利用AtALA7基因提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法
阅读说明：本技术 利用AtALA7基因提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法 (Method for improving resistance of plants to verticillium dahliae by using AtALA7 gene ) 是由 裴炎 王凡龙 侯磊 李先碧 苏梅 卓静欣 李玉杰 陈杨 宋水清 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法,其中通将AtALA7基因整合进入目标植物,获得转基因植物,并使得所述AtALA7基因在植物中表达,从而提高植物对大丽轮枝菌的抗性,所述AtALA7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。本发明利用植物对病原菌毒素的转运降解机制,提高拟南芥、烟草及棉花对黄萎病菌的抗性。因此,可以广泛应用于提高不同病原菌及其毒素的抗性,具有广泛的适用性。(The invention relates to a method for improving the resistance of plants to verticillium dahliae, wherein an AtALA7 gene is integrated into a target plant to obtain a transgenic plant, and the AtALA7 gene is expressed in the plant, so that the resistance of the plant to verticillium dahliae is improved, and the nucleotide sequence of the AtALA7 gene is shown as SEQ ID No. 12. The invention utilizes the transport and degradation mechanism of plants to pathogenic bacteria toxin to improve the resistance of arabidopsis, tobacco and cotton to verticillium wilt bacteria. Therefore, the antibacterial peptide can be widely applied to improving the resistance of different pathogenic bacteria and toxins thereof and has wide applicability.)
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，涉及提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法。
背景技术
黄萎病是一种传播广泛的世界性病害，遍及美国、中国、印度、巴西等几十个国家(Watkins,1981；Bell,1992)。黄萎病菌寄主范围很广，多达660种植物，涉及茄科、蔷薇科、豆科、十字花科等，其中农作物有184种，观赏植物323种，杂草153种(陈旭升,1998)；农作物如马铃薯、茄子、番茄、辣椒、西瓜、花生、烟草(Bhat and Subbarao,1999)，木本植物如锌树、橄榄等植物均能被黄萎病侵染(Mercado et al.,2002)，并能相互转染加剧危害，全球每年因黄萎病引起的损失达数十亿美元(Pegg,2002)。20世纪90年代后，特别是1993年，该病在我国各棉区大面积流行，发病面积高达267万公顷，造成损失皮棉1亿公斤。之后又多次在包括新疆在内的全国各主产棉区暴发成灾，年发生面积约300万hm2，年经济损失约12亿元，成为影响当前棉花生产的主要病害之一(简桂良等,2003)，被称为棉花的“癌症”。
黄萎病的致病菌属于半知菌亚门，淡色孢科，轮枝菌属，能引起棉花黄萎病的主要致病菌有大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)和黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke&Berth)。我国棉区的棉花黄萎病菌以大丽轮枝菌为主,该病原菌为一种土传性维管束真菌病害，寄主范围广、变异快，容易受到环境和寄主变化的影响而产生新的生理型。国内棉花生产以农户小田块种植模式为主，品种更换频繁，同一田地中黄萎病菌的类型可能有多种，这也是防控棉花黄萎病较为困难的原因之一(徐理等,2012)。大丽轮枝菌其微菌核能在土壤中存活多年，防治难度极大，是几乎所有棉花生产国棉产量的主要限制因子，目前尚无有效的防治手段。
关于黄萎病菌致病机理目前存在两种假说，即“堵塞学说”和“毒素学说”(Pegg etal.,2002)。堵塞学说认为病原菌侵入寄主植物体内并在其中大量增殖，邻近的薄壁细胞为了防御病原菌侵入而产生大量的胶状物质阻塞导管，使水分和养分运输困难，病原菌生成的分生孢子借助蒸腾作用侵染寄主植物的地上部分，最终扩散至整个植株(Carder etal.,1987)。毒素学说认为大丽轮枝菌侵染寄主后，会分泌一些毒素或其他物质，如蛋白质-脂多糖复合物、糖蛋白和细胞壁降解酶等(Emilie et al.,2006)，它们抑制寄主植物的防御机制，引起寄主细胞死亡，导致植株发病。
随着对黄萎病致病机理研究的不断深入，人们发现导管堵塞不是黄萎病引起植物萎蔫的主要原因，黄萎病菌产生的毒素在导致植物萎蔫中发挥重要作用(Fradin et al.,2006)。Buchner等从感病马铃薯的毒素混合物中分离出一种具有毒性的小糖肽，并且认为是从大分子的复合物中降解得来(Buchner et al.,1982)，研究显示该毒素是一种脂-糖蛋白复合体(Protein-lilpopolysaccharide complex,PLPC)，用蛋白酶Pronase E处理获得的各菌株毒素，发现其致萎活性消失，说明菌株毒素的蛋白质组分在致萎作用中占有至关重要的地位(章元寿等,1990)。还有研究表明病原菌分泌到胞外的蛋白质参与寄主互作过程，突破寄主植物的防御反应，可引起寄主免疫机制的改变，从而引起黄萎病症状。将大丽轮枝菌分泌系统蛋白(LHS)编码基因敲除后，突变体向胞外分泌蛋白的量大幅减少，接种棉花的致病性相比野生型也大大降低(田李等,2011)。利用细胞骨架检测大丽轮枝菌培养上清液中的蛋白粗提物毒性，结果发现大丽轮枝菌分泌蛋白中含有可以和寄主植物中一些靶标蛋白相互作用的效应子(Yao et al.,2011)。维管束病原菌的生长和发育控制元件Vta2基因可以控制125个分泌蛋白的表达，敲除后的突变体不能在寄主植物体内定殖，也不能引起黄萎病症(Trans et al.,2014)。也有研究表明大丽轮枝菌毒素具有毒素和激发子的双重功能，在低浓度情况下可作为激发子起作用，而高浓度的大丽轮枝菌毒素则作为致病因子起作用(Davis et al.,1998；Wang et al.,2004)。
实践表明，种植和培育抗病品种是防治病害唯一经济有效的途径。传统的防治技术及抗黄萎病新品种培育等措施在防治黄萎病时，存在一时一地的效果，且黄萎病菌分化迅速，通过常规的防治措施很难达到广谱性的效果，黄萎病的危害依然呈严重态势。随着植物基因工程技术的不断发展以及对黄萎病菌致病机理研究的逐步深入，通过导入外源基因提高植物对黄萎病菌毒素的转运与降解功能，提高植物对毒素的解毒功能，进而增强植物对黄萎病菌的抗性，是提高植物抗黄萎病的有效途径，且该方法不存在生理型的限制，具有广谱性的特点，是防治黄萎病菌的有效手段。
本研究基于大丽轮枝菌毒素的致病机理，通过调控植物对大丽轮枝菌毒素的转运降解能力，提高植物自身解毒功能，进而提高对黄萎病的抗病性，是一条合理可行的方法。此外，通过该方法还有望提高禾本科植物对呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等毒素的转运与降解功能，对提高粮食、饲料安全有显著作用，具有重要应用价值。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法；
本发明的第二个目的在于提供一种抗黄萎病的转基因植物的制备方法；
本发明的第三目的在于提供AtALA7基因在提高植物抗病性的新用途。
AtALA7属于P4-ATPases家族成员，是包含10个跨膜域的膜蛋白，该蛋白家族在维持细胞膜磷脂不对称分布、起始囊泡形成及介导细胞内蛋白运输中发挥重要作用。AtALA7基因编码AtALA7蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。以模式植物拟南芥中的AtALA7基因为模型，并以具有相同解毒机制的P4-ATPase蛋白的棉花和烟草验证，完成了本发明的研究。
根据本发明的一方面，一种提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法，其中通过将AtALA7基因整合进入目标植物，获得转基因植物，并使得所述AtALA7基因在植物中表达，从而提高植物对大丽轮枝菌的抗性，所述AtALA7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
并不限定任何机理，本发明的研究表明AtALA7基因可以通过促进大丽轮枝菌毒素CIA进入溶解型液泡，因此将带有P4-ATPases家族基因AtALA7的重组植物表达载体导入目标植物中，实现该基因在植物中的组成型表达，提高转基因植物对CIA的解毒能力，进而获得抗大丽轮枝菌的转基因植物，所述的转基因植物对大丽轮枝菌的抗性优于目标植物。
本发明所述的方法包括下述步骤：
1)构建含有来自AtALA7基因的重组植物表达载体；
2)将所述重组植物表达载体导入目标植物中，使得AtALA7基因在目标植物中组成型表达；
3)获得具有对大丽轮枝菌抗性的转基因植物。
在本发明的的方法中，优选的目标植物可以为拟南芥、烟草或棉花。
在本发明所述的方法中，构建的重组植物表达载体的结构如图7A所示。
根据本发明的另一方面，一种抗大丽轮枝菌的转基因植物的制备方法，包括以下步骤：
i)获得AtALA7基因，并将其可操作地***植物表达载体中，构建植物表达载体；
ii)用步骤i)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；
iii)用步骤ii)获得的转化体转化植物，获得转基因植物；
所述AtALA7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
根据本发明的再一方面，提供AtALA7基因在提高植物对大丽轮枝菌抗性和抗黄萎病中的用途，其中通过将AtALA7基因整合进入目标植物，获得转基因植物，并使得所述AtALA7基因在目标植物中表达促进CIA向液泡的转运，进而提高目标植物对大丽轮枝菌的抗性和对黄萎病的抗病性，所述AtALA7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.12
ATGGGGCGTCGTAGAATAAGATCAAGGATCCGGAAAAGCCATTTCTACACCTTTAAATGTCTCAGACCAAAAACCCTAGAAGATCAAGGACCTCATATCATTAATGGACCTGGATACACGAGAATTGTTCATTGTAACCAACCTCATTTGCATTTGGCTAAAGTCCTTAGGTACACTTCAAATTATGTGTCCACCACTAGGTATAATCTCATTACTTTCTTGCCCAAATGCTTGTATGAGCAGTTCCACCGTGTTGCCAATTTCTACTTCCTCGTTGCTGCTATTCTCTCTGTCTTTCCTCTCTCCCCATTCAACAAATGGAGTATGATCGCTCCTTTGATTTTTGTGGTTGGGCTTAGTATGGGTAAAGAGGCGTTGGAGGATTGGCGGAGGTTTATGCAGGATGTGAAGGTGAATTCGAGGAAAGCTACTGTTCACAGAGGGGATGGTGATTTTGGTCGTAGGAAGTGGAAGAAGTTACGTGTAGGGGATGTTGTAAAGGTGGAAAAGGATCAATTTTTCCCTGCTGATTTGCTCTTATTGTCATCTAGTTATGAGGATGGGATCTGTTATGTGGAGACGATGAACTTAGATGGTGAAACCAACTTGAAAGTGAAAAGATGTTTGGATGTTACTTTGCCTTTGGAACGGGATGATACTTTCCAGAGTTTCTCCGGAACTATCAAATGTGAAGATCCCAATCCTAACCTCTATACCTTTGTTGGAAATCTTGAATATGACGGTCAGGTTTATCCGCTTGATCCTAGCCAGATTCTCTTGAGAGACTCAAAGCTCAGGAACACGTCTTATGTCTATGGGGTGGTGGTTTTTACTGGCCATGACACCAAAGTCATGCAGAATTCAACAAAATCCCCTTCAAAGAGAAGCAGAATCGAGAAGAGAATGGACTACATTATATATACTCTCTTTGCCCTCCTTGTGCTTGTCTCCTTCATCAGCTCATTGGGTTTTGCAGTGATGACAAAAATGCATATGGGAGATTGGTGGTACTTACGACCGGATAAGCCTGAGCGGTTAACAAATCCAAGAAATCCTTTTCACGCTTGGGTCGTCCATCTGATCACTGCTGTCTTGCTTTATGGGTACTTGATTCCCATCTCATTGTATGTTTCCATCGAGCTCGTAAAAGTTTTGCAGGCAACTTTCATAAACCAAGACTTGCAGATGTATGACAGCGAGAGTGGGACTCCAGCTCAAGCACGTACATCGAATTTAAATGAAGAGCTGGGACAAGTTGACACAATCCTTTCCGATAAAACTGGAACTTTGACTTGTAACCAGATGGATTTTCTGAAATGCTCCATTGCGGGTACTTCTTATGGTGTTCGAGCCAGTGAAGTGGAACTAGCTGCTGCAAAACAAATGGCGATAGATCTCGACGAGGAGCAAGGTGAGGAAGTGACCCACCTTCCAAGGACTAGAGGAAGGATGCATGGATATGCTAAAATGCCCAGCAAGACATCATCAGATATTGAGTTGGAGACTGTAATCACTGCTACTGACGAAGGGGATCAGACCCAGTCCACTGGTATCAAGGGTTTTAGTTTTGAGGATCAACGTCTCATGGGTGGAAACTGGTTAAATGAACCTAATTCAGATGACATTTTGATGTTTCTGCGTATACTTGCGGTTTGTCACACTGCTATCCCCGAGGTGGATGAAGATACTGGAAAGTGTACTTATGAAGCAGAGTCTCCTGACGAAGTTGCTTTCCTTGTTGCCGCTGGGGAGTTTGGTTTTGAGTTTACTAAAAGAACTCAATCAAGTGTGTTTATCAGTGAACGACATTCAGGCCAACCAGTTGAAAGAGAATATAAAGTTTTAAATGTTTTGGACTTCACTAGCAAAAGAAAAAGAATGTCTGTTATCGTCCGTGATGAAAAAGGACAGATTCTTCTACTCTGTAAAGGTGCTGACAGCATAATATTTGAACGGTTATCCAAGAATGGAAAAAATTATCTGGAAGCCACTTCAAAGCATTTGAATGGATACGGTGAAGCTGGTTTACGCACATTGGCACTCAGTTATAGAAAGCTGGATGAGACCGAGTATTCGATATGGAACAGTGAATTTCACAAAGCCAAAACTTCAGTCGGAGCTGACAGAGATGAAATGCTCGAAAAGGTATCTGACATGATGGAGAAGGAATTGATTCTTGTCGGTGCTACTGCAGTGGAAGACAAACTGCAGAAAGGGGTGCCTCAATGCATAGATAAACTTGCCCAAGCTGGTCTTAAGATATGGGTTTTGACAGGAGATAAGATGGAGACAGCAATTAACATAGGATATGCCTGCAGTTTGCTGAGACAGGGTATGAAGCAGATATACATAGCTCTAAGAAATGAAGAGGGATCATCCCAAGACCCAGAAGCAGCTGCGAGAGAGAACATTTTGATGCAAATCATAAATGCTTCACAGATGATCAAACTAGAGAAGGATCCACATGCAGCGTTTGCTTTGATCATTGATGGAAAGACACTTACATATGCTTTGGAGGATGATATTAAGTATCAGTTTCTTGCCCTGGCAGTTGACTGTGCTTCAGTGATATGCTGTCGTGTCTCTCCCAAGCAGAAAGCGCTTGTAACAAGACTAGCAAAAGAAGGAACAGGAAAGACGACCTTGGCAATTGGTGATGGTGCAAATGATGTTGGAATGATTCAAGAAGCCGATATAGGTGTAGGCATCAGTGGCGTGGAAGGCATGCAGGCTGTAATGGCAAGCGACTTCTCCATAGCCCAATTTCGGTTTCTAGAGAGACTACTTGTTGTCCATGGGCACTGGTGCTACAAAAGAATAGCCCAGATGATCTGTTACTTCTTCTACAAGAACATAACATTTGGTCTGACTCTCTTCTACTTCGAGGCTTTCACCGGGTTTTCTGGTCAAGCCATATACAACGACTCCTACTTGTTGCTGTTTAACGTTATTCTCACATCTCTCCCTGTCATCGCCCTTGGAGTTTTTGAGCAAGACGTGTCTTCAGAAGTCTGCTTACAGTTCCCAGCACTGTACCAGCAAGGCCCCAAGAACCTGTTCTTTGACTGGTACAGAATCATCGGGTGGATGGCAAATGGAGTCTATGCATCCGTAGTCATATTTTCCCTCAACATTGGCATCTTTCATGTCCAATCTTTCTGTTCTGGTGGCCAAACAGCAGACATGGACGCAATGGGAACTGCAATGTTCACGTGCATCATCTGGGCAGTGAACGTACAGATAGCTTTAACCATGAGCCATTTCACATGGATCCAACACGTCTTGATCTGGGGAAGTATCGTCACCTGGTACATCTTCCTTGCCCTATTTGGCATGTTACCTCCAAAAGTCTCAGGAAACATCTTCCACATGCTCTCGGAAACCCTAGCACCTGCACCAATCTTCTGGCTTACCTCACTGCTGGTCATAGCCGCCACAACACTCCCCTACTTGGCTTACATTTCGTTCCAGAGATCGTTAAACCCTCTGGACCATCACATCATCCAAGAGATCAAGCATTTCAGAATCGACGTCCAGGACGAATGTATGTGGACGAGGGAAAGATCAAAGGCTAGAGAGAAGACCAAGATTGGAGTGACAGCTCGTGTTGATGCCAAGATCCGCCAGCTGAGAGGAAGGCTCCAGAGAAAACACTCCATATTGAGCGTTATGAGCGGTCTGAGTGGCGTCTCAGCATCAACTGATACAACTTCCACCACACAACATAGTTGA
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的方法，包括如下的步骤：
1)获得拟南芥AtALA7基因：引入KpnI和SpeI酶切位点设计引物，然后以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物即为添加酶切位点的AtALA7基因序列；
2)构建组成型表达AtALA7基因的植物表达载体：将扩增获得的AtALA7基因序列融合绿色荧光蛋白EGFP，然后***双子叶植物表达载体pLGN-35S-Nos，构建新的植物表达载体，命名为pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos；
3)植物的遗传转化：利用农杆菌浸花法与叶盘转化法，将上述步骤2)获得的pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos植物表达载体整合入植物基因组，实现AtALA7在转基因植物内的组成型表达，通过促进CIA进入溶解型液泡而提高转基因植物对大丽轮枝菌的抗性；
4)抗大丽轮枝菌的AtALA7转基因植株的获得：将上述步骤3)获得的转基因植物进一步进行繁殖、分子鉴定和抗病性鉴定，获得抗大丽轮枝菌的AtALA7转基因植株。
进一步，组成型表达的pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos植物表达载体构建的步骤包括：获得拟南芥AtALA7的cDNA后，设计上游引物：5’-GACTAGTATGGGGCGTCGTAGAATAAGATC(SpeI)-3’，下游引物5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(KpnI)-3’进行PCR扩增，扩增产物融合绿色荧光蛋白EGFP，回收目的片段(AtALA7-EGFP)，与pLGN-35S-Nos载体分别进行SpeI和KpnI双酶切，分别回收酶切后的目标片段，再利用T4 DNA连接酶将回收片段与线性化载体连接，构建一个新的植物表达载体，命名为pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos，以实现AtALA7基因在转基因植物内的组成型表达。
在本发明的一个优选实施方式中，将来自拟南芥的AtALA7基因分别转入拟南芥、烟草及棉花中，实现该基因在转基因植株中的组成型表达，利用AtALA7转运大丽轮枝菌毒素CIA进入溶解型液泡，提高转基因植物对大丽轮枝菌毒素的解毒能力，进而提高转基因植物对大丽轮枝菌的抗性。
本发明结合拟南芥AtALA7突变体ala7-5对大丽轮枝菌毒素CIA敏感且丧失将其转运至液泡的特性，结合大丽轮枝菌分泌毒素在致病中的重要作用，创造性地提出利用AtALA7基因在转基因植物中组成型表达，促进转基因植物中CIA向溶解型液泡的转运，提高其对CIA的解毒能力，进而提高转基因植物对大丽轮枝菌抗性的策略。
本发明主要是利用转基因产物对大丽轮枝菌毒素的转运降解机制，提高其对大丽轮枝菌的抗病性，更进一步的以相同的方式利用转基因产物提高植物对其他真菌毒素的解毒能力也是本发明的保护范围。同时本发明中涉及的植物表达载体，转基因植株等也在本发明的保护范围内。
本发明获得的AtALA7转基因拟南芥，T4代纯合转基因株系OE-9与OE-12经100μg/mL CIA处理9d，叶片均为绿色，根继续生长且侧根发达。OE-9根长分别为WT和ala7-5的0.71与1.17倍；OE-12分别为WT和ala7-5的0.73与1.18倍(图9B,D)。FITC-CIA(5μg/mL)与FM4-64(4μM)处理WT，ala7-5及OE-9拟南芥6h，OE-9荧光强度分别是WT和ala7-5的0.6倍与8倍(图10)。表明表达AtALA7促进了CIA向液泡的转运，提高拟南芥对其耐受性。130μg/mL大丽轮枝菌L2-1的亲脂性粗毒素处理9d，WT与ala7-5叶片出现不同程度白化，而OE-9叶片均为绿色(图12A)，OE-9叶绿素含量分别比WT和ala7-5高8.11％与53.5％(图12B)，表明超量AtALA7提高了拟南芥对大丽轮枝菌亲脂性粗毒素的耐受性。接种大丽轮枝菌强致病力菌株L2-1(孢子浓度2×108个/mL)21d，OE-9病情指数分别比WT和ala7-5低22.5％与43.3％(图13B)，表明超量AtALA7提高了拟南芥对大丽轮枝菌的抗性。以上结果表明超量AtALA7促进了CIA向液泡的转运，提高了拟南芥对CIA及大丽轮枝菌亲脂性粗毒素的耐受性，进而提高了拟南芥对大丽轮枝菌的抗性。450μg/mL CIA处理野生型和转基因烟草幼苗3d，表达AtALA7基因的21号和22号转化子其白化叶片率分别比野生型降低66.5％和66.1％(图15B)，表明表达AtALA7提高烟草对CIA的耐受性。灌根法接种V991菌液(5×108Conidia/mL，50mL/株)3周，表达AtALA7的21和22号转化子其病情指数分别比野生型降低了29.2％和32.2％(图16B)，表明异源表达AtALA7提高烟草对大丽轮枝菌的抗性。此外，瞬时表达AtALA7的棉花子叶其病斑面积明显小于对照(图18A)，分别比对照降低57.2％和56％(图18B)，表明瞬时表达提高棉花子叶对大丽轮枝菌的耐受性。以上研究结果表明，利用本发明方法获得的转基因拟南芥、烟草可以促进CIA进入溶解型液泡，进而提高对大丽轮枝菌的抗性。说明，本发明提供的促进CIA进入溶解型液泡而提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法效果显著。该方法不仅适用于拟南芥、烟草及棉花，所有能受大丽轮枝菌侵染的植物均可利用该方法降低促进CIA进入溶解型液泡提高对大丽轮枝菌的抗性。
本发明提供的方法主要是利用植物对病原菌毒素的转运降解机制，降低病原菌毒素含量达到解毒的目的，进而提高植物的抗性，因而不具有病原菌小种抗性的特点。因此，该方法不存在小种专一性抗性的限制，可广泛应用于提高不同病原菌生理小种的抗性。
附图说明
图1为GC-MS检测大丽轮枝菌菌株L2-1亲脂性粗毒素
A为大丽轮枝菌毒素-乙酸肉桂酯(CIA)标准品(5.6mM)的GC-MS检测结果，CIA出峰时间为8.35min；B大丽轮枝菌菌株L2-1亲脂性粗毒素的GC-MS检测结果。
图2为检测CIA对烟草与拟南芥的致萎活性
A为400μg·mL-1与800μg·mL-1处理野生型烟草3d的表型；B为MS培养基中添加不同浓度CIA(0,100,200及300μg·mL-1)处理野生型拟南芥7d的表型。
图3为AtALA7在CIA与大丽轮枝菌L2-1处理下的表达量检测
A为CIA(100μg·mL-1)诱导下AtALA7表达量检测结果；B为大丽轮枝菌L2-1诱导下AtALA7表达量检测结果。检测用内参基因为AtActin2，数据为3次重复的平均值。
图4为AtALA7纯合突变体鉴定
A为T-DNA***位点在第1个外显子(salk_125598)。exon：外显子；intron：内含子；LP：左边界引物；LP：右边界引物；LBb1.3：T-DNA引物。B为PCR鉴定纯合突变体ala7-5。M：DL2000；WT：野生型拟南芥Col-0；ala7-5：拟南芥AtALA7 T-DNA纯合突变体；a：LP+RP引物扩增结果；b：LBb1.3+RP引物扩增结果。C为QT-PCR鉴定AtALA7纯合突变体。AtALA7：AtALA7CDS扩增结果；AtActin2：内参基因扩增结果；26与34cycles：PCR扩增循环数。
图5为AtALA7突变体及其互补植株对CIA的耐受性
A为MS与MS+CIA(100μg/mL)处理拟南芥幼苗7d的表型。WT：野生型拟南芥；ala7-5：AtALA7纯合突变体；ala7-5/AtALA7-eGFP：ala7-5互补拟南芥(ala7-5中表达C端融合eGFP的AtALA7)；标尺＝5mm。B为白化叶片数统计结果。C为侧根数统计结果。
图6为AtALA7突变体及其互补植株对CIA向液泡的转运
A为WT,ala7-5及互补拟南芥(ala7-5/AtALA7-eGFP)对FITC-CIA的转运。FM4-64(4μM)与FITC-CIA(5μg/mL)处理8h；FM4-64：膜染料，用于染色细胞膜与液泡膜；FITC-CIA：异硫氰酸荧光素标记的乙酸肉桂酯；Merge：FM4-64与FITC-CIA荧光通道的叠加；标尺＝5μm。B为液泡中荧光强度统计，n＝22。C为WT细胞中荧光分布。D为ala7-5细胞中荧光分布。E为互补拟南芥(ala7-5/AtALA7-eGFP)细胞中荧光分布。荧光强度与细胞中荧光分布均由ImageJ完成。**T检验，P≤0.01。
图7为pLGN-35S-AtALA7-Nos植物表达载体的构建
A为pLGN-35S-AtALA7-Nos植物表达载体示意图，该载体包含一个2×35S启动的GUS::NPTⅡ融合基因的表达框，一个35S启动的AtALA7基因的表达框；B为pLGN-35S-AtALA7-Nos载体质粒酶切验证结果；M：DNA分子量标准Marker15；ALA7：pLGN-35S-AtALA7-Nos载体质粒经酶切后的获得的ALA7目标片段。
图8为转基因拟南芥中AtALA7基因的表达水平
Col-0：野生型拟南芥；2、6、9、9-6、11-1、12-1和15-3：AtALA7转基因拟南芥独立的转化子。检测用内参基因为AtActin2，数据为3次重复的平均值。
图9为超表达AtALA7拟南芥对CIA的耐受性
A为MS中生长9d的拟南芥幼苗表型。B为MS+CIA(100μg/mL)处理拟南芥幼苗9d的表型。WT：野生型拟南芥；ala7-5：AtALA7纯合突变体；OE-9与OE-12：超量AtALA7拟南芥；标尺＝5mm。C为MS中生长9d的根长统计结果，n＝17。D为MS+CIA(100μg/mL)处理9d的根长统计结果，n＝17。
图10为超表达AtALA7促进CIA向液泡的转运
A为WT,ala7-5及超量AtALA7拟南芥对CIA的转运。FM4-64(4μM)与FITC-CIA(5μg/mL)处理6h；FM4-64：膜染料，用于染色细胞膜与液泡膜；FITC-CIA：异硫氰酸荧光素标记的乙酸肉桂酯；Merge：FM4-64与FITC-CIA荧光通道的叠加；标尺＝10μm。B为液泡中荧光强度统计，n＝23。**T检验，P≤0.01。
图11为CIA在拟南芥根部细胞被转运至溶解型液泡
FM4-64(6μM)及FITC-CIA(15μg/mL)处理溶解型液泡标记蛋白拟南芥(γ-Tip-RFP)6h，FITC-CIA进入溶解型液泡，Bar＝20μm。
图12为超量AtALA7提高拟南芥对大丽轮枝菌亲脂性粗毒素的抗性
A为130μg/mL大丽轮枝菌V991亲脂粗毒素处理9d的表型,Bar＝1cm。B为叶绿素含量测定结果。MS：MS培养基；MS+toxin：MS培养基中添加130μg/mL大丽轮枝菌V991亲脂粗毒素；FW：鲜重。*T检验，P≤0.05；**T检验，P≤0.01。
图13为超量AtALA7提高拟南芥对大丽轮枝菌V991的抗性
A为WT,ala7-5及超量AtALA7拟南芥对大丽轮枝菌V991的抗性。WT：野生型拟南芥；ala7-5：AtALA7纯合突变体；OE-9，OE-11及OE-12：超量AtALA7拟南芥；大丽轮枝菌V991接种拟南芥(孢子浓度2×108个/mL),21d拍照，标尺＝3cm；B为V991处理21d病情指数统计。
图14为AtALA7转基因烟草中AtALA7的转录水平表达分析的内参基因为NtActin，数据为3次重复的平均值。
图15为AtALA7转基因烟草对CIA的耐受性
A：上面，MS培养基；下面，MS培养基添加CIA(450μg/mL)；WT：野生型烟草幼苗；-21:和-22：表达AtALA7基因烟草T1代幼苗；标尺＝0.5cm。B：发病情况统计。星号表示统计学上用t检验计算出显著差异，“**”表示差异极显著(P＜0.01)。
图16为AtALA7转基因烟草对大丽轮枝菌的耐受性
A：接种大丽轮枝菌(V991)3周后的烟草；WT：野生型烟草；AtALA7：表达AtALA7烟草植株；白色箭头为发病叶片。标尺＝2cm。B：病情指数统计。-21:和-22：表达AtALA7基因烟草T1代幼苗。星号表示统计学上t检验计算出的显著性差异，“**”表示极显著差异(P＜0.01)。
图17为瞬时表达棉花子叶后的AtALA7表达量检测表达分析的内参基因为GhHis3，数据为3次重复的平均值。
图18为瞬时表达AtALA7的棉花子叶对大丽轮枝菌的耐受性
A：注射农杆菌2d后，接种大丽轮枝菌L2-1菌液(9×107Conidia/mL)10d的棉花子叶。EV：注射空载农杆菌的对照；AtALA7：注射35S::AtALA7农杆菌；标尺＝1cm。B：病情指数统计。星号表示统计学上用t检验计算出显著差异，“**”表示差异极显著(P＜0.01)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定。
本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。
1、发明技术核心策略的提出
1.1 AtALA7基因缺失拟南芥纯合突变体的获得
1.1.1拟南芥突变体获得与种植
拟南芥突变体购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological ResourceCentre,ABRC)的T-DNA***突变体(图4A-C)，编号为：ala7(SALK_125598)。
拟南芥种子培养方法：将种子分装到1.5mL离心管中，用75％酒精0.1％吐温80反复振荡25min进行表面消毒，灭菌蒸馏水冲洗种子3-5次后，0.2％琼脂糖的无菌培养基重悬种子，用移液器将种子铺在在1/2MS固体培养基(2.2g/L MS盐，15g/L蔗糖，2g/L Gelrite，pH 6.0)。4℃冰箱中冷处理2d后按以下条件培养：
16h光照/8h黑暗，150μmolm-2S-1光照强度、70％相对湿度、温度为22℃。当幼苗生长10d后，移到土中(营养土与蛭石的比例大约为1:1)，用加入1.5L水和1L B5营养液培养植物。温室光照条件：16h光照/8h黑暗，温度为22℃。
1.1.2乙酸肉桂酯(CIA)的致萎活性检测
前人通过丁醇萃取结合GC-MS等方法检测到大丽轮枝菌产生的低分子量毒素-乙酸肉桂酯(CIA)，其浓度为40μg/mL即引起橄榄枝条产生萎蔫症状(Laouane et al.,2013)，表明黄萎病菌产生的毒素物质除了高分子量的蛋白脂多糖复合体外，还存在低分子量毒素。对实验室保存的强致病力大丽轮枝菌L2-1，于察氏培养基(30g/L蔗糖,3g/L NaNO3,0.5g/L MgSO4·7H2O,0.5g/L KCl,100mg/L FeSO4·7H2O,1g/L K2HPO4,pH 7.0)培养21天(26℃，200rpm)，经4层纱布过滤、浓缩、乙酸乙酯萃取所得亲脂性粗提液，经GC-MS检测，在8.35min获得与CIA标准品同样的峰(图1)，表明大丽轮枝菌L2-1的确产生CIA。
为检测CIA对植物的毒性与处理的适宜浓度，用不同浓度的乙酸肉桂酯处理野生型拟南芥、烟草及棉花。分别用低浓度(400μg/mL)与高浓度(800μg/mL)处理野生型烟草3d，结果显示低浓度处理下烟草下部叶片萎蔫、黄化，症状与黄萎病菌处理类似；高浓度处理下整株枯死(图2A)。选择生长2周，大小接近的野生型拟南芥，转移至MS与含不同浓度CIA(0,100,200及300μg·mL-1)的MS培养基处理7d，结果显示，CIA为200μg·mL-1时拟南芥生长受到明显抑制，全部子叶与大部分真叶白化；CIA浓度为300μg·mL-1时，WT均白化死亡(图2B)。表明CIA严重影响烟草与拟南芥的生长发育。以上结果表明CIA显著抑制烟草与拟南芥的生长，但CIA对不同植物的抑制浓度不同。
1.1.3 AtALA7受CIA诱导上调表达
用100μg/mL大丽轮枝菌亲脂性毒素乙酸肉桂酯(CIA)处理拟南芥幼苗，QRT-PCR结果显示，AtALA7在CIA处理1h即迅速上调表达，在6h表达量最高，是未处理(Control check，CK)的19倍；在处理的12h与24h仍高于CK(图3A)。表明AtALA7受CIA诱导上调表达。此外，AtALA7受大丽轮枝菌V991诱导呈现先降低后升高的趋势(图3B)，表明AtALA7也受V991诱导，但响应强度低于CIA诱导。
1.1.5对CIA敏感的拟南芥突变体的获得
为明确AtALA7的功能，购买其T-DNA***突变体(Salk_125598)，***位点在第1个外显子(图4A)。取拟南芥突变体叶片约0.1g，利用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab产品,目录号：DN15)提取DNA，操作严格按照说明书进行。突变体筛选PCR引物根据Signal网站设计(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)。
PCR反应总体系为10μL：1μL模板、引物各0.5μL(20mmol·L-1)、5μL2×Taq PCRMaster Mix、3μL ddH2O。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；再于72℃延伸10min。
扩增引物为：
LP-ala7:5’-GGGGCGTCGTAGAATAAGATC-3’(SEQ ID NO.1)
RP-ala7:5’-GTTAACCGCTCAGGCTTATCC-3’(SEQ ID NO.2)
LBb1.3:5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’(SEQ ID NO.3)
经PCR筛选，获得纯合突变体ala7-5(图4B)。对其F2代进行QT-PCR筛选(图4C)，检测不到AtALA7的表达，表明ala7-5为纯合突变体。
在1/2MS固体培养基中种植野生型(Col-0)与纯合突变体拟南芥(ala7-5)，待根长至2cm左右，转移至含100μg/mL CIA的1/2MS固体培养基中，7d后观察、拍照并统计白化叶片所占比率，结果显示，ala7-5叶片白化严重，侧根生长受到严重抑制；不添加CIA则二者间无显著差异。统计结果显示，CIA处理下ala7-5白化叶片数显著升高，是WT的0.95倍；侧根数比WT减少75.46％；而ala7-5互补拟南芥(ala7-5/AtALA7-eGFP)幼苗对CIA的耐受性与WT一致(图5A-C)。且AtALA7受CIA诱导上调表达(图3)。以上结果初步表明AtALA7在拟南芥CIA耐受性中发挥重要作用。
为明确AtALA7是否与CIA的转运有关，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的乙酸肉桂酯(FITC-CIA)及膜染料FM4-64处理WT，ala7-5及互补拟南芥8h，结果显示FITC-CIA均进入WT与互补拟南芥液泡中，而在ala7-5中则多分布于细胞膜与细胞质中(图6A)。液泡中FITC-CIA荧光强度统计结果显示，ala7-5比WT减少63.87％，互补拟南芥与WT间无显著差异(图6B)。表明AtALA7在CIA向液泡的转运中发挥重要作用。
1.2发明技术核心策略的提出
实施例1.1.5的研究结果表明，AtALA7基因T-DNA突变体ala7-5对CIA敏感，且失去了转运CIA进入液泡的功能。AtALA7属于P4-ATPases家族成员，是包含10个跨膜域的膜蛋白，该蛋白家族在维持细胞膜磷脂不对称分布、起始囊泡形成及介导细胞内蛋白运输中发挥重要作用。因此我们推测，CIA可能通过AtALA7介导的囊泡运输，被转运至液泡存储或降解，从而在提高拟南芥对CIA的耐受性中发挥重要作用。大丽轮枝菌分泌多种低分子量毒素，结合大丽轮枝菌毒素对植物甚至人畜的危害，本发明创造性地提出该发明的核心策略，“利用植物来源的P4-ATPases来转运降解大丽轮枝菌毒素CIA，同时提高转基因植株对大丽轮枝菌的抗性”。
2、AtALA7基因的获得
2.1拟南芥RNA的提取及cDNA的合成
取适量野生型拟南芥(Col-0)叶片，利用液氮研磨法，按Aidlab公司的EASYspinRNA快速提取试剂盒使用说明书提取拟南芥的总RNA，获得的RNA经1％琼脂糖电泳检测质量。再利用TaKaRA公司的RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA，操作严格按说明书进行。
2.2 AtALA7基因的克隆
以实施例2.1获得的拟南芥cDNA为模板，以AtALA7基因上游引物：5’-GACTAGTATGGGGCGTCGTAGAATAAGATC(SpeI)-3’(SEQ ID NO.4)，下游引物5’-ACCAGAACCACC ACCAGAACCACCACTATGTTGTGTGGTGGAAGTTG-3’(SEQ ID NO.5)TA为引物，利用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)酶进行PCR扩增，回收扩增产物，获得AtALA7基因片段。
PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM上下游引物各2μL，模板(50μg/μL)4μL，KOD-Plus-Neo 1μL(1U/μL)，加水至50μL；
扩增程序为94℃2min；98℃10s，68℃4min，循环35次。
3、植物表达载体pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos的构建及农杆菌转化
3.1 pLGN-35S-Nos植物表达载体的获得
pLGN-35S-Nos为本实验室由pCambia2300改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(RB和LB之间区域)替换成组成型启动子CaMV35S-P控制的报告基因GUS和标记基因NPTII的融合基因表达盒，并在这个表达盒两端各添加了一个LoxpFRT重组酶识别位点，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。
3.2 pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos植物表达载体的构建
AtALA7-Linker-EGFP(SpeI/KpnI)融合片段的获得：
将上述实施实例2.2获得的片段与EGFP片段(上游引物：ggtggttctggtggtggttctggtATGGTGAGCAAGGGCGAG(SEQ ID NO.6)；下游引物：GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(SEQ ID NO.7))进行融合PCR，获得AtALA7-Linker-EGFP(SpeI/KpnI)融合片段。
将该片段与实施例3.1中的载体质粒(pLGN-35S-Nos)，分别用SpeI/KpnI进行双酶切并回收酶切片段，然后利用T4-DNA连接酶连接回收的AtALA7基因片段和pLGN-35S-Nos载体片段。连接产物热激转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并进行酶切验证(图7B)，表明已成功将AtALA7基因片段连接入pLGN-35S-Nos载体。测序结果与公布的AtALA7基因序列一致，具体序列见SEQ ID NO.12。测序正确的植物表达载体pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos单克隆于-80℃保存备用，载体具有图7A所示的结构。
3.3植物表达载体pLGN-35S-AtALA7-Nos重组农杆菌的获得
利用电转化法，将步骤3.2获得的pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos植物表达载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，利用卡那霉素与利福平作为筛选标记基因进行抗性筛选，获得阳性克隆，再提取农杆菌质粒并用SmaI/SalI进行双酶切，经1％的琼脂糖凝胶进行电泳，获得了3477bp的目的片段(酶切结果与图5酶切结果相同)，表明获得了含有pLGN-35S-AtALA7-Nos植物表达载体的重组农杆菌。
4、拟南芥的遗传转化
4.1植株种植
拟南芥种植于1/2MS培养基中，待其长出2片真叶时移至培养土中，在光照培养箱生长，培养条件为：温度22℃/20℃，16h光照/8h黑暗，70％相对湿度，光强150μmol/m2/s。待其长至初生花序约5～15cm、次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序，有益于次生花序的生长发育，便于渗透转化。渗透转化应在去除初生花序3～5d内完成，并且在渗透转化的前1d植物需充分浇水，以便植物气孔在转化时充分张开。
侵染野生型Col-0获得AtALA7超量表达的转基因拟南芥；侵染ala7纯合突变体获得互补AtALA7拟南芥(ala1/AtALA7)。
4.2菌液的培养
取-80℃保存的含pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos载体的农杆菌菌株，在含有50mg/LRif与50mg/L Km的YEB固体培养基(5g/L蔗糖，1g/L酵母提取物，10g/L胰化蛋白胨，0.5g/LMgSO4·7H2O，15g/L琼脂粉，pH 7.0)划线培养获得单菌落，挑取单菌落，接种入附加50mg/LKm和125mg/L Sm(硫酸链霉素)的YEB培养基中(5g/L蔗糖，1g/L细菌用酵母抽提物，10g/L胰化蛋白胨，0.5g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0)，28℃、200rmp振荡培养过夜，至菌液OD600值达到0.8时，于转化前一天晚上，按1:100进行大量过夜培养(Rif:25mg/L；Kana:50mg/L)。待其由暗红色变为橘黄色时，加入乙酰丁香酮(50mg/L)，继续培养2h至OD600约2.0。室温5000rpm离心15min,弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于等体积的渗透培养基(蔗糖50g/L；MS盐2.37g/L；Silwet L-77 500μL/L)，使OD600在0.8左右，用于拟南芥侵染。
4.3浸花法转化拟南芥
用携带目的基因的农杆菌悬浮液侵染拟南芥的地上部分，侵染1min后用黑膜罩覆盖，暗培养12h左右，揭开黑膜并正常培养，侵染1周左右方可浇水，根据其生长情况可再侵染1-2次，继续培养至植物成熟，收获T1代种子用于筛选阳性转化子。
4.4转基因拟南芥的分子鉴定
4.4.1 AtALA7转基因拟南芥的GUS组织化学染色鉴定
参照Jefferson等(1987)的方法，用镊子取转基因植株幼嫩叶片于GUS染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.1mol/L K4Fe(CN)6，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/L Na2EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.0)中，37℃反应3h。染色后，75％乙醇脱色，每4h更换一次脱色液，直至未着色部分的颜色完全褪去。叶片都没有蓝色出现的再生材料为非转基因植株，染出蓝色的为转基因植株。
4.4.2 AtALA7转基因拟南芥的PCR鉴定
所有再生的GUS组织化学染色呈阳性反应的转基因植株，取其幼苗叶片约0.1g，按照说明书的操作程序，利用Aidlab公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，获得DNA后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后以提取的DNA为模板，扩增载体特异性片段，以检测再生植株是否整合了AtALA7基因。
PCR扩增引物为：
上游引物：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’；(SEQ ID NO.8)
下游引物：5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO.9)。
25μL扩增体系包括：10×LAPCR Buffer，2.5μL；25mmol/L MgCl2，2.5μL；2.5mmol/L dNTP Mixture，2μL；模板DNA，1μL(约10ng)；5μmol/L上游引物，1μL；5μmol/L下游引物，1μL；LA Taq酶，0.2μL；ddH2O，14.8μL。
PCR温度循环参数：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，60s，扩增30个循环；72℃，10min。最后扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
5、转基因植株中AtALA7的转录水平检测
5.1 RNA的提取及cDNA的合成
利用植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab产品)，提取植物RNA，所有操作严格按说明书进行，获得的RNA利用1％琼脂糖电泳检测质量。再利用
5.2 AtALA7基因转录水平检测
利用Real-time PCR方法检测植株内转基因的表达水平。为均一化cDNA浓度，以拟南芥Atactin2基因为内标。
10μL反应体系包括：cDNA1μL，上下游引物各0.5μL，2×iQ SYBR Green Supermix5μL，用无RNA酶的双蒸水补足10μL。
扩增程序为：95℃预扩增3min；94℃10s，56℃30s，72℃30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析基因的相对表达量。
6、AtALA7转基因拟南芥的大丽轮枝菌毒素的耐受性
6.1 AtALA7转基因拟南芥对CIA的耐受性
为明确AtALA7在提高拟南芥对CIA耐受性的作用，选择AtALA7转基因拟南芥中表达量高的转化子(图8，OE-9；-12)、野生型(Col-0)以及纯合突变体ala7-5于1/2MS固体培养基，待根长至2cm左右，转移至含100μg/mL CIA的1/2MS固体培养基中处理9d，ala7-5叶片白化严重，根的生长受到明显抑制；而OE-9与OE-12叶片均为绿色，根继续生长且侧根发达；WT的表型介于二者之间(图9B)。不添加CIA则三者间植株长势无显著差异(图9A,C)。根长统计结果显示，添加CIA时OE-9分别为WT和ala7-5的0.71与1.17倍；OE-12分别为WT和ala7-5的0.73与1.18倍(图9D)。表明超量AtALA7提高了拟南芥对CIA的耐受性。
6.2 CIA进入溶解型液泡
用FITC-CIA(5μg/mL)与FM4-64(4μM)处理WT，ala7-5及OE-9拟南芥6h，FITC-CIA均进入WT与OE-9拟南芥液泡中，且OE-9荧光更强；而ala7-5中则多分布于细胞膜与细胞质中(图10A)。液泡中荧光强度统计结果显示，OE-9荧光强度分别是WT和ala7-5的0.6倍与8倍(图10B)。以上结果表明，超表达AtALA7促进了CIA向液泡的转运，提高拟南芥对其耐受性。
为明确AtALA7转运CIA进入液泡的途径，用FM4-64(6μM)及FITC-CIA(15μg/mL)同时处理WT，180min观察到FM4-64包裹的FITC-CIA位于质膜附近；随着时间的推移，多数FITC-CIA形成的球形结构位于FM4-64标记的液泡膜附近并最终进入γ-Tip-RFP标记的溶解型液泡中(图11)，暗示CIA可能被降解。
6.3 AtALA7转基因拟南芥对大丽轮枝菌亲脂粗毒素LC-toxins的耐受性用130μg/mL大丽轮枝菌V991的亲脂粗毒素(Lipophilic Crude toxins，LC-toxins)处理WT,ala7-5及AtALA7超量拟南芥(OE-9)幼苗9d，ala7-5下部叶片均白化死亡，WT仅少量叶片白化，OE-9叶片均为绿色(图12A)；叶绿素含量检测结果显示，OE-9分别比WT和ala7-5高8.11％与53.5％；不添加毒素，三者间叶绿素含量无显著差异(图12B)，表明超量AtALA7提高了拟南芥对大丽轮枝菌LC-toxins的耐受性。
7、AtALA7转基因拟南芥对大丽轮枝菌的抗性
为进一步明确超表达AtALA7对大丽轮枝菌的抗性，挑选生长2周左右、大小接近的WT,ala7-5及AtALA7超量拟南芥(OE-9,OE-11,OE-12)幼苗，接种大丽轮枝菌V991(孢子浓度2×108个/mL)21d，出现不同程度叶片发黄、萎蔫等典型的黄萎病菌症状，但ala7-5发病最严重，WT次之，超表达AtALA7拟南芥发病最轻(图13A)。病情指数统计结果显示，OE-9,OE-11及OE-12均显著低于WT与ala7-5，其中OE-9病情指数分别比WT和ala7-5低22.5％与43.3％(图13B)，表明超量AtALA7提高了拟南芥对大丽轮枝菌的抗性。
8、AtALA7转基因烟草对大丽轮枝菌及其毒素的耐受性
8.1烟草遗传转化各阶段培养基
种子萌发培养基：MSB+蔗糖30g/L+普通琼脂6g/L，pH＝6.8。
共培养基：MSB+蔗糖10g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+普通琼脂6g/L，pH＝5.4。
筛选培养基：MSB+蔗糖30g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+Km 1000mg/L+Cef1000mg/L+普通琼脂6g/L，pH＝5.8。
继代培养基：MSB+蔗糖30g/L+Km 75mg/L+Cef 1000mg/L+普通琼脂6g/L，pH＝5.8。
生根培养基：MSB+蔗糖30g/L+Cef 1000mg/L+普通琼脂6g/L，pH＝6.8。
8.2 AtALA7转基因烟草的获得
1)准备转化所用烟草材料。先用75％乙醇漂洗野生型烟草种子1min，弃乙醇；然后在0.1％的升汞中漂洗6-8min，弃去升汞溶液；最后用无菌水漂洗6次以上，然后将烟草种子于装有适量无菌水的三角瓶中摇床培养，待烟草种子萌发出小芽后于萌发培养基上萌发，约1个月后得到无菌烟草苗。
2)农杆菌的培养。从pLGN-35S-AtALA7-EGFP-Nos农杆菌平板上挑取农杆菌于YSK液体培养基(含125mg/mL Sm和50mg/mL Km的YEB液体培养基)摇床培养，28℃，200rpm培养至OD600为0.8-1.2。
3)农杆菌侵染转化。10000rpm，1min收集2)中农杆菌菌体10mL(1mL/管)，然后用液体共培养基重悬；取1)中烟草幼苗健壮的嫩叶去掉叶脉后将剩余部分在无菌条件下切成0.5cm×0.5cm大小的叶片，将其置于农杆菌共培养基中侵染40min后平铺在共培养固体培养基上。
4)转基因烟草植株的获得。将侵染后的外植体于共培养基上暗培养2d后转入筛选培养基，待其长出愈伤组织后转入继代培养基，将长出的烟草小苗切下***生根培养基中继续生长。待烟草苗长大后进行阳性验证(GUS组织染色法和PCR验证)。
8.3 AtALA7转基因烟草的分子验证
8.3.1转基因烟草的GUS染色与PCR扩增验证
参照Jefferson等(1987)的方法，用镊子取转基因植株幼嫩叶片于GUS染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.1mol/L K4Fe(CN)6，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/L Na2EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.0)中，37℃反应3h。染色后，75％乙醇脱色，每4h更换一次脱色液，直至未着色部分的颜色完全褪去。叶片都没有蓝色出现的再生材料为非转基因植株，染出蓝色的为转基因植株。
对GUS阳性的转基因烟草植株，利用植物Aidlab公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，提取AtALA7转基因玉米DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。以提取的玉米DNA为模板，以检测转基因玉米中是否整合了AtALA7基因。
PCR扩增引物为：
上游引物：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’；(SEQ ID NO.10)
下游引物：5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO.11)。
10μL扩增体系包括：2×TaqMaster mix 5μL；模板DNA，1μL；5μmol/L上游引物0.5μL；5μmol/L下游引物0.5μL；ddH2O 3μL。
PCR温度循环参数：94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，30个循环；72℃，10min。最后扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
8.3.2 AtALA7转基因烟草的转录水平检测
利用Real-time PCR方法检测植株内转基因的表达水平。为均一化cDNA浓度，以烟草NtActin基因为内标。
10μL反应体系包括：cDNA1μL，上下游引物各0.5μL，2×iQ SYBR Green Supermix5μL，用无RNA酶的双蒸水补足10μL。
扩增程序为：95℃预扩增3min；94℃10s，56℃30s，72℃30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析基因的相对表达量。结果显示，AtALA7基因得到不同程度的表达，选择表达水平较高有21号和22号转化子用于后续实验(图14)。
8.4 AtALA7转基因烟草对CIA的耐受性
为明确表达AtALA7能否提高烟草对CIA的耐受性，挑选MS培养基上生长10d且长势相近的野生型和转基因烟草幼苗，转移至添加450μg/mL CIA的MS中培养3d，野生型叶片均枯萎死亡，而转基因烟草仅下部叶片枯萎(图15A)。统计结果显示，表达AtALA7基因的21号和22号转化子其白化叶片率分别比野生型降低66.5％和66.1％(图15B)，表明表达AtALA7提高烟草对CIA的耐受性。
8.5 AtALA7转基因烟草对大丽轮枝菌的抗性
大丽轮枝菌是黄萎病的主要致病菌。为明确转基因烟草对大丽轮枝菌强毒力菌株V991的抗性，选择生长3周的野生型及转基因烟草，伤根后采用灌根法接种V991菌液(5×108Conidia/mL，50mL/株)，3周后统计发病情况。结果显示，野生型叶片黄化、枯萎严重，而表达AtALA7基因的烟草叶片枯萎较少(图16A)；病情指数统计结果显示，与野生型相比，表达AtALA7的21和22号转化子分别降低了29.2％和32.2％(图16B)，表明异源表达AtALA7提高烟草对大丽轮枝菌的抗性。
9、瞬时表达AtALA7提高棉花子叶对大丽轮枝菌的耐受性
为确定棉花子叶中瞬时表达AtALA7后的表达量变化，分别在野生型棉花子叶注射农杆菌后的1d、2d、3d及4d，各选择15片子叶提取RNA，反转录为cDNA，通过qRT-PCR检测AtALA7表达量(与实例8.2.2相同)。结果显示注射后2d表达量最高(图17)，因此在注射农杆菌2d后采用喷洒法接种大丽轮枝菌。注射农杆菌2d后，用1mL注射器针头刺穿棉花子叶，采用喷洒法在其表面接种大丽轮枝菌L2-1(9×107Conidia/mL)，10d后统计发病情况。结果显示，表达AtALA7的棉花子叶其病斑面积明显小于对照(图18A)，病情指数比对照分别降低57.2％和56％(图18B)。表明瞬时表达提高棉花子叶对大丽轮枝菌的耐受性。
参考文献
陈旭升(1998)棉花黄萎病菌致萎毒素的生理生化特性研究(Doctoraldissertation,南京:南京农业大学).
简桂良,邹亚飞,&马存(2003)棉花黄萎病连年流行的原因及对策.中国棉花,30(3),13-14.
田李,陈捷胤,陈相永,汪佳妮,&戴小枫(2011)大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae VdLs.17)分泌组预测及分析.中国农业科学,44(15),3142-3153.
徐理,朱龙付,&张献龙.(2012).棉花抗黄萎病机制研究进展.作物学报,38(9),1553-1560.
章元寿,王建新,&方中达.(1990)大丽轮枝菌毒素致萎活性成分的研究.真菌学报,9(1),69-72.
中国农业科学院棉花研究所.(1983)中国棉花栽培学,上海科学技术出版社,637-647.
Andersen,J.P.,Vestergaard,A.L.,Mikkelsen,S.A.,Mogensen,L.S.,Chalat,M.,&Molday,R.S.(2016)P4-ATPases as Phospholipid Flippases—Structure,Function,and Enigmas.Frontiers in Physiology,7，1-23.
Alder-Baerens,N.,Lisman,Q.,Luong,L.,Pomorski,T.,&Holthuis,J.C.(2006)Loss of P4 ATPases Drs2p and Dnf3p disrupts aminophospholipid transport andasymmetry in yeast post-Golgi secretory vesicles.Molecular biology of thecell,17(4),1632-1642.
Bell AA,Hillocks R J.(1992)Verticillium wilt.Cotton diseases,87-126.
Bhat,R.G.,&Subbarao,K.V.(1999)Host range specificity in Verticilliumdahliae.Phytopathology,89(12),1218-1225.
Buchner,V.,Nachmias,A.,&Burstein,Y.(1982)Isolation and partialcharacterization of a phytotoxic glycopeptide from a protein—lipopolysaccharide complex produced by a potato isolate of Verticilliumdahliae.Febs Letters,138(2),261-264.
Carder,J.H.,Hignett,R.C.,&Swinburne,T.R.(1987)Relationship betweenthe virulence of hop isolates of Verticillium albo-atrum and their in vitrosecretion of cell-wall degrading enzymes.Physiological and Molecular PlantPathology,31(3),441-452.
Chen,C.Y.,Ingram,M.F.,Rosal,P.H.,&Graham,T.R.(1999)Role for Drs2p,aP-type ATPase and potential aminophospholipid translocase,in yeast late Golgifunction.The Journal of cell biology,147(6),1223-1236.
Chen,S.,Wang,J.,Muthusamy,B.P.,Liu,K.,Zare,S.,Andersen,R.J.,&Graham,T.R.(2006)Roles for the Drs2p–Cdc50p complex in protein transport andphosphatidylserine asymmetry of the yeast plasma membrane.Traffic,7(11),1503-1517.
Coleman,J.A.,Vestergaard,A.L.,Molday,R.S.,Vilsen,B.,&Andersen,J.P.(2012).Critical role of a transmembrane lysine in aminophospholipid transportby mammalian photoreceptor P4-ATPase ATP8A2.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,109(5),1449-1454.
Davis,D.A.,Low,P.S.,&Heinstein,P.(1998)Purification of a glycoproteinelicitor of phytoalexin formation fromVerticillium dahliae.Physiological andMolecular Plant Pathology,52(4),259-273.
Gall,W.E.,Geething,N.C.,Hua,Z.,Ingram,M.F.,Liu,K.,Chen,S.I.,&Graham,T.R.(2002)Drs2p-dependent formation of exocytic clathrin-coated vesicles invivo.Current biology,12(18),1623-1627.
Gilbert,M.J.,Thornton,C.R.,Wakley,G.E.,&Talbot,N.J.(2006)A P-typeATPase required for rice blast disease and induction of hostresistance.Nature,440(7083),535-539.
López-Marqués,R.L.,Holthuis,J.,&Pomorski,T.G.(2011)Pumping lipidswith P4-ATPases.Biological chemistry,392(1-2),67-76.
Mercado-Blanco,J.,Rodríguez-Jurado,D.,Pérez-Artés,E.,&Jiménez-Díaz,R.M.(2002)Detection of the defoliating pathotype of Verticillium dahliae ininfected olive plants by nested PCR.European Journal of Plant Pathology,108(1),1-13.
Natarajan,P.,Wang,J.,Hua,Z.,&Graham,T.R.(2004)Drs2p-coupledaminophospholipid translocase activity in yeast Golgi membranes andrelationship to in vivo function.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,101(29),10614-10619.
Palmgren,M.G.,&Nissen,P.(2011)P-type ATPases.Annual review ofbiophysics,40,243-266.
Panatala,R.,Hennrich,H.,&Holthuis,J.C.(2015)Inner workings andbiological impact of phospholipid flippases.J Cell Sci,128(11),2021-2032.
Pegg,G.F.,&Brady,B.L.(2002)Verticillium wilts.New York:CABIPublishing.2002,P432.
Poulsen,L.R.,López-Marqués,R.L.,McDowell,S.C.,Okkeri,J.,Licht,D.,Schulz,A.,...&Palmgren,M.G.(2008)The Arabidopsis P4-ATPase ALA3 localizes tothe Golgi and requires aβ-subunit to function in lipid translocation andsecretory vesicle formation.The Plant Cell,20(3),658-676.
Robert,S.,Zouhar,J.,Carter,C.,&Raikhel,N.(2007)Isolation of intactvacuoles from Arabidopsis rosette leaf–derived protoplasts.Nature Protocols,2(2),259-262.
Ruaud,A.F.,Nilsson,L.,Richard,F.,Larsen,M.K.,Bessereau,J.L.,&Tuck,S.(2009)The C.elegans P4-ATPase TAT-1 Regulates Lysosome Biogenesis andEndocytosis.Traffic,10(1),88-100.
Schmidt,G.W.,&Delaney,S.K.(2010)Stable internal reference genes fornormalization of real-time RT-PCR in tobacco(Nicotiana tabacum)duringdevelopment and abiotic stress.Molecular Genetics and Genomics,283(3),233-241.
Tran,V.T.,Braus-Stromeyer,S.A.,Kusch,H.,Reusche,M.,Kaever,A.,Kühn,A.&Hoff,K.(2014)Verticillium transcription activator of adhesion Vta2 suppressesmicrosclerotia formation and is required for systemic infection of plantroots.New Phytologist,202(2),565-581.
Wang,J.Y.,Cai,Y.,Gou,J.Y.,Mao,Y.B.,Xu,Y.H.,Jiang,W.H.,&Chen,X.Y.(2004)VdNEP,an elicitor from Verticillium dahliae,induces cotton plantwilting.Applied and environmental microbiology,70(8),4989-4995.
Watkins,G.M.(1981)Compendium of cotton diseases.AmericanPhytopathological Society,1981:42-44.
Wicky,S.,Schwarz,H.,&Singer-Krüger,B.(2004)Molecular interactions ofyeast Neo1p,an essential member of the Drs2 family of aminophospholipidtranslocases,and its role in membrane trafficking within the endomembranesystem.Molecular and cellular biology,24(17),7402-7418.
YAO,L.L.,Zhou,Q.,PEI,B.L.,&LI,Y.Z.(2011)Hydrogen peroxide modulatesthe dynamic microtubule cytoskeleton during the defence responses toVerticillium dahliae toxins in Arabidopsis.Plant,cell&environment,34(9),1586-1598.
SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
<120> 利用AtALA7基因提高植物对大丽轮枝菌抗性的方法
<130> CQ302-20P150107
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggggcgtcgt agaataagat c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttaaccgct caggcttatc c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attttgccga tttcggaac 19
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gactagtatg gggcgtcgta gaataagatc 30
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
accagaacca ccaccagaac caccactatg ttgtgtggtg gaagttg 47
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtggttctg gtggtggttc tggtatggtg agcaagggcg ag 42
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggggtacctt acttgtacag ctcgtccatg c 31
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggtgagca agggcgag 18
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttacttgtac agctcgtcca tgc 23
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggtgagca agggcgag 18
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttacttgtac agctcgtcca tgc 23
<210> 12
<211> 3732
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliala (L.) Heynh
<400> 12
atggggcgtc gtagaataag atcaaggatc cggaaaagcc atttctacac ctttaaatgt 60
ctcagaccaa aaaccctaga agatcaagga cctcatatca ttaatggacc tggatacacg 120
agaattgttc attgtaacca acctcatttg catttggcta aagtccttag gtacacttca 180
aattatgtgt ccaccactag gtataatctc attactttct tgcccaaatg cttgtatgag 240
cagttccacc gtgttgccaa tttctacttc ctcgttgctg ctattctctc tgtctttcct 300
ctctccccat tcaacaaatg gagtatgatc gctcctttga tttttgtggt tgggcttagt 360
atgggtaaag aggcgttgga ggattggcgg aggtttatgc aggatgtgaa ggtgaattcg 420
aggaaagcta ctgttcacag aggggatggt gattttggtc gtaggaagtg gaagaagtta 480
cgtgtagggg atgttgtaaa ggtggaaaag gatcaatttt tccctgctga tttgctctta 540
ttgtcatcta gttatgagga tgggatctgt tatgtggaga cgatgaactt agatggtgaa 600
accaacttga aagtgaaaag atgtttggat gttactttgc ctttggaacg ggatgatact 660
ttccagagtt tctccggaac tatcaaatgt gaagatccca atcctaacct ctataccttt 720
gttggaaatc ttgaatatga cggtcaggtt tatccgcttg atcctagcca gattctcttg 780
agagactcaa agctcaggaa cacgtcttat gtctatgggg tggtggtttt tactggccat 840
gacaccaaag tcatgcagaa ttcaacaaaa tccccttcaa agagaagcag aatcgagaag 900
agaatggact acattatata tactctcttt gccctccttg tgcttgtctc cttcatcagc 960
tcattgggtt ttgcagtgat gacaaaaatg catatgggag attggtggta cttacgaccg 1020
gataagcctg agcggttaac aaatccaaga aatccttttc acgcttgggt cgtccatctg 1080
atcactgctg tcttgcttta tgggtacttg attcccatct cattgtatgt ttccatcgag 1140
ctcgtaaaag ttttgcaggc aactttcata aaccaagact tgcagatgta tgacagcgag 1200
agtgggactc cagctcaagc acgtacatcg aatttaaatg aagagctggg acaagttgac 1260
acaatccttt ccgataaaac tggaactttg acttgtaacc agatggattt tctgaaatgc 1320
tccattgcgg gtacttctta tggtgttcga gccagtgaag tggaactagc tgctgcaaaa 1380
caaatggcga tagatctcga cgaggagcaa ggtgaggaag tgacccacct tccaaggact 1440
agaggaagga tgcatggata tgctaaaatg cccagcaaga catcatcaga tattgagttg 1500
gagactgtaa tcactgctac tgacgaaggg gatcagaccc agtccactgg tatcaagggt 1560
tttagttttg aggatcaacg tctcatgggt ggaaactggt taaatgaacc taattcagat 1620
gacattttga tgtttctgcg tatacttgcg gtttgtcaca ctgctatccc cgaggtggat 1680
gaagatactg gaaagtgtac ttatgaagca gagtctcctg acgaagttgc tttccttgtt 1740
gccgctgggg agtttggttt tgagtttact aaaagaactc aatcaagtgt gtttatcagt 1800
gaacgacatt caggccaacc agttgaaaga gaatataaag ttttaaatgt tttggacttc 1860
actagcaaaa gaaaaagaat gtctgttatc gtccgtgatg aaaaaggaca gattcttcta 1920
ctctgtaaag gtgctgacag cataatattt gaacggttat ccaagaatgg aaaaaattat 1980
ctggaagcca cttcaaagca tttgaatgga tacggtgaag ctggtttacg cacattggca 2040
ctcagttata gaaagctgga tgagaccgag tattcgatat ggaacagtga atttcacaaa 2100
gccaaaactt cagtcggagc tgacagagat gaaatgctcg aaaaggtatc tgacatgatg 2160
gagaaggaat tgattcttgt cggtgctact gcagtggaag acaaactgca gaaaggggtg 2220
cctcaatgca tagataaact tgcccaagct ggtcttaaga tatgggtttt gacaggagat 2280
aagatggaga cagcaattaa cataggatat gcctgcagtt tgctgagaca gggtatgaag 2340
cagatataca tagctctaag aaatgaagag ggatcatccc aagacccaga agcagctgcg 2400
agagagaaca ttttgatgca aatcataaat gcttcacaga tgatcaaact agagaaggat 2460
ccacatgcag cgtttgcttt gatcattgat ggaaagacac ttacatatgc tttggaggat 2520
gatattaagt atcagtttct tgccctggca gttgactgtg cttcagtgat atgctgtcgt 2580
gtctctccca agcagaaagc gcttgtaaca agactagcaa aagaaggaac aggaaagacg 2640
accttggcaa ttggtgatgg tgcaaatgat gttggaatga ttcaagaagc cgatataggt 2700
gtaggcatca gtggcgtgga aggcatgcag gctgtaatgg caagcgactt ctccatagcc 2760
caatttcggt ttctagagag actacttgtt gtccatgggc actggtgcta caaaagaata 2820
gcccagatga tctgttactt cttctacaag aacataacat ttggtctgac tctcttctac 2880
ttcgaggctt tcaccgggtt ttctggtcaa gccatataca acgactccta cttgttgctg 2940
tttaacgtta ttctcacatc tctccctgtc atcgcccttg gagtttttga gcaagacgtg 3000
tcttcagaag tctgcttaca gttcccagca ctgtaccagc aaggccccaa gaacctgttc 3060
tttgactggt acagaatcat cgggtggatg gcaaatggag tctatgcatc cgtagtcata 3120
ttttccctca acattggcat ctttcatgtc caatctttct gttctggtgg ccaaacagca 3180
gacatggacg caatgggaac tgcaatgttc acgtgcatca tctgggcagt gaacgtacag 3240
atagctttaa ccatgagcca tttcacatgg atccaacacg tcttgatctg gggaagtatc 3300
gtcacctggt acatcttcct tgccctattt ggcatgttac ctccaaaagt ctcaggaaac 3360
atcttccaca tgctctcgga aaccctagca cctgcaccaa tcttctggct tacctcactg 3420
ctggtcatag ccgccacaac actcccctac ttggcttaca tttcgttcca gagatcgtta 3480
aaccctctgg accatcacat catccaagag atcaagcatt tcagaatcga cgtccaggac 3540
gaatgtatgt ggacgaggga aagatcaaag gctagagaga agaccaagat tggagtgaca 3600
gctcgtgttg atgccaagat ccgccagctg agaggaaggc tccagagaaa acactccata 3660
ttgagcgtta tgagcggtct gagtggcgtc tcagcatcaa ctgatacaac ttccaccaca 3720
caacatagtt ga 3732
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：植物导引模板原位合成基因编辑方法及应用