阅读说明：本技术 一种植物纤维原料酶水解糖化的方法 (Method for enzymatic hydrolysis and saccharification of plant fiber raw material ) 是由 戴红旗 周雪莲 卞辉洋 王瑞彬 徐婷婷 刘祝兰 杨益琴 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种植物纤维原料酶水解糖化的方法,属于生物质分离与转化技术领域。本发明方法包括：将生长发育早期的新鲜植物纤维原料经过机械处理获得碎解的植物纤维原料；以碎解的植物纤维原料为底物,在柠檬酸钠或醋酸钠的缓冲液中,加入纤维素酶等进行生物酶水解；由于生长早期的新鲜植物纤维的木质化程度低,木质素聚合程度也低,酶对纤维的可及性较高,加上合理的机械处理,使得本发明提供的方法可在不使用大量化学试剂的情况下促进植物纤维原料的酶水解糖化效率高达95.5％,同时得到富含原生木质素组分的固体渣可进一步进行高值化利用,绿色高效,应用推广价值高。(The invention discloses a method for enzymatic hydrolysis and saccharification of plant fiber raw materials, and belongs to the technical field of biomass separation and conversion. The method comprises the following steps: mechanically treating fresh plant fiber raw materials at the early growth and development stage to obtain disintegrated plant fiber raw materials; adding cellulase and the like into a buffer solution of sodium citrate or sodium acetate by taking the crushed plant fiber raw material as a substrate to carry out biological enzyme hydrolysis; due to the fact that the lignification degree of the fresh plant fibers in the early growth stage is low, the lignin polymerization degree is also low, the accessibility of the enzymes to the fibers is high, and reasonable mechanical treatment is added, the method provided by the invention can promote the enzymatic hydrolysis saccharification efficiency of the plant fiber raw materials to be as high as 95.5% under the condition that a large number of chemical reagents are not used, meanwhile, the obtained solid residues rich in the primary lignin components can be further utilized in a high-value mode, and the method is green, efficient and high in application and popularization values.)

一种植物纤维原料酶水解糖化的方法

技术领域

本发明属于生物质分离与转化技术领域，更具体地说，涉及一种植物纤维原料酶水解糖化的方法。

背景技术

随着我国经济的快速发展，能源供需矛盾和环境问题将会日益严重。因此充分、有效和科学地开发利用生物质能是未来缓解我国能源矛盾的途径之一。发展生物质能不仅缓解我国能源紧张和环境压力，还可以推动农村经济、促进农民增收、推进新农村建设，同时在今年生物质能全领域已被国家***列入鼓励类目录。

木质纤维素原料中的纤维素、半纤维素可在生物酶的催化作用下降解成单糖，单糖后经微生物发酵可生产乙醇、丁醇等生物能源以及乳酸、丁二酸等高值化平台化合物。而植物在生长发育过程中形成了复杂的细胞壁结构，并且随着植物生长发育，纤维细胞壁木质化程度增大、纤维结晶度逐步提高，生物酶可及性随之降低，导致细胞壁难以被酶降解，即“生物质抗降解屏障”，增加了生物炼制难度。因此，对木质纤维素原料进行生物炼制需要经过预处理环节破除生物质抗降解屏障，主要采用的预处理技术包括稀酸处理、蒸汽***、氨纤维***(AFEX)、低温氨浸处理、高温液态水处理、有机溶剂法、碱性过氧化氢法等，其中AFEX是破除生物质抗降解屏障最为有效的方法之一，也是最经济可行的物理-化学预处理技术，但是AFEX预处理对高木质素含量的植物纤维原料作用有限。除此之外，大多数的预处理方法都会使细胞壁多聚物在一定程度上发生水解，产生的寡糖或单糖会溶解在预处理液或水洗液中，随处理过程而流失，另外，在此过程中半纤维素和木质素会产生乙酸、呋喃、酚类和糠醛等副产物，抑制微生物代谢活性。所以，探索和开发成本低、效率高、糖损失少、抑制物少的预处理方法仍是目前植物纤维资源生物炼制技术产业化进一步努力的方向。

由于目前报道的预处理手段通常具有条件苛刻、使用有毒有害试剂等缺点，不仅能源消耗大、环境污染严重，还会抑制后续微生物发酵，生物学领域的专家通过研究细胞壁关键结构因子与生物质高效降解的关系发现细胞壁从结构上就决定了其酶解产糖效率，因此提出细胞壁基因改造工程技术，例如降低细胞壁木质素含量、改变木质素单体组成和结构、对木质素单体进行修饰、增加细胞壁低结晶度纤维素含量、降低细胞壁高结晶度纤维素含量等策略。但是利用转基因和突变体，其细胞壁结构与组成发生了系统性变化，不仅影响植物正常生长与发育，且种子与生物质产量均大幅度改变，周期长且成本高，均未获得突破性进展。

研究分析认为，随着植物的生长发育，纤维的木质化程度不断增大，木质素聚合程度越来越高，酶对纤维的可及性降低；纤维结构微纤丝层内聚力越来越强、结晶度越来越高，酶水解糖化越来越困难；另外，新鲜植物风干后，因失水导致纤维细胞胞间层内聚力增强及组织角质化，削弱了纤维素酶可及性；导致生物炼制必须采用预处理手段或基因改造工程技术降低木质素含量、改变木质素结构、降低纤维素结晶度，从而增大生物酶的可及性，提高酶水解糖化效率，不仅工艺复杂、增加了生物炼制成本，而且产生了大量的废水、形成新的环境问题。

因此，有必要对生长发育早期的新鲜植物纤维原料酶水解糖化进行相关研究，构建一种绿色高效的新鲜植物纤维原料酶水解糖化方法，在不使用大量化学试剂的前提下促进木质纤维素原料的酶水解糖化效率，同时分离得到的原生木质素可被进一步高值化利用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种植物纤维原料酶水解糖化的方法，解决现有的纤维素酶解方法存在的工艺复杂、使用大量化学试剂、产生大量废水影响环境等问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种植物纤维原料酶水解糖化的方法，包括：以纤维素含量丰富的新鲜幼嫩植物为原料，经过杀青、机械粉碎、平衡水分后，加入缓冲液和酶进行水解，经过固液分离获得酶水解液。

进一步地，所述的植物纤维原料酶水解糖化的方法，具体步骤为：

1)获取纤维素含量丰富的新鲜幼嫩植物，立即杀青，然后完全去除叶、鞘，保留茎秆部分；

2)将茎秆加水后进行机械粉碎，获得粉碎后的茎秆；

3)对粉碎后的茎秆进行平衡水分后，加入缓冲液和酶进行水解；

4)固液分离水解产物，获得酶水解液。

进一步地，所述的纤维素含量丰富的新鲜幼嫩植物，为芒草、柳枝稷、芦竹、竹子、玉米秸秆和小麦秸秆中的一种或多种。

进一步地，所述的纤维素含量丰富的新鲜幼嫩植物，其生长时间为10天至6个月。

进一步地，所述的杀青的具体条件为：105℃，20min。

进一步地，所述的机械粉碎为破壁机粉碎、瓦利打浆、超微粒粉碎、盘磨、PFI磨、球磨、双螺杆挤压中的一种或多种组合。

进一步地，所述的酶为纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、***糖苷酶中的一种或多种组合。

附图说明

图1为去除叶、鞘后的新鲜芒草图；图中，左图为包括叶和鞘的芒草，中图为去叶含鞘的芒草，右图为同时去除了叶和鞘的芒草；

图2为生长发育2、4、6个月新鲜芒草风干前后96h酶水解得率对比图；图中，FG：风干芒草，XX：新鲜芒草；

图3为氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化酶水解液产葡萄糖酸与木糖酸结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

纤维素酶为诺维信二代商品酶(CTec2，Novozymes)，是一种包含纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶的酶混合物。木聚糖酶(CAS9025-57-4)、果胶酶(CAS9032-75-1)，来源于黑曲霉，购自麦克林(上海)公司。***糖苷酶(No.E-AFASE)购于爱尔兰Megazyme公司。

实施例1：

以生长发育2个月、4个月和6个月的新鲜芒草为原料，收获后立即杀青(105℃，20min)。杀青完成后将材料的叶、鞘等部分全部去除，仅保留茎秆部分(如图1所示)，在底物浓度为10％(茎干与水质量比为1∶9)的条件下借助破壁机粉碎15次，每次50s得到粉碎的料液。然后在盘磨间隙为200μm、底物浓度为2％的条件下借助超微粒粉碎机盘磨10次，得到粉碎的芒草物料，并置于4℃冰箱平衡水分24h，测定物料水分含量，取少量粉碎的物料室温条件下干燥，测定物料组分含量并获得风干芒草原料。然后按照固液比2％(w/v)加入pH4.8的50mM的柠檬酸钠缓冲液中，加入50FPU/g底物的纤维素酶、50FPU/g底物的木聚糖酶、50FPU/g底物的果胶酶进行酶解，在50℃和150rpm的摇床上酶解96h。

结果如图2所示，生长发育2个月、4个月和6个月的新鲜芒草96h的酶水解得率分别为95.5％，62.11％和25.66％。而风干的生长发育2个月、4个月和6个月芒草96h的酶水解得率分别为88.36％、54.22％和15.20％。说明相比于成熟风干的芒草，生长发育早期的新鲜芒草原料木质化程度低，采用简单的机械处理后即可破坏其细胞壁结构，可在不使用大量化学试剂的条件下实现纤维素的高效酶水解糖化。

酶水解得率计算公式如下所示：

酶水解液经过固液分离获得糖液和富含木质素的固体渣，固体渣经过透析和提纯，经冷冻干燥获得原生木质素，可被进一步高值化利用。糖液经过旋转蒸发浓缩至总糖浓度为100g/L左右，可利用氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化生产平台化学品，24h内即可获得67.14g/L葡萄糖酸与28.09g/L木糖酸(如图3所示)。

实施例2：

以生长发育10天和50天的新鲜竹子为原料，收获后立即杀青(105℃，20min)。杀青完成后将材料的枝叶等部分全部去除，仅保留茎秆部分，利用双螺杆挤压一次，再利用盘磨机盘磨5次，其中盘磨间距为1mm，经过固液分离加水洗过程得到粉碎的竹子原料，置于4℃冰箱平衡水分24h，测定物料水分含量，取少量粉碎的物料室温条件下干燥，测定物料组分含量。然后按照固液比2％(w/v)加入pH4.8的50mM的醋酸钠缓冲液中，加入50FPU/g底物的纤维素酶、20FPU/g底物的木聚糖酶、20FPU/g底物的***糖苷酶、20FPU/g底物果胶酶进行酶解，在50℃和150rpm的摇床上酶解96h。生长发育10天和50天的竹子酶水解得率分别为52.05％和16.77％(酶水解得率计算公式同实施例1)。

实施例3：

以生长发育3个月的新鲜柳枝稷为原料，收获后立即杀青(105℃，20min)。杀青完成后将材料的枝叶等部分全部去除，仅保留茎秆部分，在底物浓度为10％的条件下借助破壁机粉碎10次，每次50s得到粉碎的料液，然后在2％底物浓度下利用瓦利打浆机处理1h，经过固液分离加水洗过程得到粉碎的柳枝稷原料，置于4℃冰箱平衡水分24h，测定物料水分含量，取少量粉碎的物料室温条件下干燥，测定物料组分含量。然后按照固液比2％(w/v)加入pH4.8的50mM的醋酸钠缓冲液中，加入50FPU/g底物的纤维素酶进行酶解，在50℃和150rpm的摇床上酶解96h。生长发育3个月的柳枝稷酶水解得率分别为51.79％(酶水解得率计算公式同实施例1)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。