通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法
阅读说明：本技术 通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法 (Method for improving cadmium tolerance of plants by over-expressing Kandelia candel KoCSD3 ) 是由 潘铖烺 陈建明 严重玲 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因表达技术领域,公开了一种通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法,通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法使用表达载体pCAMBIA1302-KoCSD 3；以pCAMBIA1302载体为骨架,利用NcoI和BstEII两个酶切位点,将原有的GUS基因片段切除；再利用无缝克隆技术将带有双酶切位点的KoCSD3基因片段分别连入载体中,构建表达载体。超表达KoCSD3的烟草较野生型表现出更高的镉耐受性,表现在植株的根系生长发育情况上,也发现KoCSD3可提高烟草根系木质素含量且促进维管组织的木质化。与超表达秋茄其他SOD成员相比,超表达KoCSD3可显著降低烟草中镉的累积。(The invention belongs to the technical field of gene expression, and discloses a method for improving the cadmium tolerance of plants by over-expressing Kandelia candel KoCSD3, which uses an expression vector pCAMBIA1302-KoCSD3 by over-expressing Kandelia candel KoCSD3 to improve the cadmium tolerance of plants; taking a pCAMBIA1302 vector as a framework, and cutting an original GUS gene fragment by utilizing two enzyme cutting sites of NcoI and BstEII; and respectively connecting the KoCSD3 gene segments with double enzyme cutting sites into a vector by utilizing a seamless cloning technology to construct an expression vector. Tobacco over-expressing KoCSD3 showed higher cadmium tolerance than wild-type, as demonstrated by the growth and development of the root system of the plants, and KoCSD3 was also found to increase tobacco root system lignin content and promote lignification of vascular tissue. Over-expression of KoCSD3 significantly reduced the accumulation of cadmium in tobacco compared to over-expression of other members of kandelia candel SOD.)
技术领域
本发明属于基因表达技术领域，尤其涉及一种通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法。
背景技术
目前，镉(Cd)是常见的具有高毒性的环境污染物之一，其具有移动性强，难降解等特征，容易被植物根系吸收转运到植物的地上部分并在植物组织器官中累积(Benavides，et al.2005；Gill，et al.2012)。Zhang等对中国11个省的土壤调查表明，中国至少有13330公顷的农田遭受Cd污染(Zhang，et al.2000)。当镉在植物体内的含量超过一定量(5-10μg/g干重)时，就会对植物产生毒害效应，如引起植物形态、生理生化以及细胞分子水平的变化，对植物正常生长发育的各个方面造成不可逆转的伤害。值得注意的是，植物是人类接触镉的主要来源，镉会累积在植物的不同器官中，并通过食物链进入人体，极大的威胁人类的健康(Rainbow，et al.2011；Satarug，et al.2002)。
作为典型的拒盐红树植物，秋茄(Kandelia obovata)是我国东南沿海红树林的优势种，对海陆交错带高有机质、低氧以及多种重金属污染的复杂环境有较强的耐受性(Weng，et al.2012)。早年间有学者认为拒盐类红树植物根系的内皮层具有“超滤机制(ultrafiltration mechanism)”(Tolinson P.B.1986)，可阻挡重金属进入韧皮部进而减少重金属往地上部分的转运。于俊义(2014)的进一步研究结果表明秋茄根系外皮层的次生增厚现象也同样具有类似“超滤机制”的作用，并且在镉胁迫过程中外皮层的次生增厚现象先于根内皮层凯氏带的形成，被认为是凯氏带形成前的“镉迁入屏障”。最近，研究人员发现这层不可渗透的根表屏障还调控着根际气体、水分及溶质的通量，可有效阻挡镉、铅、锌和铜等多种重金属向根内迁移，是确保秋茄在重金属富集的湿地环境中正常生长的关键(Pi，et al.2009，Cheng，et al.2014)。在前期镉胁迫实验中，发明人发现秋茄Cu/ZnSOD3(KoCSD3)在秋茄根系镉耐受过程中发挥重要作用(Pan，et al.2020)。但是目前对于红树植物秋茄SOD的研究仍以酶活性和抗氧化作用相关，针对秋茄SOD在镉耐受性方面的具体功能还不明确。因此，利用基因工程技术外源超表达秋茄SOD基因来提高植物的重金属耐受性具有广阔的应用前景。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前对于红树植物秋茄SOD的研究仍以酶活性和抗氧化作用相关，针对秋茄SOD在镉耐受性方面的具体功能还不明确。
解决以上问题及缺陷的难度为：由于秋茄为非模式植物，且植株富含单宁等次生代谢产物，对其基因功能进行原位研究难度较大，导致多数人没有全面了解到红树植物秋茄SOD的生物学功能。
解决以上问题及缺陷的意义为：利用基因工程技术外源超表达秋茄SOD基因来提高植物的重金属耐受性具有广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法。
本发明是这样实现的，一种通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法，所述通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法使用表达载体pCAMBIA1302-KoCSD3。超表达就是方法，即将秋茄的这个基因转化到其他植物上，发现这条基因可以通过促进维管组织增厚的方式提升对镉的积累。
本发明的另一目的在于提供一种所述pCAMBIA1302-KoCSD3表达载体的构建方法，所述pCAMBIA1302-KoCSD3表达载体的构建方法包括以下步骤：
第一步，以pCAMBIA1302载体为骨架，利用NcoI和BstEII两个酶切位点，将原有的GUS基因片段切除；
第二步，再利用无缝克隆技术将带有双酶切位点的KoCSD3基因片段分别连入载体中，构建表达载体pCAMBIA1302-KoCSD3。
进一步，所述pCAMBIA1302-KoCSD3表达载体的构建方法使用的引物序列为：SEQID NO：1。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：超表达KoCSD3的烟草较野生型表现出更高的镉耐受性，主要表现在植株的根系生长发育情况上(图3)，也发现KoCSD3可提高烟草根系木质素含量且促进维管组织的木质化(图4)。同时，与超表达秋茄其他SOD成员(KoFSD2)相比，超表达KoCSD3可显著降低烟草中镉的累积(图5)。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的pCAMBIA1302-KoCSD3表达载体的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的pCAMBIA1302-KoCSD3质粒图谱示意图。
图3是本发明实施例提供的镉胁迫下超表达KoCSD3可促进本氏烟草根系的生长示意图；
图3中：(a)超表达KoCSD3与野生型本氏烟草在镉胁迫(+Cd：200μM；-Cd：0μM)下的30天后的植株生长情况比较(图中标尺为1cm)；(b)解剖镜下观测不同本氏烟草镉胁迫下的根系发育情况(图中表尺为0.5cm)。
图4是本发明实施例提供的超表达KoCSD3促进烟草根系木质素累积示意图；
图4中：(A)转基因型和野生型烟草(生长30天)根系木质素含量测定结果；(B)对15天的烟草幼苗(超表达KoCSD3和野生型)根系进行石蜡切片，利用激光共聚焦显微镜观测木质素荧光。采用Image-pro plus 6.0对每张切片进行木质化程度分析(每个株系挑选15张切片，每张切片挑选3个400倍视野进行拍照分析；图中标尺25μm)。
图5是本发明实施例提供的超表达KoCSD3与KoFSD2烟草植株镉胁迫下根系镉累积量测定示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明提供的pCAMBIA1302-KoCSD3表达载体的构建方法包括以下步骤：
S101：以pCAMBIA1302载体为骨架，利用NcoI和BstEII两个酶切位点，将原有的GUS基因片段切除；
S102：再利用无缝克隆技术将带有双酶切位点的KoCSD3基因片段分别连入载体中，构建表达载体pCAMBIA1302-KoCSD。
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明以pCAMBIA1302载体为骨架，利用NcoI和BstEII两个酶切位点，将原有的GUS基因片段切除。再利用无缝克隆技术将带有双酶切位点的KoCSD3基因片段分别连入载体中，构建表达载体pCAMBIA1302-KoCSD 3。载体构建的引物如表1所示。载体构建示意图如图2所示。将重组后的质粒转入大肠杆菌DH5α中测序验证。
表1 pCAMBIA1302-KoCSD3载体构建引物(SEQ ID NO：1)
表达KoCSD3的烟草较野生型表现出更高的镉耐受性，主要表现在植株的根系生长发育情况上(图3)，发现KoCSD3可提高烟草根系木质素含量且促进维管组织的木质化(图4)。同时，与超表达秋茄其他SOD成员(KoFSD2)相比，超表达KoCSD3可显著降低烟草中镉的累积(图5)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 闽江学院
<120> 通过超表达秋茄KoCSD3提高植物镉耐受性的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgggggact cttgacatgg tgaaagcagt ggctgtattc gagctggtca ccttatgcaa 60
cggtcaagcc gatg 74