阅读说明：本技术 抗H5N1病毒入胞抗体PTD-3F-mFc及其应用 (anti-H5N 1 virus entry antibody PTD-3F-mFc and application thereof ) 是由 张国利 高玉伟 刘楚含 田园 岳玉环 邓欣 吴广谋 李泽鸿 王铁成 刘雨玲 雍伟 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗H5N1病毒入胞抗体PTD-3F-mFc,其碱基序列如序列表SEQID NO.7所示；制备方法为：按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2-CH3基因序列,并在各组分之间插入相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作,该设计基因序列进行人工合成,合成的基因连接入前期构建的PTS表达载体中,构建PTS-mFc表达载体；在此基础上再次克隆构建PTS-PTD-3F-mFc表达载体,将构建的表达载体转化入大肠杆菌中,诱导表达并纯化,比较其抗病毒活性,并优选单分子入胞抗体；以及本发明的单分子抗体在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用；结果表明PTD-3F-mFc抗H5N1病毒效价为600TCID50。(The invention discloses an anti-H5N 1 virus entry antibody PTD-3F-mFc, the base sequence of which is shown in a sequence table SEQID NO. 7; the preparation method comprises the following steps: designing a CH2-CH3 gene sequence of cysteine of a mutant hinge region according to an Fc gene sequence of human IgG, inserting corresponding endonuclease enzyme cutting sites among components to facilitate subsequent gene operation, artificially synthesizing the designed gene sequence, and continuously inserting the synthesized gene into a PTS expression vector constructed in the early stage to construct a PTS-mFc expression vector; on the basis, a PTS-PTD-3F-mFc expression vector is cloned and constructed again, the constructed expression vector is transformed into escherichia coli, induced expression and purification are carried out, the antiviral activity is compared, and a single molecule cell-entering antibody is optimized; the application of the monomolecular antibody in preparing the anti-H5N 1 type human avian influenza virus medicine is also disclosed; the results indicated that the PTD-3F-mFc anti-H5N 1 virus titer was 600TCID 50.)

抗H5N1病毒入胞抗体PTD-3F-mFc及其应用

技术领域

本发明属于生物工程及重大传染病防治领域，具体涉及抗高致病性禽流感H5N1病毒全人源单分子入胞抗体PTD-3F-mFc的制备，以及制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。

背景技术

人感染高致病性禽流感(简称人禽流感)，是由A型流感病毒H5N1引起的全身性或呼吸系统的传染病，病死率达60%以上。自然情况下，流感病毒感染的宿主范围有一定的特异性，据此可将病毒分为不同的群，如人流感、禽流感、猪流感等，但是流感病毒感染宿主范围的界限并不十分严格，病毒可在不同种属间传播。自1997年香港首次报道人感染H5N1亚型禽流感病毒以来，高致病性H5N1禽流感病毒在禽类中持续流行，并不断发生人类感染事件，这就赋予了禽流感全新的公共卫生意义，即高致病性禽流感病毒对人类健康的巨大威胁不仅在于造成当前严重的个体感染甚至死亡，更在于病毒持续变异，可能获得人际传播能力，导致新一轮人类流感的大流行。

在病毒不断产生耐药性的情况下，新型抗体药物可能成为应对H5N1病毒引发潜在流感大流行的有效手段。目前针对人禽流感的治疗以使用抗病毒药物为主，当前批准的抗病毒药物包括两种离子通道抑制剂和两种神经氨酸酶抑制剂，但由于耐药相关位点突变等原因，流感病毒不断产生耐药。如果连续数年对重症及危重症患者超适应症使用抗病毒药物,以及将抗病毒药物作为预防性药物普遍使用,势必不能排除增加耐药的可能性、高风险以及由此导致的公共卫生安全严重后果。在此情况下，制备新型抗流感病毒药物非常必要。抗体对于严重流感的治疗非常有效，但异源抗体免疫原性强，临床应用易引发人体严重的***反应。随着基因工程技术的发展，基因工程抗体的发展非常迅速，其中单链抗体以其特异性高、分子量小，结构简单，较亲本抗体免疫原性低，在临床应用中能够最大减轻异种蛋白引起的***反应的独特优势，吸引了众多科研工作者的目光，其制备技术已趋于成熟，特别是噬菌体展示技术更提高了抗体及抗体基因的筛选效率。因此，单链抗体对病毒感染性疾病的治疗将发挥重要的作用。但单链抗体在体内半衰期比较短，一般仅为25-30分钟左右，导致其体内发挥中和病毒作用不彻底，所以必须增加单链抗体的体内稳定性，常用的方法为单链抗体偶联其它生物大分子或基因工程融合表达单链抗体-生物大分子。

H5N1病毒最主要的中和抗体来自于表面糖蛋白血凝素（HA），所以HA成为以往主要研究靶标。然而H5N1病毒具有高度变异性，根据分子进化树分析预测结果显示H5N1病毒HA基因已演变成至少10种不同抗原性特征的变异分支，不同分支之间的免疫交叉反应较弱。鉴于病毒变异的影响，基于保守抗原组分的抗体能够对不同亚型禽流感病毒产生抗病毒作用。流感病毒基质蛋白M1是禽流感病毒主要的结构蛋白，位于病毒囊膜内侧，通过与宿主细胞靶蛋白结合而参与和调控病毒的复制、转录、释放等过程。M1蛋白序列保守，因此针对M1的抗体可以通过与M1蛋白结合，抑制其活性，干扰各亚型禽流感病毒的复制、转录及释放，从而起到广谱抗病毒的作用。

基于蛋白转导域的入胞抗体可以进入细胞，与胞内靶标抗原结合，发挥生物学活性。M1蛋白抗体能够对各种亚型禽流感病毒产生抗病毒活性，但H5N1病毒在细胞内复制、包装，且M1蛋白位于病毒囊膜内侧，抗体需要进入感染细胞才能发挥抗病毒作用。蛋白转导域（Protein transduction domain, PTD）是能介导蛋白跨过细胞膜的小肽段，能够携带大分子有效通过生物膜进入细胞。PTD介导的蛋白转运不依赖于受体、通道、能量及胞吞作用，可以直接作用于所有类型细胞的脂质双分子层完成跨膜运动，而且其跨膜功能不具有物种特异性。自PTD被识别并鉴定以来，已经有数百种化合物和蛋白质被成功用于转导，携带生物大分子进入不同的细胞，并表现出了相应的生物活性。在已发现的PTD中，人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）TAT蛋白的PTD是研究最多、功能确切的，TAT蛋白 PTD 能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA以一种浓度依赖方式高效快速地转导入细胞内，而细胞的正常结构和功能不受影响。尽管蛋白转导的机制目前尚在研究中，但其可以直接将具有治疗作用的生物大分子送入细胞发挥生物学效应这一特性为疾病的生物治疗提供了新思路，因而在医学研究领域受到广泛关注。1997 年，Vives等发现，TAT的 PTD是位于47 ～ 57 位的11个氨基酸（YGRKKRRQRRR），是一个富含碱性氨基酸的多肽片段。为了增加该PTD的转导效率，将其第二位Gly突变为疏水的His。鉴于TAT PTD的生物转导特性，将该片段与抗M1蛋白的 ScFv或ScFv-mFc融合表达后，其可将抗M1 抗体组分带入病毒感染细胞，靶向作用于胞内的M1蛋白，阻止其发挥生物功能，抑制流感病毒的装配和释放，从而起到抗病毒的作用。

发明内容

本发明目的是提供一种抗高致病性禽流感H5N1病毒全人源单分子入胞抗体PTD-3F-Fc的制备及其应用。

PTD -3F-mFc单分子抗体，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

PTD -3F-mFc单分子抗体的制备方法，它包括：

1）按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2-CH3基因序列，并在各组分之间***相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作，该设计基因序列进行人工合成，合成的基因连接入前期构建的PTS载体中，构建PTS-mFc表达载体，然后将PTD-3F基因片段克隆入PTS-mFc中，构建PTS-PTD-3F-mFc表达载体；所述的PTS载体为自行构建的PET-TrxA-SUMO载体；

2）将构建好的表达载体转化入大肠杆菌中，诱导表达并纯化，比较其抗病毒活性，并优选单分子入胞抗体。

PTD-3F-mFc单分子抗体在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。

本发明提供了PTD-3F-mFc单分子抗体，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示；制备方法为：按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2-CH3基因序列，并在各组分之间***相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作，该设计基因序列进行人工合成，合成的基因连接入前期构建的PTS载体中，构建PTS-mFc表达载体，然后将PTD-3F基因片段克隆入PTS-mFc中，构建PTS-PTD-3F-mFc表达载体；所述的PTS载体为自行构建的PET-TrxA-SUMO载体；将构建好的表达载体转化入大肠杆菌中，诱导表达并纯化，比较其抗病毒活性，并优选单分子入胞抗体；PTD- 3F-mFc单分子抗体在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。本发明选择人高致病性禽流感病毒H5N1保守序列M1蛋白为靶标抗原，利用噬菌体抗体库筛选出人源抗M1蛋白的高亲和力单链抗体；为了增加YGRKKRRQRRR的转导效率，将其第二顺位的Gly突变为His，增加其疏水性和转运率，将突变的TAT蛋白PTD与抗M1蛋白单链抗体基因连接，构建并表达PTD-ScFv。为增加其体内稳定性，将PTD-ScFv与铰链区突变的人IgG的Fc片段融合表达形式：融合蛋白为PTD-ScFv-CH2-CH3，其中所说的铰链区突变Fc为CPPCP中半胱氨酸突变为APPGP，意在防止分子内和分子间形成二硫键，从而制备出抗人禽流感病毒的全人源单分子入胞抗体；结果表明PTD-3F-mFc效价为600TCID50。

说明书附图

图1 PET-SUMO-M1蛋白表达工程菌在诱导后的表达结果；M：蛋白质Marker；1：阴性对照；2：诱导菌体超声沉淀；3：诱导菌体超声上清；4：诱导全菌；

图2 纯化后的M1蛋白；M:Marker;1:SUMO酶切并纯化后的M1样品；

图3 PTD-ScFv基因的扩增；M:Marker；1:PTD-7B PCR产物; 2: PTD-3F

图4 纯化后的PTD-3F；M:Marker;1: PTD-3F；

图5 重组表达菌PTS-PTD-3F-mFc/ BL21（DE3）的诱导表达结果；M：蛋白分子量Marker；1、3:阴性对照；2:重组表达载体PTS-PTD-7B -mFc诱导；4：重组表达载体PTS-PTD-3F -mFc诱导；

图6 纯化的PTD-3F -mFc蛋白质电泳图；M：蛋白分子量 Marker；1：分子筛前PTD-3F -mFc蛋白质原样，2-5：为分离的杂蛋白6：PTD-3F -mFc蛋白质纯化样品。

具体实施方式

实施例1 M1重组表达质粒pET-SUMO-M1的构建、表达及M1蛋白的纯化

设计并合成M1蛋白的特异性引物P1、P2，以H5N1 病毒cDNA为模板PCR扩增M1蛋白基因，并克隆入PET-SUMO载体中，构建质粒pET-SUMO-M1，然后转入T-shot感受态细胞，含卡那霉素抗性的琼脂平板进行初步筛选；挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒并且PCR鉴定，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，获得750 bp左右的条带，大小与***的目的基因相符，并进行序列的测定，证明目的片段正确***载体中，成功构建了重组质粒pET-SUMO-M1。

将重组质粒pET-SUMO-M1转化表达菌大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白SUMO-M1在40KD左右处有一明显表达带，大小与理论值相符，超声后目的蛋白主要在超声上清中，证明目的蛋白以可溶形式表达（见图1）。

M1蛋白的纯化，诱导表达菌体超声裂解后，取其上清，以20-45% 饱和硫酸铵分步沉淀，沉淀以PB(pH 7.0)重悬后进行离子交换层析（SP 4 FF），以含0.5M Nacl的PB线性洗脱，收集目的蛋白洗脱峰，目的蛋白收集峰进行Cu²⁺金属螯合层析，缓冲系统为PB +0.5MNacl(pH 7.0)，分别以50mM、150mM咪唑洗脱，目的蛋白在150 mM咪唑洗脱峰中。将150 mM咪唑洗脱液稀释至咪唑浓度为20 mM，按100:1加入SUMO蛋白酶，30℃酶切2h。酶切产物再次进行Cu²⁺金属螯合层析，平衡液为PB (pH 7.0) +20mM咪唑，流川峰以SP 4 FF离子交换层析浓缩，得到纯度在95%以上的M1蛋白，满足噬菌体抗体库筛选的需要（见图2）。

实施例2 噬菌体单链抗体库的扩增

将冻存的Tomlinson I库和J库中菌液全部接入到200 mL 2×TY培养基中（含100 µg/mL Amp和1%葡萄糖），37℃振荡培养到OD600值约为0.4，从培养液中取出50 mL菌液，加入2×10¹¹辅助噬菌体KM13，37℃静置水浴30 min，4℃，3000×g离心10 min，沉淀用50 mL 2×TY培养基（含100 µg/mL Amp，50 µg/mL Kan和0.1%葡萄糖）重悬，30℃振荡培养过夜。将过夜的产物4℃，3500×g离心30 min，收集上清40 mL加入10 mL冰冷的PEG/NaCl溶液（终浓度为20% PEG-6000，2.5mol/L NaCl），混匀后冰上放置1 h以上，4℃，3500×g离心30 min弃去PEG/NaCl溶液，沉淀用2 mL PBS重悬，11600×g，4℃，离心10 min，上清转移到无菌的离心管中，放在4℃保存（或加入终浓度为15%甘油，保存于-70℃）用于抗体库筛选同时进行噬菌体滴度测定。

实施例3 抗M1-scFv的筛选

以纯化的M1蛋白为抗原包被于96孔酶标板上，4℃过夜。次日弃上清，用2%的Milk-PBS37℃封闭2h，加入制备的次级噬菌体抗体库，室温下剧烈晃动孵育60min，静置60min后弃去液体，用含0.1%Tween-20的PBS洗涤10次，洗涤后将每孔中残留的液体轻轻拍干，每孔加入50µL洗脱液（5mg/mL的胰酶-PBS），室温下剧烈晃动10min，洗脱噬菌体，收集4℃保存。

用洗脱下的噬菌体侵染E.coli TG1，并涂布于TYE平板上（含100µg/mL氨苄青霉素和1%的葡萄糖）37℃过夜培养。利用辅助噬菌体KM13扩增噬菌体库，通过PEG/NaCl回收噬菌体。重复以上过程3次，共4轮筛选。

筛选后的噬菌体侵染E.Coli HB2151，诱导表达后，利用ELISA鉴定，置酶标仪测定OD值（波长为490nm），每个样品做双孔测定，取OD平均值。阳性克隆菌株确定标准为：OD值为阴性对照的3倍以上。

按照Tomlinson I+J试剂盒上的pIT-2载体的基因序列，合成两条特异性PCR引物扩增ScFv全基因片段。

LMB3: 5’—CAG GAA ACA GCT ATG AC—3’； 其碱基序列如序列表SEQID NO.3所示。

pHEN: 5’ —CTA TGC GGC CCC ATT CA—3’； 其碱基序列如序列表SEQID NO.4所示。

扩增出930bp左右的片段，证明获得完整的单链抗体。

实施例4 M1-ScFv的表达及纯化

将ELISA阳性菌株转接于5mL 2×TY培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素和1%的葡萄糖），37℃培养过夜。次日，转接200µL过夜培养物于2×TY培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素和0.1%的葡萄糖），37℃培养至OD600至0.9（约4 h），再加入终浓度为1 mmol/L IPTG，30℃振荡培养过夜诱导。次日将诱导菌液4200rpm离心20 min，取上清，以10%-55%饱和硫酸铵分步沉淀，沉淀用30 mmol/L PB（pH7.2）重悬，在PBS中透析过夜，透析样品进行rProtein-A FF亲和层析，洗脱样品用PBS透析过夜， 12%SDS-PAGE分析显示目的蛋白大小约为31000 Da，纯化后的scFv纯度满足进行抗病毒试验的要求。

实施例5 PTD-M1 ScFv的构建、表达及纯化

设计合成2条ScFv引物：P5、P6，上下游分别引入EcoRⅠ、HindⅢ 酶切位点，提取有生物学活性的M1-ScFv菌株质粒3F，以此为模板进行PCR（图3）。

P5 5`-GTGAATTCATAATGAAATACCTATTGCCT-3`；其碱基序列如序列表SEQID NO.5所示。

P6 5`-GCAAGCTTCTATGCGGCCCCATTCAG-3`；其碱基序列如序列表SEQID NO.6所示。

采用凝胶电泳回收上述PCR反应的扩增产物，分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR扩增回收产物及载体pET28a-PTD-GFP，其中的PTD为His突变体，T4连接酶连接PCR产物及载体片段，转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR鉴定阳性克隆，提取PCR鉴定正确的重组质粒测序，结果表明：PTD-3F片段以正确的阅读框架克隆到表达载体pET-28a中。

将构建的PET28a-PTD-3F氯化钙法转化到BL21(DE3)中，挑取单菌落，接种到LB液体培养基中振荡培养至菌液OD600≈0.5以上，加IPTG诱导表达。收集诱导菌体，进行12%SDS-PAGE检测，以未诱导工程菌作为阴性对照，结果显示，在约30KDa处出现一条明显表达带，与融合蛋白预期大小完全一致。

PTD-3F的纯化，诱导表达菌体超声裂解后，取其上清，进行Cu²⁺金属螯合层析，缓冲系统为PBS(pH7.2)，分别以20mM、200mM咪唑洗脱，目的蛋白在200 mM咪唑洗脱峰中。200 mM咪唑洗脱液进行rProteinA FF亲和层析，洗脱样品以PBS透析，即获得纯化的PTD-3F（图4）。

实施例6 PTS-PTD- 3F -mFc的基因构建、表达与纯化

按照设计合成HindⅢ-CH2- SacⅠ-CH3- XhoⅠ的基因序列，并将合成的基因序列克隆入PET-TrxA-SUMO(简称为PTS)表达载体中，成功构建PTS-mFc；再利用合成的 PTD-3F特异性引物以PET-28a-PTD-3F为模板，扩增PTD-3F片段，利用BamHⅠ和HindⅢ内切酶为工具，将PTD-3F***到PTS- mFc载体中，构建PTS-PTD-3F-mFc表达载体。

将重组质粒PTS-PTD-3F-mFc转化表达菌大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白TrxA-SUMO- PTD -3F -mFc在80KD左右处有一明显表达带（图5），大小与理论值相符，超声后目的蛋白主要在超声上清中，证明目的蛋白以可溶形式表达。

融合蛋白的纯化：诱导表达菌体超声裂解后，取其上清，以20-45% 饱和硫酸铵分步沉淀，沉淀以20mM Tris-cl +0.5M Nacl (pH 8.0)重悬后进行Cu²⁺金属螯合层析，分别以50mM、200mM咪唑洗脱，目的蛋白在200mM咪唑洗脱峰中，以20mMTris-cl +10mM Nacl (pH8.0)平衡G-25凝胶过滤层析柱，脱盐，按100:1加入SUMO蛋白酶，30℃酶切2h，蛋白酶切物补足咪唑至20m M ，再次进行Cu²⁺金属螯合层析，收集流川目的蛋白峰进行离子交换层析（Qsepharose 4 FF），缓冲系统为20mM Tris-cl (pH 8.0)，然后以20mM Tris-cl +0.5M Nacl(pH 8.0)线性梯度洗脱，目的蛋白进行Superdex 75 凝胶过滤层析，获得纯度在95%以上的PTD-3F -mFc蛋白质（图6）。

实施例7 PTD- 3F -mFc的生物活性检测

将消化后的MDCK细胞铺96孔细胞培养板(3×10⁴个细胞/孔)，待细胞长成单层吸弃培养基，以DMEM洗细胞3次，每孔加入200TCID50 H5N1 攻毒(阴性对照孔加入PBS),37℃孵育3.5h，弃细胞外液，PBS洗细胞2次，加入纯化PTD-3F-mFc（10.0μg/孔,对照加PBS），37℃作用1.5h ，吸弃细胞外液，每孔加入DMEM(含2%FBS)，37℃过夜培养。次日，以过夜培养物上清做血凝试验。

血凝试验：反应板内加入培养上清，50μL/孔，每个样品做复孔，再向每孔中加入0.85%鸡红细胞悬液50μL/孔，室温放置30min，将反应板直立观察结果。

结果显示胞内抗体可中和H5N1病毒活性，PTD-3F-mFc效价为600TCID50（见表1）。

。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 抗H5N1病毒入胞抗体PTD-3F-mFc及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgagtcttc taaccgaggt c 21

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

ccggaattct tacttgaatc gctgcatctg cact 34

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

caggaaacag ctatgac 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

ctatgcggcc ccattca 17

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

gtgaattcat aatgaaatac ctattgcct 29

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

gcaagcttct atgcggcccc attcag 26

<210> 2

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

tatcatcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtgaattca taatgaaata cctattgcct 60

acggcagccg ctggattgtt attactcgcg gcccagccgg ccatggccga ggtgcagctg 120

ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcc 180

tctggattca cctttagcag ctatgccatg agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg 240

ctggagtggg tctcagatat tagtaagtct ggttctaaga catcgtacgc agactccgtg 300

aagggccggt tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac 360

agcctgagag ccgaggacac ggccgtatat tactgtgcgg aaatgccttc tgtttttgac 420

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ggcagcggcg gtggcgggtc gacggacatc cagatgaccc agtctccatc ctccctgtct 540

gcatctgtag gagacagagt caccatcact tgccgggcaa gtcagagcat tagcagctat 600

ttaaattggt atcagcagaa accagggaaa gcccctaagc tcctgatcta tgaggcatcc 660

aagttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc agtggcagtg gatctgggac agatttcact 720

ctcaccatca gcagtctgca acctgaagat tttgcaactt actactgtca acagctgaat 780

catcggcctc agacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgggc ggccgcaggg 840

gccgcagaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaatg gggccgcaaa gcttgacaaa 900

actcacacag ctccaccggg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 960

ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 1020

gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1080

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1140

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1200

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagagctc 1260

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1320

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1380

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1440

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1500

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1560

ctctccctgt ctccgggtaa atga 1584

<210> 1

<211> 527

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Tyr His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Glu Phe Ile Met Lys

1 5 10 15

Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln

20 25 30

Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

35 40 45

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

50 55 60

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

65 70 75 80

Leu Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Lys Ser Gly Ser Lys Thr Ser Tyr

85 90 95

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

100 105 110

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

115 120 125

Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Met Pro Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

130 135 140

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

165 170 175

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

180 185 190

Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

195 200 205

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Gln Ser

210 215 220

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

225 230 235 240

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

245 250 255

Gln Gln Leu Asn His Arg Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

260 265 270

Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser

275 280 285

Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Lys Leu Asp Lys Thr His Thr Ala

290 295 300

Pro Pro Gly Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

305 310 315 320

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

325 330 335

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

340 345 350

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

355 360 365

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

370 375 380

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

385 390 395 400

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

405 410 415

Ala Lys Glu Leu Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

420 425 430

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

435 440 445

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

450 455 460

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

465 470 475 480

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

485 490 495

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

500 505 510

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 520 525