一种三维肝脏类器官复苏液和三维肝脏类器官的复苏方法
阅读说明：本技术 一种三维肝脏类器官复苏液和三维肝脏类器官的复苏方法 (Three-dimensional liver organoid resuscitation solution and three-dimensional liver organoid resuscitation method ) 是由 高毅 黎少 欧楚澎 彭青 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种三维肝脏类器官复苏液和三维肝脏类器官的复苏方法,涉及细胞复苏液技术领域。该三维肝脏类器官复苏液的组分包括：烟酰胺50-200mmol/L、胰岛素1-50μg/ml、肝细胞生长因子1-50ng/ml、表皮生长因子1-50ng/ml、地塞米松1-100μmol/L、胎牛血清8-12wt%、亚麻酸1-50μg/ml和极性溶剂0.01-0.1wt%以及余量的基础培养基。本申请提供的复苏液能够提供足够的营养供类器官内肝细胞维持活性和生长培养。其成分简单,组容易获取、价格相对低廉,并且基础培养基有多种选择,可以适用于各种肝脏类器官,应用范围广,本申请提供的复苏方法简单,可操作性强。(The invention discloses a three-dimensional liver organoid resuscitation solution and a resuscitation method of three-dimensional liver organoids, and relates to the technical field of cell resuscitation solutions. The three-dimensional liver organoid resuscitation solution comprises the following components: 50-200mmol/L nicotinamide, 1-50 mug/ml insulin, 1-50ng/ml hepatocyte growth factor, 1-50ng/ml epidermal growth factor, 1-100 mug/L dexamethasone, 8-12wt% fetal calf serum, 1-50 mug/ml linolenic acid, 0.01-0.1wt% polar solvent and the balance of basal medium. The resuscitation solution provided by the application can provide enough nutrition for the maintenance activity and growth culture of liver cells in organoid. The resuscitation medium has the advantages of simple components, easy group acquisition, relatively low price, multiple choices of basic culture media, suitability for various liver organs, wide application range, simple resuscitation method and strong operability.)
技术领域
本发明涉及细胞复苏液技术领域，具体而言，涉及一种三维肝脏类器官复苏液和三维肝脏类器官的复苏方法。
背景技术
与二维细胞的表面不同，三维培养需要细胞适应它们的形态和表型等，是一种具备良好增殖条件以及功能活性诱导的培养系统。现有的二维细胞培养模型在体外研究细胞生长时往往不是很理想，因为它们不能形成更自然的组织样结构，这对细胞性能有重大影响。
越来越多研究表明，三维培养的更多发展，使肝脏类器官成为肝脏疾病研究和药物代谢的研发工具。肝脏类器官是一种在体外培养，可在功能和结构方面形成仿生肝脏的聚集体。由于在体外即可形成仿生体内的关键结构和功能特征，因此相比于传统二维细胞培养具有更大优势，尤其是在药物毒性检测，肝癌表型分析和肝脏组织工程研究等方面具有重要研究意义。
可以完整、片段形式进行冻存的肝脏类器官，能够在低温下的长期冻存状态后快速复苏对于体外长期应用具有重要研究应用价值。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三维肝脏类器官复苏液和三维肝脏类器官的复苏方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种三维肝脏类器官复苏液，其组分包括：烟酰胺50-200mmol/L、胰岛素1-50μg/ml、肝细胞生长因子1-50ng/ml、表皮生长因子1-50ng/ml、地塞米松1-100μmol/L、胎牛血清8-12 wt%、亚麻酸1-50μg/ml和极性溶剂0.01-0.1 wt %以及余量的基础培养基。
在可选的实施方式中，其组分包括：烟酰胺80-120mmol/L、胰岛素20-30μg/ml、肝细胞生长因子20-30ng/ml、表皮生长因子20-30ng/ml、地塞米松40-60μmol/L、胎牛血清9-11 wt %、亚麻酸10-25μg/ml和极性溶剂0.05-0.08 wt %以及余量的基础培养基。
在可选的实施方式中，所述烟酰胺和所述地塞米松用所述极性溶剂溶解后再加入所述基础培养基。
在可选的实施方式中，所述极性溶剂为DMSO。
在可选的实施方式中，所述基础培养基选自DMEM/F12细胞培养基、MEM细胞培养基、William"s E细胞培养基和DMEM高糖细胞培养基中的一种。
第二方面，本发明提供一种三维肝脏类器官的复苏方法，其包括：利用如前述实施方式任一项所述的三维肝脏类器官复苏液对冻存的三维肝脏类器官进行连续复苏培养。
在可选的实施方式中，冻存的所述三维肝脏类器官中的目标肝细胞大于106；
所述目标肝细胞选自肝癌细胞系或正常人肝细胞系。
在可选的实施方式中，所述三维肝脏类器官包括聚球体、悬浮肝脏类器官或水凝胶类器官。
在可选的实施方式中，所述连续复苏培养包括将所述三维肝脏类器官接种至低粘附孔板或者微球板中，放置于盛放有所述三维肝脏类器官复苏液的CO2细胞培养箱中于35-37℃下进行静置培养1-5天；
在所述连续复苏培养的时间内，每隔20-30小时更换所述三维肝脏类器官复苏液；
更换所述三维肝脏类器官复苏液包括：先弃去培养容器中的上清液，用缓冲液洗涤两次，接着再加入新鲜的所述三维肝脏类器官复苏液。
在可选的实施方式中，在利用所述的三维肝脏类器官复苏液对冻存的三维肝脏类器官进行连续复苏培养之前，还包括对冻存的所述三维肝脏类器官进行预处理，所述预处理包括将冻存的所述三维肝脏类器官于35-37℃下进行解冻，解冻后于500转/min下离心3-5min，舍弃冻存液，采用磷酸缓冲溶液洗涤采用磷酸缓冲溶液。
本发明具有以下有益效果：本申请提供的三维肝脏类器官复苏液，通过向基础培养基中添加烟酰胺、地塞米松和亚麻酸，为肝脏类器官的复苏和培养提供能量的同时促进肝脏类器官分化，同时还添加有胰岛素、肝细胞生长因子和表皮生长因子有利于促进细胞的增殖，胎牛血清的添加进一步为肝脏类器官的生长提供了充足的营养物质。本申请提供的三维肝脏类器官复苏液能够提供足够的营养供类器官内肝细胞维持活性和生长培养。其成分简单，组容易获取、价格相对低廉，不会大幅度提高本申请的复苏液的制备成本；本申请的复苏液，可以使用多种基础培养基进行配置，可以适应不同细胞株或细胞系的肝细胞，也可以适应不同成熟度的肝细胞，为各种肝细胞快速复苏和活性维持提供足够的营养；本申请提供的三维肝脏类器官复苏液通过将目标肝脏类器官进行预设天数的连续培养，即可使多种类别冻存肝脏类器官活率和功能得以恢复，操作简单，应用性强，可实现更多肝类器官保存与快速应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为采用实施例1提供的三维肝脏类器官复苏液复苏培养肝癌细胞HepG2三维聚球体5天后的形态光镜图；
图2为采用实施例1提供的三维肝脏类器官复苏液复苏培养肝癌细胞C3A水凝胶类器官5天后的形态光镜图；
图3为采用实施例1提供的三维肝脏类器官复苏液复苏培养肝干细胞HepaRG三维类器官5天后的形态光镜图；
图4为采用实施例1提供的三维肝脏类器官复苏液复苏培养肝干细胞HepaRG和HepG2三维类器官5天后的细胞数量统计结果图；
图5为采用对比例1至6、实施例1和实施例5提供的三维肝脏类器官复苏液复苏培养C3A三维类器官5天后的细胞死活染色结果的光镜图；
图6为采用对比例1至6、实施例1和实施例5提供的三维肝脏类器官复苏液复苏培养C3A三维类器官5天后的细胞上清白蛋白表达ELISA统计结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请实施例提供了一种三维肝脏类器官复苏液，其组分包括：烟酰胺（Nicotinamide）50-200mmol/L、胰岛素（Insulin）1-50μg/ml、肝细胞生长因子（HGF）1-50ng/ml、表皮生长因子（EGF）1-50ng/ml、地塞米松1-100μmol/L、胎牛血清8-12 wt %、亚麻酸1-50μg/ml和极性溶剂0.01-0.1 wt %以及余量的基础培养基。
本申请中，烟酰胺作为培养基的营养成分，为肝脏类器官的复苏和培养提供能量。
胰岛素可通过作用于肝脏类器官表面的胰岛素受体，增强肝脏类器官对能源的摄入和利用，同时促进肝脏类器官内的RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，从而增强肝脏类器官的活力与功能。
肝细胞生长因子和表皮生长因子能够促进肝细胞的增殖，以及调节肝细胞的功能。
地塞米松是一种人工合成的皮质类固醇，其能够抗炎、抗毒，地塞米松能够诱导肝脏类器官分化，为肝脏类器官提供激素。
胎牛血清含有丰富的细胞生长必须的营养成分。
亚麻酸是一种必需营养素，可添加于细胞培养，以促进细胞功能和生长。
极性溶剂用于溶解烟酰胺和地塞米松。由于烟酰胺不溶于水，不能直接将地塞米松溶解于以水为溶剂的基础培养基中，本申请中，通过添加极性溶剂，优选极性溶剂为DMSO（二甲基亚砜）。DMSO有“万能溶剂”之称，常用于溶解各种添加到液体培养基或固体培养基的添加物，但是DMSO对细胞有微弱毒性，因此本申请中控制DMSO的用量在生物可接受的范围内。本实例中，DMSO的终浓度不超过0.1%，优选为0.01-0.1%，更优选为0.05-0.08%。本申请中将烟酰胺和地塞米松均用极性溶剂进行溶解，有利于控制烟酰胺和地塞米松的添加量。
基础培养基选自DMEM/F12细胞培养基、MEM细胞培养基、William"s E细胞培养基和DMEM高糖细胞培养基中的一种。
优选地，本申请提供的三维肝脏类器官复苏液的组分包括：烟酰胺80-120mmol/L、胰岛素20-30μg/ml、肝细胞生长因子20-30ng/ml、表皮生长因子20-30ng/ml、地塞米松40-60μmol/L、胎牛血清9-11 wt %、亚麻酸10-25μg/ml和极性溶剂0.05-0.08 wt %以及余量的基础培养基。
此外，本申请实施例还提供了一种三维肝脏类器官的复苏方法，其包括如下步骤：
S1、选取冻存形式的三维肝脏类器官。
其中，三维肝脏类器官包括聚球体、悬浮肝脏类器官或水凝胶类器官。冻存的三维肝脏类器官中的目标肝细胞大于106；优选地，目标肝细胞选自肝癌细胞系或正常人肝细胞系。
S2、对冻存的三维肝脏类器官进行预处理。
将冻存的三维肝脏类器官于35-37℃下进行解冻，于500转/min下离心3-5min；舍弃冻存液，采用磷酸缓冲溶液洗涤2-3次。
S3、利用三维肝脏类器官复苏液对冻存的三维肝脏类器官进行连续复苏培养。
连续复苏培养包括将三维肝脏类器官接种至低粘附孔板或者微球板中，放置于盛放有三维肝脏类器官复苏液的CO2细胞培养箱中于35-37℃下进行静置培养1-5天；在连续复苏培养的时间内，每隔20-30小时更换三维肝脏类器官复苏液；具体来说，更换三维肝脏类器官复苏液包括：先弃去培养容器中的上清液，用缓冲液洗涤两次，接着再加入新鲜的三维肝脏类器官复苏液。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种三维肝脏类器官复苏液，其包括基础培养基和添加物，本实施例中基础培养基为DMEM/F12细胞培养基，添加物包括终浓度为100 mmol/L的烟酰胺，25μg/ml的胰岛素，25 ng/ml的肝细胞生长因子、25 ng/ml的表皮生长因子、50μmol/L地塞米松、10%的FBS，10μg/ml亚麻酸和0.1%的DMSO。
其制备方法包括：
（1）采用DMSO稀释烟酰胺和地塞米松；
（2）向DMEM/F12细胞培养基中添加溶解有烟酰胺和地塞米松的DMSO、胰岛素、肝细胞生长因子以及表皮生长因子和亚麻酸。
实施例2-4
实施例2-4提供的三维肝脏类器官复苏液的添加物与实施例1相同，区别在于基础培养基不同：
实施例2中，基础培养基为MEM细胞培养基；
实施例3中，基础培养基为William's E细胞培养基；
实施例4中，基础培养基为DMEM高糖细胞培养基。
实施例5
本实施例提供了一种三维肝脏类器官复苏液，其包括基础培养基和添加物，本实施例中基础培养基为DMEM/F12细胞培养基，添加物包括终浓度为150 mmol/L的烟酰胺，40μg/ml的胰岛素，40 ng/ml的肝细胞生长因子、40 ng/ml的表皮生长因子、65 μmol/L地塞米松、12%的FBS，20μg/ml亚麻酸和0.1%的DMSO。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，仅使用基础培养基（DMEM细胞培养基）对三维类器官进行复苏培养，不向基础培养基中添加添加物。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于，仅使用基础培养基（MEM细胞培养基）对三维类器官进行复苏培养，不向基础培养基中添加添加物。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于，仅使用基础培养基（William's E细胞培养基）对三维类器官进行复苏培养，不向基础培养基中添加添加物。
对比例4
本对比例与实施例4的区别在于，仅使用基础培养基（DMEM/F12高糖细胞培养基）对三维类器官进行复苏培养，不向基础培养基中添加添加物。
对比例5
省略实施例1中的烟酰胺。
对比例6
省略实施例1中的地塞米松。
实验例
将上述实施例1-5以及对比例1-6的三维肝脏类器官复苏液对如下表中各个实施例或对比例对应的三维肝类器官进行复苏培养，具体包括如下步骤：
获取冻存状态下三维肝类器官，37℃快速解冻，500转/分钟速离心3-5分钟后，舍弃冻存液，使用磷酸缓冲溶液洗涤两次；使用提前温浴过的复苏液添加，进行预设天数的连续培养，在培养箱中，培养条件为5% CO2，37℃。具体的操作步骤参考如下：将三维肝脏类器官接种至低粘附孔板或者微球板中，放置于盛放有三维肝脏类器官复苏液的CO2细胞培养箱中进行静置培养。在连续培养的过程中，每24小时更换复苏液/对照培养基。
从上表以及附图1-6可以看出，首次加入实施例1-5提供的复苏液的5天后，无论是三维聚球体或者水凝胶肝脏类器官内细胞形态和活率均维持良好，对比例1-4提供的常规基础培养基并不适合用于复苏三维类器官，从图5和图6可以看出，对比例5省略实施例1中的烟酰胺和对比例6省略实施例1中的地塞米松获得的复苏液复苏效果显著差于实施例1。综上所述，本申请提供的三维肝脏类器官复苏液，通过向基础培养基中添加烟酰胺、地塞米松和亚麻酸，为肝脏类器官的复苏和培养提供能量的同时促进肝脏类器官分化，同时还添加有胰岛素、肝细胞生长因子和表皮生长因子有利于促进细胞的增殖，胎牛血清的添加进一步为肝脏类器官的生长提供了充足的营养物质。本申请提供的三维肝脏类器官复苏液能够提供足够的营养供类器官内肝细胞维持活性和生长培养。其成分简单和操作简便，通过快速复苏液的应用，实现更多肝类器官保存与快速应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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