一株产虾青素菌株及其应用
阅读说明：本技术 一株产虾青素菌株及其应用 (Astaxanthin-producing strain and application thereof ) 是由 信丰学 周大伟 姜岷 章文明 蒋羽佳 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一株产虾青素菌株及其应用,所述产虾青素菌株分类命名为Xanthophyllomyces dendrorhous DW6,保藏号为CCTCC M2021732。本发明还提供了该产虾青素菌株在生产虾青素中的应用,所述酵母菌能够在以葡萄糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖等为碳源的培养基中发酵产生虾青素,具有极大的利用低劣生物质进行生产高价值产物的潜力。本发明为生物生产虾青素提供了新的高产菌株。(The invention relates to an astaxanthin-producing strain and application thereof, wherein the astaxanthin-producing strain is classified and named Xanthophyllomyces dendrorhous DW6 with preservation number of CCTCC M2021732. The invention also provides application of the astaxanthin-producing strain in astaxanthin production, the yeast can ferment and produce astaxanthin in a culture medium taking glucose, sucrose, fructose, arabinose and the like as carbon sources, and the astaxanthin-producing strain has great potential of producing high-value products by utilizing inferior biomass. The invention provides a new high-yield strain for biologically producing astaxanthin.)
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株产虾青素菌株及其应用。
背景技术
虾青素作为一种天然类胡萝卜素，具有很强的清除自由基的活性，可以保护脂质过氧化和低密度脂蛋白-胆固醇、细胞膜、细胞和组织的氧化损伤。此外，虾青素还具有许多基本的生物学功能，包括防止必需的多不饱和脂肪酸氧化和防止紫外线效应，支持良好的视力和眼睛健康，以及增强免疫反应，因其具有较高的抗氧化活性，已被广泛应用于食品添加剂、色素或抗氧化剂以及营养食品。
酵母，相较其他微生物，具有培养简单、生物量大、底物利用谱广泛，以及工业化中适应性强等众多优点。由于化学合成的虾青素不能够用于人类，能够生物合成虾青素的微生物成为虾青素生产的研究热点。雨生红球藻、红法夫酵母菌等是目前研究较多的产虾青素菌株，目前用于虾青素生产的微生物主要是雨生红球藻，但由于其生产周期长，需要充足光照等不利条件，但红法夫酵母生长周期短，发酵条件简单，因此是生物法生产虾青素的潜力菌株。，目前一般是通过优化发酵条件或筛选/诱变结合发酵条件优化的方式以获得更高的虾青素产量，但选育富含虾青素的菌株仍是最重要的研究方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产虾青素菌株及其应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株产虾青素菌株，分类命名为红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）DW6，保藏号为CCTCC NO：M 2021732。
本发明的另一目的在于提供上述菌株在生产虾青素中的应用。
作为一种优选的实施方式，本发明通过微生物发酵的方式生产虾青素，包括：将所述产油酵母菌接种至YM固体培养基上培养进行菌种活化后，取单菌落接种至种子培养基进行二代种子培养，种子培养得到的种子液接种至发酵培养基培养，获取虾青素产品。
进一步的，所述菌株发酵的碳源选自葡萄糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、甘油、木糖、甘露糖、麦芽糖、纤维二糖中的一种或多种。
进一步的，发酵培养基中氮源为硫酸铵、酵母粉和玉米浆粉。
进一步的，所述两代种子培养的方式为：
1）一代种子培养：从YM固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基恒温培养；
2）二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和步骤1）同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
进一步的，所述恒温培养的条件为20℃-22℃，200 rpm下培养24h。
进一步的，发酵培养的温度为20℃-22℃。
进一步的，在500rpm下发酵培养。
进一步的，发酵培养时，从第二天起每天补充碳源至初始浓度。
进一步的，发酵液离心处理后获得含虾青素的菌体，在经由分离得到虾青素产品。
虾青素的提取方式有很多，本发明的提取方式为：取发酵液离心洗涤，收集菌体，破碎菌体，萃取，离心收集上清液，获得虾青素。
本发明相对于现有技术，具有如下的有点及效果：
本发明提供一株高产虾青素的红法夫酵母菌，为生物生产虾青素提供了新的高产菌株，将本发明的菌株在5L发酵罐中发酵，所得产品中虾青素含量为300 mg/L，细胞干重达36 g/L，发酵提取出的虾青素可用于饲料、保健品、化妆品等，而提取完的菌体可作为蛋白添加进动物饲料，提升了饲料的品质，缓解了饲料生产对于粮食的巨大需求压力。
附图说明
图1是实施例2菌株摇瓶发酵的虾青素产量示意图。
图2是实施例3菌株发酵罐发酵的虾青素产量示意图。
图3是实施例4菌株利用不同碳源发酵产虾青素示意图。
本发明所述的生物材料，其分类命名为红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)DW6，于2021年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021732，地址：中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。此外，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中使用的培养基如下：
YM培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、麦芽提取物3 g/L、其余为水；YM固体培养基额外添加琼脂粉20 g/L。配制方法为：称取葡萄糖1g，蛋白胨0.5 g，酵母粉0.3 g，麦芽提取物0.3 g，溶于100 mL蒸馏水中，5M NaOH和5 M的H3PO4调节pH至5.5±0.2。YM固体培养基再加入2 g琼脂粉，摇匀，115℃灭菌20 min。
发酵培养基：
葡萄糖30 g/L，硫酸铵1.5 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，七水硫酸镁1.5 g/L，酵母粉1.5 g/L，玉米浆粉10 g/L。葡萄糖配置成母液单独灭菌。
种子培养基和发酵培养基相同。
实施例中微生物细胞干重、虾青素含量测定方法为：
微生物细胞干重测定方法：用提前称量好的离心管取适量发酵液，离心洗涤两次，然后放置烘箱65℃烘干至恒重。
虾青素的提取及测定方法：紫外分光光度测定法测定虾青素含量。
取1mL发酵液于12000rpm下离心2min，去离子水洗涤两次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入1mL 55℃预热的二甲亚砜 (DMSO)，振荡悬浮，加入丙酮 2mL，漩涡振荡20-30s，然后避光静置15分钟，4℃，12000r/m 离心 2min，上清液用分光光度计测OD474。如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止，虾青素含量计算公式如下：
虾青素（mg/L）=
式中：A— OD474mm值
V1—有机溶剂的总体积 (mL) ；
2150——比消光系数
V2——发酵液体积 (mL) ；
10000 ：单位换算后的作数 (mg/L)
实施例1
本实施例具体说明红法夫酵母DW6菌株的筛选方式。
利用取自南京工业大学君子湖边的土壤，进行微生物重悬后，划线于含有氨苄抗性的YPD平板上，挑取颜色为红色的菌落再划线，20℃培养分离获得单菌落，再将菌液稀释涂布于含有适量二苯胺的YM平板，选取颜色深红的菌落进行发酵测定，获得高产虾青素的菌株，经鉴定为红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）菌株，命名为DW6。
实施例2
红法夫酵母DW6菌株摇瓶发酵生产虾青素。
（1）将实施例1选育出的红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）DW6接种至YM固体培养基，20℃-22℃培养2-3天，进行菌种活化；
（2）种子培养，包括：
a. 一代种子培养：从YM固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基20℃-22℃，200 rpm下恒温培养48h；
b. 二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和a同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
（3）种子培养得到的种子液接种至装有发酵培养基的三角瓶中发酵，21℃±1℃，200rpm，发酵时第二天起每天补充葡萄糖至浓度为30 g/L，培养五天，测定细胞干重，提取发酵液中虾青素，测定虾青素含量，重复实验，如图1所示，发酵五天后虾青素含量可达87mg/L（每L发酵液产虾青素的量），且产量仍在增长。
实施例3
红法夫酵母DW6菌株发酵罐发酵生产虾青素。
（1）将实施例1选育出的红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）DW6接种至YM固体培养基，20℃-22℃培养2-3天，进行菌种活化；
（2）种子培养，包括：
a. 一代种子培养：从YM固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基20℃-22℃，200 rpm下恒温培养48h；
b. 二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和a同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
（3）种子培养得到的种子液接种至装有发酵培养基的5L发酵罐中，21℃±1℃，500rpm，发酵时第二天起每天补充葡萄糖至浓度为30 g/L，培养八天，测定细胞干重，提取发酵液中虾青素，测定虾青素含量，重复实验，如图2其虾青素含量达到300mg/L（每L发酵液产虾青素的量）。
实施例4
红法夫酵母DW6菌株利用不同碳源发酵生产虾青素。
（1）将实施例1选育出的红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）DW6接种至YM固体培养基，20℃-22℃培养2-3天，进行菌种活化；
（2）种子培养，包括：
a. 一代种子培养：从YM固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基20℃-22℃，200 rpm下恒温培养48h；
b. 二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和a同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
（3）种子培养得到的种子液接种至装有发酵培养基的500mL摇瓶发酵罐中，21℃±1℃，200rpm，培养五天，测定细胞干重，提取发酵液中虾青素，测定虾青素含量，重复实验，如图3以葡萄糖为底物作为对照，其虾青素含量均达到70 mg/L（每L发酵液产虾青素的量），细胞干重与以葡萄糖为底物相近。
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