(二)

背景技术

21世纪是生命科学的世纪。人们对生命的认识从结构开始，遵循着由宏观向微观，由整体向局部，从个体到器官、组织、细胞、细胞器、乃至组成生命的基本物质——分子这样一个过程逐步展开。细胞作为生命结构和功能的基本单位，对其进行深入研究是揭示生命现象奥秘、征服疾病和改造生命的关键。随着研究的深入，我们所面临的挑战是以展开生命活动的大环境活细胞作为“试管”，在尽量避免影响细胞自身性质及其所处微环境的前提下，以非接触、无损伤的方式获取活体单细胞的亚细胞精细结构图像信息，细胞生命过程中不同种类生物分子的空间分布及其变化信息，以及细胞器和生物分子、不同种类生物分子之间相互作用过程的功能信息，为在更深层次上揭示生命活动的本质和基本规律提供可靠的科学依据。

随着对生命活动本质逐渐深入的探索，人们希望通过对细胞内部结构进行更加细致的观察，从而逐步获得对细胞结构和功能更清晰的认识。从列文虎克借助第一台显微镜首次发现了细胞结构，到如今的多种类型的新型显微方法和系统被发明出来，借助这些现代化的仪器和先进的技术，人们逐渐打开了微观世界的大门。显微镜的出现，使研究者们对微观世界，尤其是对细胞有了一个全新的认识，让人们对生物的认识从表象进入了实质。

目前的医学研究对显微镜的分辨率、精度的要求都很高，越是复杂的研究就越需要高性能的实验仪器，近几年，生物成像领域始终使研究的热门，日新月异的新技术使得实验方法也多种多样。

随着荧光标记技术、激光技术、微弱信号探测技术和计算机技术的发展，现代显微成像技术能够以前所未有的时间和空间分辨率记录生物系统的时空信息，改变我们看待、记录、解释和理解生物事件的方式。特别是基于自体荧光或通过荧光标记提供高的化学特异性和成像对比度的宽场荧光显微技术成为研究活体单细胞，获取其内部精细三维结构和定量功能信息的重要研究工具。

近年来，使用薄片状激光束实现的光片荧光显微技术已被证明是实现这种具有挑战性目标的首选技术之一。光片荧光显微镜包括激发光路和探测光路两个主要的组成部分。激发光路中使用通常称为“光片”的薄片状激光束作为激发光，激发片状照明区域内的荧光团。探测光路使用宽场荧光信号并行探测方式，在与片状激发光平面垂直的方向收集产生的荧光信号。通过片状激发光的快速扫描，获取待测生物样品具有高空间分辨率的三维结构层析图像。光片荧光显微镜的这种高效的激发和探测方式不仅有效避免了片状照明区域以外的荧光团和内源有机分子的光漂白和光损伤等问题，减少了整个样品所受到的光毒性的影响，保证了在长时间研究过程中待测活体生物样品的活力，而且有效避免了离焦荧光信号的干扰，大大提高了系统的信噪比。

光镊技术利用聚焦光场形成的光阱产生力学效应，可以在不影响细胞内部及所处微环境的条件下，以非机械接触、无损伤的方式稳定捕捉、精准操控和快速筛选单个病毒、细胞甚至生物大分子。此外，光镊不仅可以操控微粒，还可以进行微小力的测量。作为定量分析工具，光镊技术可以对感兴趣的系统施加经校准的皮牛量级的光阱力，实现对光阱力作用引起的目标系统位移量的高精度、高灵敏度的测量。目前，在分子生物学、生物化学和生物物理学等研究领域中，分析光镊技术已经发展成为一种在分子水平上操控和分析细胞的强大工具，广泛应用于生物力学、生物聚合物、生物大分子和分子马达等众多研究领域中。同时，光镊技术的提出和发展为以非机械接触、无损伤的方式长时间观察处于液态环境中的活细胞，获取其内部结构，及其物理和化学性质，进而深入研究细胞生命活动过程的生物调控机制等打开了大门。将光片荧光显微技术与光镊技术有机地结合在一起，使研究人员从对活细胞进行被动的观察转而成为主动的操控，为解决上述问题提供了一种有效的途径。

光片荧光显微镜经过多年的发展，成像速度和分辨率已经满足大多数的实验要求，不容忽视的还有对样品的操控和固定的方式。对样品的固定也对成像有很大的影响，在光片荧光显微成像系统中，为了获取细胞完整的三维结构图像，需要对细胞进行旋转或移动，才能采集到细胞不同层面的完整的信息。现在的技术最多使用的是加入微位移台来控制待测细胞的轴向移动；或者是通过移动光片，通过对样本细胞扫来实现对细胞的层析成像。

本发明公开了一种基于细胞旋转角度主动光操控技术的光片荧光显微成像方法和系统，可广泛应用于获取细胞或微生物的高空间分辨率的三维结构图像。该设计采用高斯光束经过扩束和整形产生片状光，片状光经物镜聚焦在待测细胞中激发荧光分子产生荧光信号，通过检测物镜收集荧光信号并由 CMOS相机记录以获取细胞的层析图像。通过光操控系统控制细胞旋转，得到不同角度上细胞的层析图像，经过图像重构获得细胞的三维结构图像。本设计的光操控系统通过控制声光偏转器实现对细胞旋转角度精准主动光操控的目的，具有结构简单、灵活性高、易于操作、成本低廉等特点，在生物学、医学和生命科学等众多研究领域中具有广泛的应用前景。