘤细胞生长速度明显慢于对照组。
FAK影响细胞的生长，增殖和迁移，FAK途径的蛋白表达或活性增加预示 着肿瘤的发生。如图8所示，与对照组相比，在药物作用下肿瘤细胞中FAK蛋 白(125KD)的表达明显降低，进一步表明该药物可以抑制肿瘤细胞的增殖， 生长，侵袭和迁移。因此，铱(III)聚吡啶复合脂质体Ir1Lipo和Ir2Lipo对 SGC-7901细胞的增殖和侵袭具有明显的抑制作用。
实施例8、本发明的铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体诱导细胞周 期停滞并影响细胞周期蛋白CD4和p21的表达
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞周期分为G0/G1期，S期和G2/M 期。不同阶段的干扰会影响细胞增殖。PI是通常用于检测细胞周期的核酸染料， 其与细胞内DNA结合后，可检测到红色荧光；利用流式细胞术分析细胞周期。
结果如图9所示：使用Ir1(20.9μM)，Ir2(36.8μM)，Ir1Lipo(5.8μM)， Ir2Lipo(9.1μM)处理24小时，Ir1和Ir2处理的癌细胞在G0/G1期的分布与空 白组相比无明显变化，而Ir1Lipo和Ir2Lipo组的G0/G1期分别提高了12.9％和 5.62％，并伴随着S期的比例降低，其中Ir1Lipo对GO/G1阻滞作用最明显。
为了进一步探讨聚合物和脂质体在细胞周期阻滞中的作用，通过蛋白质印 迹检测了药物诱导的细胞周期调节蛋白CDK4和P21的表达水平，CDK4和p21 在G1期起调节作用。
如图10所示，药物处理后肿瘤细胞中CDK4蛋白的表达下调，而CDK4的 抑制蛋白P21的表达明显上调。综上，铱(III)聚吡啶复合脂质体通过调节细 胞周期相关蛋白来诱导细胞周期的G0/G1期停滞，进而发挥抑制肿瘤生长的作 用。
实施例9、本发明的铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体诱导肿瘤细 胞凋亡
凋亡是一种受基因控制的有序、自主的细胞死亡，与细胞生长和内部环境 稳定性密切相关。采用膜联蛋白-V/PI双重染色定量分析细胞凋亡。以Ir1，Ir2， Ir1Lipo和Ir2Lipo的IC50浓度作为阳性对照处理肿瘤细胞24h，然后用膜联蛋 白-V FITC和碘化丙锭(PI)染色，通过流式细胞术检测细胞凋亡。
流式细胞数据(参照图11)显示，空白组细胞的早期凋亡率(Q3)为3.09％ (图11a)，暴露于复合Ir1，Ir2，Ir1Lipo和Ir2Lipo的SGC-7901细胞的早期凋 亡率(Q3)分别为7.05％(图11b)7.61％(图11c)，16.3％(图11d)和11.1％ (图11e)。该复合物通过凋亡机制(尤其是Ir1Lipo和Ir2Lipo)可以诱导细胞 死亡。
实施例10、本发明的铱(III)聚吡啶聚合物、铱(III)聚吡啶复合脂质体处理肿瘤 细胞后凋亡蛋白的表达
为了进一步研究复合物在体内对信号分子的影响，采用蛋白质印迹法分析 了与各种蛋白质相对应的信号途径。作为凋亡的关键执行分子，caspase-3在各 种凋亡信号转导途径中起着重要的作用。PARP是caspase3的切割底物，也可用 作细胞凋亡的标志物。
如图12所示，用Ir1，Ir2，Ir1Lipo和Ir2Lipo复合物处理SGC-7901细胞后，Caspase3及其底物PARP蛋白的表达显着上调。作为自噬中的信号传导通路， PI3K/Akt通路调节多种细胞功能(包括代谢，增殖和凋亡)。PI3K/AKT通过靶 蛋白的磷酸化发挥抗凋亡作用，并参与ROS的产生。因此，PI3K和AKT的蛋 白表达明显下调，表明该药物通过抑制PI3K/AKT途径诱导肿瘤细胞自噬从而 促进了细胞凋亡。
Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的主要组成部分，包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2) 和促凋亡蛋白(如Bax)。WB结果表明，用药物Ir1，Ir2，Ir1Lipo和Ir2Lipo后 处理肿瘤细胞后，促凋亡蛋白Bax的表达上调，凋亡相关蛋白Bcl-2被抑制。
综上所述，Ir1，Ir2，Ir1Lipo和Ir2Lipo通过溶酶体降解途径和线粒体途径 诱导细胞凋亡，Ir1Lipo和Ir2Lipo引起的变化更为明显。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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