草酰基辅酶a的制备方法
阅读说明：本技术 草酰基辅酶a的制备方法 (Preparation method of oxalyl coenzyme A ) 是由 范伟 杨建立 李鹏飞 王占旗 何琦瑜 郑绍建 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种草酰基辅酶A的制备方法,具体包括以下步骤：S1,配制对甲基苯硫酚乙醚溶液；S2,量取草酰氯溶液；S3,将对甲基苯硫酚乙醚溶液添加到草酰氯中反应；S4,在反应产物中加入超纯水、静置分层；S5,移取上层溶液旋转蒸干获得草酰基对甲基苯硫酯；S6,配制草酰基对甲基苯硫酯的饱和溶液；S7,配制辅酶A溶液；S8,草酰基对甲基苯硫酯饱和溶液和辅酶A溶液反应；S9,在反应体系中加入无水乙醚分离反应产物；S10,干燥草酰基辅酶A水溶液获得草酰基辅酶A固体粉末；本发明制备过程简单,有毒有害物质使用量减少,操作人员与毒性物质接触时间缩短,反应产物的产率提高。(The invention discloses a preparation method of oxalyl coenzyme A, which specifically comprises the following steps: s1, preparing a p-methyl thiophenol ether solution; s2, measuring oxalyl chloride solution; s3, adding p-methylthiophenol ethyl ether solution into oxalyl chloride for reaction; s4, adding ultrapure water into the reaction product, standing and layering; s5, removing the upper layer solution, and performing rotary evaporation to obtain oxalyl p-methyl benzene thioester; s6, preparing a saturated solution of oxalyl p-methyl benzene thioester; s7, preparing a coenzyme A solution; s8, reacting oxalyl p-methylthiophenyl ester saturated solution with coenzyme A solution; s9, adding anhydrous ether into the reaction system to separate the reaction product; s10, drying the oxalyl-CoA water solution to obtain solid oxalyl-CoA powder; the preparation method has the advantages of simple preparation process, reduced usage amount of toxic and harmful substances, shortened contact time between operators and the toxic substances, and improved yield of reaction products.)
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，特别是涉及一种草酰基辅酶A的制备方法。
背景技术
R.Stolle利用草酰氯和对甲基苯硫酚成功合成的草酰基对甲基苯硫酯，为草酰基辅酶A的合成奠定了基础，但是该合成过程中使用的原料均具有化学性质活泼、毒性较大的特性，且操作流程相对繁琐，使得操作人员与有毒有害物质的接触较多，易对操作人员的身体造成损伤，且该合成成本较高，安全系数较低，使草酰基辅酶A的制备流程尚未实现标准化和商业化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种草酰基辅酶A的制备方法，以减少反应产物中***的用量，简化草酰基辅酶A的制备流程，减少操作人员与有毒有害反应物的接触时间，提高合成过程的安全系数，提高草酰基辅酶A的产率。
本发明所采用的技术方案是，草酰基辅酶A的制备方法，包括以下步骤：
S1，使用无水***配制摩尔浓度为1mol/L的对甲基苯硫酚***溶液；
S2，移取草酰氯置于体积为1mL的离心管中；
S3，将对甲基苯硫酚***溶液添加到草酰氯中反应生成黄色透明溶液，反应原理如公式(1)所示：
S4，在黄色透明溶液中加入超纯水至不再产生气泡，静置分层，反应原理如公式(2)所示：
S5，移取上层浑浊水层于旋转蒸发仪中完全蒸干，在蒸干时及时移除析出的黄色有机液体，获得草酰基对甲基苯硫酯；
S6，使用超纯水配制草酰基对甲基苯硫酯的饱和溶液，并在50℃下静置30s；
S7，使用超纯水配制摩尔浓度为0.5mol/L的辅酶A溶液；
S8，将辅酶A溶液添加到草酰基对甲基苯硫酯的饱和溶液中吹打均匀，反应20min，反应原理如式(3)所示：
S9，在反应体系中加入无水***吹打混匀，并将反应体系置于转速为12000rpm的离心机中离心10min分层，吸取水层即为草酰基辅酶A水溶液；
S10，将草酰基辅酶A水溶液置于真空干燥器中离心获得草酰基辅酶A固体粉末。
进一步的，所述S3中对甲基苯硫酚***溶液与草酰氯的体积比为(8：1)～(6：1)。
进一步的，所述S8中草酰基对甲基苯硫酯饱和溶液与辅酶A的体积比为40：1。
进一步的，所述S10中真空干燥器的温度为4℃，离心时间为2min，离心转速为12000rpm。
本发明的有益效果是：本发明制备草酰基辅酶A时减少了反应物无水***的使用量，简化了草酰基辅酶A的合成过程，减少了操作人员与有毒有害反应物的接触时间，提高了合成过程的安全程度和草酰基辅酶A的产率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例的制备过程图。
图2是本发明实施例草酰基对甲基苯硫酯的核磁检测图。
图3是本发明实施例草酰基辅酶A离子阱质谱阳离子模式检测结果。
图4是本发明实施例草酰基辅酶A离子阱质谱阴离子模式检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一、参照图1，草酰基辅酶A的制备方法包括以下步骤；
S1.使用无水***配制摩尔浓度为1mol/L的对甲基苯硫酚***溶液，无水***作为有机溶剂溶解对甲基苯硫酚能增大反应物之间的接触面积，使反应进行的更为彻底；
S2.用移液器吸取0.127mL草酰氯溶液于体积为1mL的离心管中；
S3.将对甲基苯硫酚***溶液添加到草酰氯溶液中，草酰氯与对甲基苯硫酚彻底反应生成透明的黄色溶液，如图1中a所示，对甲基苯硫酚***溶液与草酰氯的体积比为(8：1)～(6：1)，反应原理如式(1)所示：
若对甲基苯硫酚***溶液与草酰氯的体积比大于8：1，对甲基苯硫酚与草酰氯按照2：1的比例反应生成副产物，降低了草酰基对甲基苯硫酯的纯度；若对甲基苯硫酚***溶液与草酰氯的体积比小于6：1，则反应体系中草酰氯与对甲基苯硫酚的摩尔比远大于3：2，反应物沸腾、反应体系不稳定、目的产物挥发严重，使反应危险系数增加；
S4.在黄色透明溶液中缓慢加入超纯水产生大量气泡和刺鼻气味的气体，继续添加超纯水至不再有气泡产生，静置后溶液分为上下两层，上层为略显浑浊的水层，下层为淡黄色的有机层，如图1中b所示，反应原理如式(2)所示：
若超纯水的添加量过少，会使黄色溶液中的部分底物无法参与反应，降低了反应产物的得率，若超纯水添加量过多，则需要延长蒸干时间，增加操作人员的工作量和与有毒有害物质的接触时间；
S5.用移液器吸取上层浑浊水层在旋转蒸发仪中完全蒸干，获得白色结晶即为草酰基对甲基苯硫酯，如图1中d所示；
蒸干过程中会析出部分黄色有机液体，如图1中c所示，及时移除黄色有机溶剂以提高产物的纯度，蒸干后若结晶颜色泛黄，则说明旋转蒸发时析出的有机液体没有去除干净；
S6.使用超纯水配制草酰基对甲基苯硫酯的饱和溶液，并在50℃下静置30s，使尚未溶解的颗粒沉降，草酰基对甲基苯硫酯的饱和溶液为乳白色；
S7.使用超纯水配制摩尔浓度为0.5mol/L的辅酶A溶液；
S8.将20μL辅酶A溶液添加到草酰基对甲基苯硫酯饱和溶液中吹打混匀，静置20min使其充分反应，反应原理如式(3)所示：
其中草酰基对甲基苯硫酯饱和溶液与辅酶A溶液的体积比为40：1，此时反应产物中草酰基辅酶A的含量最高，草酰基对甲基苯硫酯饱和溶液的添加量下降时可以保证草酰基对甲基苯硫酯全数参与反应，但会使辅酶A的用量相对增加进而增大反应成本；草酰基对甲基苯硫酯饱和溶液的添加量增加可在一定程度提高辅酶A的转化率，但草酰基对甲基苯硫酯的合成成本较高；
S9.在上述体系中加入30μL无水***吹打混匀，在转速为12000rpm的离心机中离心10min，吸取水层获得草酰基辅酶A水溶液；
由于草酰基辅酶A易溶于水，对甲基苯硫酚易溶于无水***，在反应产物中添加无水***能够将对甲基苯硫酚和草酰基辅酶A分离；
S10.使用真空干燥器在4℃下离心草酰基辅酶A水溶液2min，获得草酰基辅酶A固体粉末，离心时的转速为12000rpm。
现有技术合成草酰基对甲基苯硫酯时使用的原料为：摩尔浓度为1mol/L的对甲基苯硫酚***溶液和摩尔浓度为1.5mol/L的草酰氯***溶液，在该过程中增加了***的使用量，而***作为挥发性较强的液体，具有毒性和神经麻痹作用，在反应过程易***作人员吸入对其身体造成伤害，且***中含有一定的水分，与草酰氯混合后会生成刺鼻的氯化氢和草酸，使草酰氯无法全部参与反应；本发明直接使用草酰氯参与反应，减少了***的使用量和***、草酰氯的混合操作，减少了有害物质对操作人员的侵害，避免了草酰氯的浪费。
步骤8制备草酰基辅酶A时仅有一个羰基碳活性位点与辅酶A缩合成酯，所以在前序步骤中需要保留草酰氯的一个羰基基团作为活性基团，并将另一羰基碳活性位点改造成稳定官能团—羰基，在羧基改造过程即步骤4中本发明使用超纯水取代草酰氯中的氯原子，简单易行且成本低廉，但超纯水会同时取代草酰氯中的两个氯原子，使草酰氯中没有活性基团可与辅酶A正常反应，所以步骤3中先使用对甲基苯硫酚将草酰氯中的一个羰基碳活性位点保护起来，由于对甲基苯硫酚的亲核性比水强，使得超纯水与草酰基对甲基苯硫酯反应时仅将暴露出来的羰基碳活性位点变成稳定羧基，反应产物再与辅酶A反应将对甲基苯硫酚置换下来，最终生成草酰基辅酶A。
二、检测制备的草酰基对甲基苯硫酯；
1.用1mL甲醇溶解1mg本发明实施例制备的草酰基对甲基苯硫酯，充分混匀后用移液器取出100μL置于甲醇中稀释至10ml获得样品；
2.采用高效液相色谱(HPLC，Agilent 1260)串联等离子质谱仪(Agilent 6120)检测样品的纯度及分子量；
草酰基对甲基苯硫酯的理论分子量为196g/mol，HPLC-MS阳离子模式下测得样品的相对分子质量大小为219g/mol，比草酰基对甲基苯硫酯分子量的理论值大23g/mol，而23g/mol恰好是钠离子的相对分子质量，说明HPLC-MS阳离子检测模式下，样品会结合钠离子、钾离子和氢离子形成带电离子，导致其相对分子质量比理论值大。
HPLC-MS阴离子模式下测得样品的相对分子量为123g/mol，123g/mol为样品中C-S键断裂后对甲基苯硫酚去氢负离子化的相对分子质量，由此可以确定HPLC峰图中出峰时间在2.0～2.4min的物质即为草酰基对甲基苯硫酯，统计其不同检测波长下的峰面积占比分别为97.53％，93.65％，98.66％，样品的平均纯度达到96.61％。
3.对配制好的样品进行核磁检测，核磁检测结果见图2所示，根据核磁检测结果可知待检测物质结构正确，符合预定的要求。
三、检测草酰基辅酶A；
1.用移液器吸取100μL草酰基辅酶A水溶液置于1.5mL的离心管中，加入100μL的超纯水吹打混匀；
2.在转速为12000rpm的离心机中离心10min，将上清液转移至另一1.5mL离心管中，利用离子肼质谱仪(型号：LCD Deca xp max)检测。
经计算辅酶A的理论相对分子质量为767g/mol，草酰基辅酶A的理论相对分子质量为839g/mol；离子肼质谱在阳离子模式下的检测结果如图3所示，由图3可知离子肼质谱检测到了4个不同的相对分子质量，其中768g/mol和840g/mol分别为辅酶A和草酰基辅酶A添加氢离子后的相对分子质量，774g/mol和846g/mol分别与辅酶A、草酰基辅酶A的相对分子质量相差6g/mol，且产物中的丰度变化趋势一致；离子肼质谱在阴离子模式下的检测结果如图4所示，由图4可知在阴离子模式下检测到了3个不同的相对分子质量，阴离子模式下检测到的结果比理论相对分子质量少1，是各分子去掉H+后的相对分子质量；结合阳离子模式下和阴离子模式下的检测结果，可知检测物中各物质的相对分子质量分别为767g/mol和839g/mol，检测背景干净，说明该反应成功制得草酰基辅酶A且无副产物产生。
草酰基对甲基苯硫酯的理论摩尔质量为196g/mol，故其在阴/阳离子阱质谱下的质荷比分别为195g/mol和197g/mol，然而在图3和图4中并没有出现195g/mol和197g/mol的信号，即阴/阳离子模式下均未检测到草酰基对甲基苯硫酯的存在，可断定草酰基对甲基苯硫酯反应近乎完全。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。