稳定化的rsv f蛋白及其用途
阅读说明:本技术 稳定化的rsv f蛋白及其用途 (Stabilized RSV F proteins and uses thereof ) 是由 张兰 A·弗里德曼 E·杜尔 A·贝特 于 2019-01-24 设计创作,主要内容包括:本公开涉及稳定的RSV F蛋白和包含其的免疫原性组合物,以及使用所述免疫原性组合物和包含所述RSV F蛋白的组合物的方法。(The present disclosure relates to stabilized RSV F proteins and immunogenic compositions comprising the same, as well as methods of using the immunogenic compositions and compositions comprising the RSV F proteins.)
技术领域
本公开涉及稳定的RSV F蛋白和包含其的免疫原性组合物,以及使用所述免疫原性组合物和包含所述RSV F蛋白的组合物的方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年01月29日提交的美国临时申请号62/623,184 的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
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背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是肺病毒家族成员。在幼儿和老年人(>65 岁)中,RSV感染是下呼吸道感染的主要原因。目前,尚无可用的已获批疫苗,并且治疗选择有限。
RSV的包膜包含三种表面糖蛋白:F、G和SH。G和F蛋白是保护性抗原和中和抗体的靶标。但是,F蛋白在RSV毒株和类型(A和 B)中更保守。RSV F是一种I型病毒融合蛋白,其结构从亚稳态的融合前形式重排为高度稳定的融合后形式。尽管在F蛋白融合后构象上存在中和单克隆抗体的靶标,但中和Ab应答主要针对自然感染 RSV的人的F蛋白融合前构象(Magro M等,Proc Natl Acad Sci U S A; 109(8):3089-94,201;Ngwuta JO等,SciTransl Med 2015;7(309):309ra162)。因此,在其融合前构象中稳定的工程化RSV F蛋白已成为开发RSV F疫苗抗原的有吸引力的策略。例如,此前已发现包含“DS-Cav1”置换(155C、290C、190F和207L)的重组RSV F 三聚体在动物模型中激发的中和免疫应答大于针对基于融合后F的 RSV免疫原所观察到的应答(McLellan等,Science,342:592-598, 2013)。本文描述了新型RSV抗原,其在感兴趣的融合前形式中甚至更稳定。
发明内容
本公开提供了一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)F三聚体,其包含:三个重组RSV F肽,各自包含野生型RSV F位置98-146的缺失和在野生型RSV F位置97和147之间的8至14个氨基酸的接头,其中重组F肽包含下述修饰,以稳定融合前构象的所述重组RSV F三聚体:(i)190F和207L氨基酸置换,(ii)155C和290C氨基酸置换,和下述(a)-(f)中的一种或多种:(a)486C和490C氨基酸置换; (b)180C和186C氨基酸置换;(c)486C和489C氨基酸置换;(d)512C和513C氨基酸置换;(e)505C氨基酸置换;和(f)RSV F 野生型氨基酸482-513的缺失。在一个实施方式中,RSV F肽各自在 C端还包含RSV F野生型跨膜结构域和胞质结构域的缺失(例如,在 C端包含RSV F野生型氨基酸525-574的缺失)。在一个进一步的实施方式中,RSV F肽各自包含RSV F野生型氨基酸514-574的缺失。
在重组RSV F三聚体的一个实施方式中,重组RSV F肽各自在每个肽的C端还包含foldon序列。在一个进一步的实施方式中,foldon 结构域的序列在肽的C末端开始并替代RSV F野生型跨膜结构域和胞质结构域(例如,foldon结构域替代RSV F野生型氨基酸525-574)。在一个进一步的实施方式中,foldon结构域的序列在野生型RSV F的氨基酸位置513之后开始(即,foldon序列替代野生型RSV-F的氨基酸514-574)。在另一个实施方式中,当RSV F肽包含野生型RSV F 氨基酸482-513的其他缺失时,foldon结构域的序列在野生型RSV F 的氨基酸位置481之后开始(参见例如,SEQ ID NO:44)。在一些实施方式中,foldon序列包含SEQ ID NO:8。
在RSV F三聚体的一个实施方式中,所述重组F肽各自包含野生型RSV F的190F和207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、 486C和490C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,重组F肽各自还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在另一个实施方式中,所述RSV F三聚体包含在由486C和490C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的一个或多个非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述重组RSV F肽的C端各自包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在RSV F三聚体的一个实施方式中,所述重组F肽各自包含野生型RSV F的190F和207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、 180C和186C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述重组RSV F肽各自还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键,和/或在由190C和186C 氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述重组RSV F肽的C端各自包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在RSV F三聚体的一个实施方式中,所述重组F肽各自包含野生型RSV F的190F和207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、 486C和489C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述重组RSV F肽各自还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在另一个实施方式中,所述RSV F三聚体包含在由486C和489C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述重组RSV F肽的C端各自包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在RSV F三聚体的一个实施方式中,所述重组F肽各自包含野生型RSV F的190F和207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、 512C和513C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述重组RSV F肽各自还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在另一个实施方式中,所述RSV F三聚体包含在由512C和513C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述重组RSV F肽的C端各自包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在重组RSV F三聚体的一个实施方式中,所述重组F肽各自包含野生型RSV F的190F和207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、505C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在另一个实施方式中,所述重组RSV F肽各自还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述重组RSV F肽的C端各自包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQID NO:8。
在重组RSV F三聚体的一个实施方式中,所述重组F肽各自包含野生型RSV F的190F和207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、和氨基酸482-513的缺失,以及野生型RSVF的氨基酸514-574 的缺失。在一个实施方式中,所述重组RSV F肽各自还包含在由155C 和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述重组RSV F肽的C端各自包含foldon 结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含 SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述接头的长度是八(8)个、十(10)个、十二(12个)或十四(14)个氨基酸。在一个实施方式中,所述接头包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中,所述接头具有SEQ ID NO:1、2、3或4中任何一个所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中,所述RSV F三聚体的重组F肽各自包含SEQ ID NO:22所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:22所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:22所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F三聚体的重组F肽各自包含SEQID NO:24所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:24所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:24所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F三聚体的重组F肽各自包含SEQ ID NO:26所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:26所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:26所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F三聚体的重组F肽各自包含SEQ ID NO:28所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ IDNO:28所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:28所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F三聚体的重组F肽各自包含SEQ ID NO:30所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:30所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:30所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F三聚体的重组F肽各自包含SEQ ID NO:44所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:44所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:44所示的成熟氨基酸序列组成。
本公开还提供了一种RSV免疫原性组合物,所述组合物包含重组呼吸道合胞病毒(RSV)F三聚体,其包含:三个重组RSV F肽,其各自包含:在位置98-146的RSV F野生型氨基酸的缺失和在RSV F 野生型氨基酸位置97和147之间的8至14个氨基酸的接头,其中所述重组F肽包含下述修饰,以稳定融合前构象的所述重组RSV F三聚体:(i)190F和207L氨基酸置换,(ii)155C和290C氨基酸置换,和下述中的一种(或多种):(a)486C和490C氨基酸置换;(b) 180C和186C氨基酸置换;(c)486C和489C氨基酸置换;(d)512C 和513C氨基酸置换;(e)505C氨基酸置换;和(f)RSV F野生型氨基酸482-513的缺失。在一个实施方式中,RSV F肽还各自在C端包含RSV F野生型跨膜结构域和胞质结构域的缺失(例如,在C端包含RSV F野生型氨基酸525-574的缺失)。在一个进一步的实施方式中,RSV F肽各自包含RSV F野生型氨基酸514-574的缺失。
在免疫原性组合物的一个实施方式中,所述重组F肽各自还包含在每个肽C端的foldon序列。在一个进一步的实施方式中,所述foldon 结构域的序列从野生型RSV F的氨基酸位置513之后开始(即,所述 foldon序列替代野生型RSV-F的氨基酸514-574)。在另一个实施方式中,当所述RSV F肽含有野生型RSV F氨基酸482-513的其他缺失时,所述foldon结构域的序列从野生型RSV F的氨基酸位置481 之后开始(参见例如,SEQ ID NO:44)。在一些实施方式中,所述 foldon序列包含SEQ ID NO:8。
在免疫原性组合物的一个实施方式中,所述RSV F三聚体是任何本文所述的RSV三聚体。在免疫原性组合物的另一个实施方式中,所述RSV F三聚体的重组F肽各自包含SEQID NO:22、24、26、28、 30和44中任一者所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:22、24、26、28、30和44中任一者所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:22、24、26、28、30和44中任一者所示的成熟氨基酸序列组成。
本公开还提供了一种RSV肽,其包含在位置98-146的RSV F野生型氨基酸的缺失和RSV F野生型位置97和147之间的8至14个氨基酸的接头,以及其他修饰以稳定融合前构象的含有三个此类重组 RSV肽的重组RSV F三聚体。在单链RSV肽中的此类其他修饰包含:(i)190F和207L氨基酸置换,(ii)155C和290C氨基酸置换,和下述中的一种(或多种):(a)486C和490C氨基酸置换;(b)180C 和186C氨基酸置换;(c)486C和489C氨基酸置换;(d)512C和 513C氨基酸置换;(e)505C氨基酸置换;和(f)RSV F野生型氨基酸482-513的缺失。在一个实施方式中,RSV F肽在C端还包含 RSV F野生型跨膜结构域和胞质结构域的缺失(例如,在C端包含 RSV F野生型氨基酸525-574的缺失)。在一个进一步的实施方式中, RSV F肽包含RSV F野生型氨基酸514-574的缺失。
在一个实施方式中,所述RSV F肽在C端还包含foldon序列。在一个进一步的实施方式中,所述foldon结构域的序列从野生型RSV F的氨基酸位置513之后开始(即,所述foldon序列替代野生型RSV-F 的氨基酸514-574)。在另一个实施方式中,当所述RSV F肽包含野生型RSV F氨基酸482-513的其他缺失时,所述foldon结构域的序列从野生型RSV F的氨基酸位置482之后开始(参见例如,SEQ ID NO: 44)。在一些实施方式中,所述foldon序列包含SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述RSV F肽包含野生型RSV F的190F和 207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、486C和490C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述RSV F肽还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述重组RSV F肽的C 端包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述RSV F肽包含野生型RSV F的190F和 207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、180C和186C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述RSV F肽还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键和/或在由190C和186C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述RSV F 肽的C端包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon 结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述RSV F肽包含野生型RSV F的190F和 207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、486C和489C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述RSV F肽还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述RSV F肽的C端包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述RSV F肽包含在野生型RSV F的190F 和207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、512C和513C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述RSV F 肽还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述RSV F肽的C 端包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述RSV F肽包含野生型RSV F的190F和 207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、505C氨基酸置换、和氨基酸514-574的缺失。在另一个实施方式中,所述RSV F肽还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述RSV F肽的C端包含foldon 结构域的序列。在另一个实施方式中,所述foldon结构域的序列包含 SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述RSV F肽包含野生型RSV F的190F和 207L氨基酸置换、155C和290C氨基酸置换、和氨基酸482-513的缺失,以及野生型RSV F的氨基酸514-574的缺失。在一个实施方式中,所述RSV F肽还包含在由155C和290C氨基酸置换引入的半胱氨酸之间的非天然内部肽二硫键。在一个进一步的实施方式中,所述RSV F肽的C端包含foldon结构域的序列。在另一个实施方式中,所述 foldon结构域的序列包含SEQ ID NO:8。
在一个实施方式中,所述接头的长度是八(8)个、十(10)个、十二(12个)或十四(14)个氨基酸。在一个实施方式中,所述接头包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中,所述接头具有SEQ ID NO:1、2、3或4中任何一个所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中,所述RSV F肽包含SEQ ID NO:22所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:22所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:22所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F肽包含SEQ ID NO:24所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:24所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:24所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F肽包含 SEQ ID NO:26所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:26所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:26所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F肽包含SEQ ID NO:28所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:28所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:28所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F肽包含SEQ ID NO:30所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:30所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:30所示的成熟氨基酸序列组成。在一个实施方式中,所述RSV F 肽包含SEQ ID NO:44所示的成熟氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 44所示的成熟氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:44所示的成熟氨基酸序列组成。
在一个实施方式中,如本文所述,当重组生产RSV肽时,其形成RSV F三聚体。
本公开还提供了编码如本文所述的单链RSV肽的分离的核酸分子。在一个实施方式中,所述分离的核酸分子是DNA分子。本公开还提供了包含所述核酸分子的载体。
本公开还提供了一种制备如本文所述的重组呼吸道合胞病毒 (RSV)F三聚体的方法,所述方法包括(i)表达各自如上文所述的核酸分子或载体,和(ii)纯化由此生产的重组RSV F三聚体。
本公开还提供了抗体分子,包括全长抗体和抗体衍生物,其针对本文所述的RSV F三聚体或针对本文所述的RSV F肽。
在一些实施方式中,所述免疫原性组合物用佐剂配制。在一个实施方式中,所述佐剂是铝佐剂。在一些实施方式中,所述铝佐剂是 MAA或MAPA。
在一些实施方式中,所述重组RSV F三聚体或RSV F肽(在本文中分别进行描述)用脂质纳米颗粒(LNP)配制,所述LNP包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、甾醇、和非阳离子脂质。
本公开的一些实施方式提供了在受试者中产生RSV F特异性免疫应答的方法,所述方法包括以有效产生RSV F特异性免疫应答的量向所述受试者施用本文所述的任何免疫原性组合物或如本文所述的重组RSV F三聚体。在一些实施方式中,抗原特异性免疫应答包括T 细胞应答或B细胞应答。
在一些实施方式中,如本文所述,所述方法包括向受试者施用单剂量(无强化剂量)的免疫原性组合物或RSV F三聚体。在另一个实施方式中,如本文所述,所述方法还包括向所述受试者施用第二(强化)剂量的免疫原性组合物或RSV F三聚体。在另一个实施方式中,所述方法还包括施用至少一个强化剂量的所述RSV F三聚体或RSV 免疫原性组合物。可以施用另外的剂量。
在一些实施方式中,通过皮内注射、肌内注射或通过鼻内施用向受试者施用所述RSV免疫原性组合物或RSV F三聚体。在一些实施方式中,通过肌内注射向受试者施用RSV疫苗。
在一些实施方式中,所述RSV F三聚体或免疫原性组合物针对 RSV免疫所述受试者长达1或2年。在一些实施方式中,所述RSV F 三聚体或免疫原性组合物针对RSV免疫所述受试者2年以上、3年以上、4年以上或5-10年。在一个实施方式中,所述免疫原性组合物每年作为疫苗施用。
在一些实施方式中,所述受试者为约5岁或更小。例如,所述受试者的年龄可以是约1岁至约5岁之间(例如,约1、2、3、4或5 岁),或者年龄约6个月至约1岁之间(例如,约6、7、8、9、10、 11或12个月)。在一些实施方式中,所述受试者为约12个月或更小 (例如,12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2个月或1个月)。在一些实施方式中,所述受试者为约6个月或更小。
在一些实施方式中,所述受试者足月出生(例如,约37-42周)。在一些实施方式中,所述受试者是早产的,例如在妊娠约36周或更早(例如,约36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25 周)。例如,所述受试者可能在妊娠约32周或更早时出生。在一些实施方式中,所述受试者在妊娠约32周至约36周之间早产。在此类受试者中,可以在出生后施用疫苗,例如在约6个月至约5岁或更晚。
在一些实施方式中,所述受试者是年龄约20岁至约50岁之间的年轻成年人(例如,约20、25、30、35、40、45或50岁)。
在一些实施方式中,所述受试者是约50-60岁、60岁、约70岁或更大、80岁或更大、90岁或更大的老年受试者(例如,约60、65、 70、75、80、85或90岁)。在一些实施方式中,所述受试者是免疫功能受损的(例如,患有免疫病症或自身免疫性病症)。
在一些实施方式中,当施用所述RSV免疫原性组合物时,所述受试者是妊娠的。在一些实施方式中,所述受试者患有慢性肺部疾病,如慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘。
在一些实施方式中,已暴露于RSV的所述受试者是被RSV感染或具有RSV感染,或处于RSV感染的风险中。
在下面的描述中阐述了本公开的各种实施方式的细节。根据说明书和权利要求,本公开的其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
如附图所示,根据本发明特定实施方式的下述描述,前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见,在附图中,贯穿不同视图,相同附图标记指代相同的部分。附图不一定按比例绘制,而是将重点放在说明本发明各种实施方式的原理上。
图1A和1B显示了新鲜收集的LZF40(具有8a.a.接头的 DS-Cav1)转染后第7天的细胞培养物上清液(supe)(图1A)或在 4℃下储存8天的那些(图1B)与D25和(帕利珠单抗) 单克隆抗体的结合。
图2A-2F显示了新鲜收集的LZF55(F55)、LZF56(F56)和 LZF57(F57)(分别具有10、12或14a.a.接头的DS-Cav1;分别见图2A、2B和2C)转染后第3天的细胞培养物上清液(supe)或在4℃下储存7天的那些(分别见图2D、2E和2F)与D25和(帕利珠单抗)的结合。
图3显示了与DS-Cav1相比,单链RSV突变体LZF55、LZF56 和LZF57用抗-RSV F血清进行的western印迹结果。
图4A-4C显示了如通过ELISA确定的新鲜收集的DS-Cav1(图 4A)、LZF57(图4B)或LZF111(图4C)细胞培养物上清液与D25 和4D7单克隆抗体的结合。图4D显示了通过在还原(R)或非还原 (NR)条件下进行的SDS-PAGE分析的纯化DS-Cav1、F57和F111。
图5A和5B分别显示了LZF111和DS-Cav1的CD光谱。
图6显示了使用神经网络重建DS-Cav1和LZF111的CD光谱 (185nm至260nm)的二级结构分析,该神经网络在具有解析3D结构的蛋白CD光谱上进行训练。
图7显示了通过差示扫描荧光法(DSF)分析的纯化LZF111和 DS-Cav1的热稳定性。
图8A-8E显示了如在ELISA结合测定中通过与D25、4D7和
(帕利珠单抗)的结合所评价的,冷冻或在4℃下保存1个月(图8A-8C)、2个月(图8D)或3个月(图8E)的纯化DS-Cav1 蛋白或LZF111的长期稳定性。图9A和9B显示了PD2小鼠血清针对融合前F蛋白的ED10 ELISA效价(图9A)和PD2小鼠血清针对RSV Long毒株的血清中和效价(图9B)。水平虚线表示检测限。数据表明,在不同剂量下,与DS-Cav1相比,LZF111诱导相似的中和抗体水平。
图10显示了LZF111(上图)、DS-Cav1(中图)和LZF57(下图)的示意图。
图11显示了由mRNA疫苗和对照制剂在棉鼠中诱导的针对RSV A的血清中和抗体效价(NT50个体和GMT,具有95%置信区间)。
图12显示了在第56天(PD2后4周)测量的针对D25(位点
)、帕利珠单抗(位点II)和4D7(位点I)的血清抗体竞争ELISA效价 (IT50个体和GMT,具有95%置信区间)。图13显示了用RSV A攻击棉鼠后肺和鼻中的RSV含量。
图14显示了由mRNA疫苗和对照制剂在非洲绿猴中诱导的针对 RSV A的血清中和抗体效价(NT50个体和GMT,具有95%置信区间)。
图15显示了在第10周(PD3后2周)测量的针对D25(位点
)、帕利珠单抗(位点II)和4D7(位点I)的血清抗体竞争ELISA效价 (IT50个体和GMT,具有95%置信区间)。图16A-16C显示了AGM攻击后支气管肺泡(BAL)液中的RSV 含量。图16A是高剂量免疫。图16B是低剂量免疫。图16C显示了曲线下面积。
图17A-17C显示了AGM攻击后在鼻拭子中的RSV含量。图17A 是高剂量免疫。图17B是低剂量免疫。图17C显示了曲线下面积。
图18显示了由mRNA疫苗和对照制剂在经过感染的非洲绿猴中诱导的针对RSV A的血清中和抗体效价(NT50个体和GMT,具有95%置信区间)。
图19显示了在第10周(PD3后2周)测量的针对D25(位点)、帕利珠单抗(位点II)和4D7(位点I)的血清抗体竞争ELISA效价 (IT50个体和GMT,具有95%置信区间)。
具体实施方式
RSV F蛋白是在临床分离株之间(包括在RSV-A和RSV-B抗原性亚组之间)都非常保守的一种I型融合糖蛋白。F蛋白在融合前和更稳定的融合后状态之间转换,从而有助于进入靶细胞。RSV F糖蛋白最初以F0前体蛋白形式合成。RSV F0折叠成三聚体,所述三聚体通过弗林蛋白酶切割成包含F1和F2亚基的成熟融合前蛋白而被激活 (Bolt等,Virus Res.,68:25,2000)。在融合前构象中稳定的RSV F 蛋白在动物模型中比在融合后构象中稳定的RSVF蛋白产生的中和免疫应答更强(McLellan等,Science,342:592-598,2013)。这样,稳定的融合前RSV F蛋白是包含在RSV疫苗中的良好候选物。此前已经产生了在融合前构象中稳定的可溶性RSV胞外域,其包含“DS-Cav1”置换。参见,WO 2014/160463A1和WO 2017/172890A1,其内容各自通过引用并入本文。
此前已发现,融合前稳定的RSV F构建体DS-Cav1在4℃下长期保存后发生构象变化并形成中间结构(Flynn JA等,PLoS ONE 2016; 11(10):e0164789)。对于RSV F亚单位疫苗抗原,在4℃或更高温度下的长期稳定性是期望的性质。本文描述了另外的基于结构的修饰,以进一步改善RSV F三聚体在融合前构象中的稳定性。与 DS-Cav1相比,此类构建体在4℃下具有更高的稳定性,同时保留了免疫原性。
各自如在本文中所使用的,“RSV融合蛋白”和“RSV F蛋白”是指促进病毒和细胞膜融合的RSV包膜糖蛋白。实际上,RSV F蛋白被合成为称为F0的单个多肽前体,其包含引导定位至内质网的信号肽,该信号肽在内质网被切割。其余F0残基低聚化以形成三聚体,并通过蛋白酶在两个保守的弗林蛋白酶切割序列进行蛋白水解处理,以生成两个二硫键连接的片段F1和F2。实际上,三个F2-F1肽寡聚成三聚体以形成成熟的F蛋白,其采用融合前构象,该构象是亚稳态的,并且可以经历构象变化,变成融合后构象。
“RSV F跨膜结构域”对应于野生型RSV F的跨膜结构域(即,SEQ ID NO:10的氨基酸525-550)。
“RSV F胞质结构域”或“RSV F胞质尾”对应于野生型RSV F 的胞质尾结构域(即,SEQ ID NO:10的氨基酸551-574)。
如在本文中所使用的,“D25”或“D25抗体”描述了与融合前 RSV F肽特异性结合的中和抗体。在美国专利申请公开号US 2010/0239593中描述了这种抗体,其全部内容通过引用并入本文。
“单链RSV突变体”是指已被修饰以使其不包含弗林蛋白酶切割位点的RSV F蛋白,这样当在细胞中产生单链RSV突变体时,F0肽不会被切割成单独的F1和F2链。单链RSV突变体的非限制性实例包括通过柔性接头连接F2多肽的位置97与F1肽的位置97至位置 147,以产生单链RSV突变体。
各自如在本文中所使用的,“DS-Cav1”;“DS-Cav1置换”指对RSV F蛋白的遗传修饰,其包含“DS”置换155C和290C,以便在由置换(如S155C和S290C置换)引入的半胱氨酸之间引入非天然的二硫键,和“Cav1”置换,其包括190F和207L腔填充氨基酸置换(如S190F和V207L)。在WO 2014/160463中描述了DS-Cav1,其全部内容通过引用并入本文。
各自如在本文中所使用的,“foldon结构域”或“foldon”是指 T4纤维蛋白三聚结构域,其包含天然形成三聚体结构的氨基酸序列。在一些实例中,RSV F蛋白的序列被修饰以含有foldon结构域。在其他实例中,单链RSV突变体含有foldon结构域。Foldon三聚化结构域的实例包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
如在本文中所使用的,“信号肽”或“信号序列”是短氨基酸序列,其将新合成的分泌或膜蛋白引导至膜并通过膜,从而普遍地控制真核生物和原核生物中的大多数蛋白质进入分泌途径。内质网加工产生成熟的蛋白,其中将信号肽从前体蛋白上切割下来。如本文中所提及的,“成熟氨基酸序列”不包含信号肽。单链RSV突变体的成熟氨基酸序列不包含信号肽。此外,由三个成熟单链RSV突变体组成的RSV三聚体不包含信号肽序列。
如在本文中所使用的,当涉及多肽时,术语“置换”、“氨基酸置换”或“置换变体”指在天然或初始序列中具有至少一个氨基酸残基被除去且在相同位置在其中***不同氨基酸的那些。置换可以是单个,其中分子中仅一个氨基酸已被置换,或其可以是多个,其中在同一分子中的两个或多个(例如,3、4或5个)氨基酸已被置换。例如,如在本文中所使用的,提及在RSV F蛋白或单链RSV F突变体中的“155C”置换,指在位置155处具有半胱氨酸残基的单链RSV F蛋白,其中半胱氨酸残基已置换在RSV F蛋白位置155处的相应天然残基。作为参照,SEQ ID NO:10是关于置换位置的参照序列。例如,“S155C”置换是使用C置换SEQ IDNO:10的位置155处的S。
“分离的”多肽或多核苷酸至少部分地不含来自产生其的细胞或细胞培养物中的其他生物分子。此类生物分子包括其他核酸、蛋白、脂质、碳水化合物或其他物质,如细胞碎片和生长培养基。其可以进一步至少部分地不含表达系统组分,如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子。通常,术语“分离的”并非旨在指完全不存在此类生物分子或不存在水、缓冲剂或盐或者包含多肽或多核苷酸的药物制剂的组分。
“多肽变体”是相对于天然序列或参照序列其氨基酸序列不同的分子。与天然序列或参照序列相比,氨基酸序列变体可在氨基酸序列内的某些位置具有置换、缺失、***或前述任何两种或三种的组合。通常,变体与天然序列或参照序列相比具有至少50%同一性。在一些实施方式中,变体与天然序列或参照序列相比具有至少80%同一性或至少90%同一性。
“类似物”是指包括其区别在于一个或多个氨基酸改变(例如,氨基酸残基的置换、添加或缺失)的多肽变体,其仍保持亲本或初始多肽的一种或多种性质。
本公开提供了基于多核苷酸或多肽的几种类型的组合物,包括变体和衍生物。这些包括例如置换、***、缺失以及共价变体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变体”同义,并且通常是指相对于参照分子或初始分子以任何方式被修饰和/或改变的分子。
这样,编码包含相对于参照序列(特别是本文公开的多肽序列) 的置换、***和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如,可以将序列标签或氨基酸(如一个或多个赖氨酸)添加到肽序列中(例如,在N末端或C末端)。序列标签可以用于肽的检测、纯化或定位。赖氨酸可以用于增加肽的溶解度或使其能够进行生物素化。或者,可以任选地缺失肽或蛋白氨基酸序列位于羧基和氨基末端区域的氨基酸残基以提供截短的序列。或者,根据序列的用途,可以缺失某些氨基酸(例如,C末端残基或N末端残基),例如将该序列作为可溶的或连接至固体支持物的较大序列的一部分表达。
如在本文中所使用的,术语“保守性氨基酸置换”是指序列中通常存在的氨基酸被具有相似尺寸、电荷或极性的不同氨基酸置换。保守性置换的实例包括用非极性(疏水性)残基(如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸)置换另一个非极性残基。同样地,保守性置换的实例包括用一个极性(亲水性)残基置换另一个,如在精氨酸与赖氨酸之间,在谷氨酰胺与天冬酰胺之间以及在甘氨酸与丝氨酸之间。另外,保守性置换的另外实例是用碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)置换另一种碱性残基,或用一种酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)置换另一种酸性残基。非保守性置换的实例包括用非极性(疏水性)氨基酸残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸)置换极性 (亲水性)残基(如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)和/或用极性残基置换非极性残基。
如在本文中所使用的,当提及多肽时,术语“结构域”是指具有一个或多个可识别的结构或功能特征或性质(例如,结合能力、充当蛋白-蛋白相互作用位点)的多肽的基序。
如在本文中所使用的,当提及多肽时,与基于氨基酸的实施方式有关的术语“位点”与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。如在本文中所使用的,当提及多核苷酸时,与基于核苷酸的实施方式有关的术语“位点”与“核苷酸”同义使用。位点表示可以在基于多肽或基于多核苷酸的分子内被修饰、操纵、改变、衍生或变化的肽或多肽或多核苷酸内的位置。
如在本文中所使用的,当提及多肽或多核苷酸时,术语“末端 (termini)”或“末端(terminus)”分别指多肽或多核苷酸的末端。此类末端不仅限于多肽或多核苷酸的第一个或最后一个位点,还可以在末端区域包含其他氨基酸或核苷酸。基于多肽的分子可以被表征为具有N末端(由具有游离氨基(NH2)的氨基酸终止)和C末端(由具有游离羧基(COOH)的氨基酸终止)。在一些情况下,蛋白由通过二硫键或非共价力(多聚体、寡聚糖)聚集在一起的多条多肽链组成。这些蛋白具有多个N末端和C末端。或者,可以对多肽的末端进行修饰,使得其视情况而定地以基于非多肽的部分(如有机缀合物) 起始或终止。
如本领域技术人员所认识到的,认为蛋白片段、功能性蛋白结构域和同源蛋白也在目标多肽的范围内。例如,本文提供的是长度为10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100个或100个以上氨基酸的参照蛋白的任何蛋白片段(指比参照多肽序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面相同的多肽序列)。在另一个实例中,根据本公开可以利用包含与任何本文所述的序列具有40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的一连串20、30、 40、50或100个(连续的)氨基酸的任何蛋白。在一些实施方式中,如本文提供的或本文引用的任何序列所示,多肽包含2、3、4、5、6、 7、8、9、10个或更多个突变。在另一个实例中,根据本公开可以利用包含与任何本文所述的序列具有大于80%、90%、95%或100%同一性的一连串20、30、40、50或100个氨基酸,其中所述蛋白具有与任何本文所述的序列具有小于80%、75%、70%、65%至60%同一性的一连串5、10、15、20、25或30个氨基酸。
本公开的多肽或多核苷酸分子可以与参照分子(例如,参照多肽或参照多核苷酸),例如与本领域描述的分子(例如,工程化或设计的分子或野生型分子),具有一定程度的序列相似性或同一性。如本领域所公知的,术语“同一性”指如通过比较序列所确定的两个或更多个多肽或多核苷酸序列之间的关系。在本领域中,同一性还指由两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串之间的匹配数确定的两个序列之间的序列相关性程度。同一性是指通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)处理的具有空位比对(如果有)的两个或多个序列中较小的序列之间相同匹配的百分比。相关肽的同一性可以通过已知方法容易地计算。应用于多肽或多核苷酸序列的“同一性%”被定义为比对序列并引入空位(如有必要)以达到最大同一性百分比后,与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的候选氨基酸或核酸序列中的残基(氨基酸残基或核酸残基)百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。同一性取决于同一性百分比的计算,但由于计算中了空位和罚分,其值可能会有所不同。在通常情况下,如通过本文所述的和本领域技术人员公知的序列比对程序和参数所确定的,特定多核苷酸或多肽的变体与特定参照多核苷酸或多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%但低于 100%的序列同一性。此类比对工具包括BLAST套装的那些(Stephen F.Altschul等,(1997)."Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs,"Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。另一种流行的局部比对技术是基于Smith-Waterman 算法的(Smith,T.F.&Waterman,M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)。基于动态规划的通用全局比对技术是Needleman–Wunsch算法(Needleman, S.B.&Wunsch,C.D.(1970)“A general method applicable to the search for similarities in theamino acid sequences of two proteins.”J.Mol.Biol. 48:443-453)。最近,开发了一种快速最佳全局序列比对算法 (FOGSAA),据称其比其他最佳全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)产生核苷酸和蛋白序列的全局比对更快。本文描述了其他工具,特别是在下文“同一性”的定义中。
如在本文中所使用的,术语“同源性”指聚合分子之间(例如,核酸分子(例如,DNA分子)之间和/或多肽分子之间)的总体相关性。共享通过匹配残基的比对确定的相似性或同一性的阈值水平的聚合分子(例如,核酸分子(例如,DNA分子)和/或多肽分子)被称为同源的。同源性是描述分子之间关系的定性术语,并且可以基于定量的相似性或同一性。相似性或同一性是定量术语,其定义了两个比较序列之间的序列匹配程度。在一些实施方式中,如果其序列是至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的或相似的,则认为聚合分子彼此之间是“同源的”。术语“同源的”必定是指至少两条序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。如果其编码的多肽是至少一串的至少20个氨基酸的至少50%、60%、70%、80%、90%、 95%或甚至99%,则认为两条多核苷酸序列是同源的。在一些实施方式中,同源多核苷酸序列的特征在于能够编码一串至少4-5个独特指定的氨基酸。对于长度少于60个核苷酸的多核苷酸序列,通过编码一串至少4-5个独特指定的氨基酸的能力来确定同源性。如果蛋白与至少一串至少20个氨基酸的蛋白至少50%、60%、70%、80%或90%相同的,则认为两条蛋白序列是同源的。
同源性意味着所比较的序列在进化上从共同起源发散。术语“同源物”指第一氨基酸序列或核酸序列(例如,基因(DNA或RNA) 或蛋白序列),其通过来自共同祖先序列的后代而与第二氨基酸序列或核酸序列相关。术语“同源物”可适用于通过物种进化事件而分离的基因和/或蛋白之间的关系或通过遗传复制事件而分离的基因和/或蛋白之间的关系。“直系同源物”是通过物种进化从共同祖先基因(或蛋白)进化而来的不同物种中的基因(或蛋白)。通常,直系同源物在进化过程中保留相同的功能。“旁系同源物”是通过基因组内复制而相关的基因(或蛋白)。直系同源物在进化过程中保留相同的功能,而旁系同源物则进化出新功能,即使这些功能与原始功能有关。
术语“同一性”指聚合分子之间(例如,多核苷酸分子(例如, DNA分子)之间和/或多肽分子之间)的总体相关性。例如,可以通过比对用于最佳比较目的的两条序列进行两条多核苷酸序列同一性百分比的计算(例如,可以在用于最佳比对的第一和第二核酸序列中的一者或两者中引入空位,并且出于比较目的可以忽略不相同的序列)。在某些实施方式中,用于比较目的的比对序列的长度是参照序列长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时,则在该位置的分子是相同的。考虑到空位的数目和每个空位的长度,需要引入其以实现两条序列的最佳比对,两条序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数目的函数。序列的比较和两条序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。例如,可以使用诸如在下述中描述的那些方法确定两条核酸序列之间的同一性百分比:Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M., and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,M Stockton Press, New York,1991;其各自通过引用并入本文。例如,可以使用Meyers 和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)的算法确定两条核酸序列之间的同一性百分比,该算法已引入ALIGN程序(2.0版)中,其使用PAM120 权重残基表,空位长度罚分12和空位罚分4。或者,可以使用 NWSgapdna.CMP矩阵的GCG软件包中的GAP程序确定两条核酸序列之间的同一性百分比。通常用于确定序列之间同一性百分比的方法包括但不限于在Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J Applied Math., 48:1073(1988)中公开的那些;其通过引用并入本文。用于确定同一性的技术已编入公众可获得的计算机程序中。确定两条序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG软件包,Devereux,J.等, NucleicAcids Research,12,387(1984)),BLASTP、BLASTN和FASTA Altschul,S.F.等,J.Molec.Biol.,215,403(1990)。
脂质纳米颗粒
如在本文中所使用的,“脂质纳米颗粒”或“LNP”指能够用于递送产品的任何脂质组合物,包括但不限于脂质体或囊泡,其中水体积被两亲性脂质双层(例如,单一;单层或多重;多层),或者,在其他实施方式中,其中脂质覆盖包含预防性产品或脂质聚集体或胶束的内部,其中脂质包封的治疗性产品包含在相对无序的脂质混合物中。除非另有说明,否则脂质纳米颗粒不需要在其中掺入抗原性多肽,并且当处于同一制剂中时可以用于递送产品。
如在本文中所使用的,“多胺”是指具有两个以上氨基的化合物。实例包括腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。
除非另有说明,否则摩尔%指总脂质的摩尔百分比。在通常情况下,本发明组合物的LNP由一种或多种阳离子脂质(包括可电离的阳离子脂质)和一种或多种聚(乙二醇)-脂质(PEG-脂质)组成。在某些实施方式中,LNP还包含一种或多种非阳离子脂质。一种或多种非阳离子脂质可包括磷脂、磷脂衍生物、甾醇、脂肪酸或其组合。
本文描述了适于LNP的阳离子脂质和可电离的阳离子脂质。可电离的阳离子脂质的特征是其脂质头部基团为弱碱性,这会以pH依赖的方式影响脂质的表面电荷,使其在酸性pH下带正电,而在生理 pH下接近中性。阳离子脂质的特征是其头基上的单价或多价阳离子电荷使其在中性pH下带正电。在某些实施方式中,阳离子脂质和可电离的脂质能够与亲水性生物活性分子复合,产生疏水性复合物,该复合物分配到两相水/有机系统的有机相中。预期单价和多价阳离子脂质均可用于与生物活性分子形成疏水复合物。
在一些实施方式中,用于形成LNP的阳离子和可电离的阳离子脂质包括但不限于:N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”); N-(2,3二油基氧基)丙基)-N,N,N三甲基氯化铵(“DOTMA”);N,N- 二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”);N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(“DODAP”);1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP);3-(N-(N,N-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”);双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(“DHGS”) 和N-(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵 (“DMRIE”)。另外,可获得可用于本发明的很多阳离子脂质以及其他组分的市售制剂。这些包括例如(可商购的阳离子脂质纳米颗粒,包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺 (“DOPE”),来自GIBCOBRL,Grand Island,N.Y.,USA);和
(可商购的阳离子脂质纳米颗粒,包含N-(1-(2,3 二油基氧基)丙基)N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(“DOSPA”)和(“DOPE”),来自(GIBCOBRL))。下述脂质是阳离子型且在低于生理pH值的情况下具有正电荷:DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷 (DLinDMA)、4-(2,2-二辛基-9,12-二烯基-[1,3]二氧戊环-4-基甲基)- 二甲胺、DLinKDMA(WO 2009/132131A1)、DLin-K-C2-DMA (WO2010/042877)、DLin-M-C3-DMA(WO2010/146740和/或 WO2010/105209)、DLin-MC3-DMA(三十七碳-6,9,28,31-四烯-19- 基4-(二甲基氨基)丁酸酯;Jayaraman等,2012,Angew.Chem.Int.Ed. Engl.51:8529–8533)、2-{4-[(3β)-胆甾-5-en-3-基氧基]丁氧基}-N,N- 二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯丙基氧基]丙-1-胺) (CLinDMA)等。适于在本发明中使用的其他阳离子脂质包括例如在美国专利号5,208,036、5,264,618、5,279,833和5,283,185,以及美国专利申请公开号2008/0085870和2008/0057080中描述的阳离子脂质。适于在本发明中使用的其他阳离子脂质包括例如在国际专利申请公开号WO2011/076807的表6(第112-139页)中公开的脂质 E0001-E0118或E0119-E0180(其还公开了制备方法,以及使用这些阳离子脂质的方法)。在一些实施方式中,阳离子脂质包含下述中的任何一项: DLinDMA;DlinKC2DMA;DLin-MC3-DMA;CLinDMA;S-辛基 CLinDMA;
(2S)-1-{7-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]庚氧基}-3-[(4Z)-癸-4-烯-1- 基氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺;
(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-3-[(4Z)-癸-4-烯-1- 基氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺;
1-[(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-3-(辛氧基)丙-2- 基]胍;
1-[(2R)-1-{7-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]庚氧基}-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺;
1-[(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺;
(2S)-1-({6-[(3β))-胆甾-5-烯-3-基氧基]己基}氧基)-N,N-二甲基 -3-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]丙-2-胺;
(3β)-3-[6-{[(2S)-3-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-2-(吡咯烷-1-基) 丙基]氧基}己基)氧基]胆甾-5-烯;
(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-3-(辛氧基)丙-2- 胺;
(2R)-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基 -3-(苯氧基)丙-2-胺;
(2R)-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-3-(庚氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺;
(2R)-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基 -3-[(2Z)-戊-2-烯-1-基氧基]丙-2-胺;
(2S)-1-丁氧基-3-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N- 二甲基丙-2-胺;
(2S-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-3-[2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9-十六碳氟壬基)氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺;
2-氨基-2-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙烷-l,3- 二醇;
2-氨基-3-((9-(((3S,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2- 基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3- 基)氧基)壬基)氧基)-2-((((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氧基)甲基) 丙-1-醇;
2-氨基-3-((6-(((3S,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2- 基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3- 基)氧基)己基)氧基)-2-((((Z)-十八碳9-烯-1-基)氧基)甲基)丙-1-醇;
(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-l0-胺;
(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-l7,20-二烯-9-胺;
(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺;
(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺;
(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺;
(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺;
(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺;
(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺;
(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺;
(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺;
(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺;
(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺;
(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺;
(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺;
(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-l0-胺;
(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺;
(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺;
(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺;
(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-l9,22-二烯-7-胺;
N,N-二甲基二十七碳-10-胺;
(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-l0-胺;
1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷;
(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺;
(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺;
(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺;
(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺;
(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺;
(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺;
(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-10-胺;
(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺;
(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺;(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺;
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺;
1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺;
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺;
N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一烷-10-胺;
N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基] 十九烷-10-胺;
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺;
N,N-二甲基-1-[(1R,2S)-2-十一烷基环丙基]十四烷-5-胺;
N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1-胺;
1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-N,N-二甲基十八烷-9-胺;
1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺;
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺;和
(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,23-三烯-l0-胺;
或者其药学上可接受的盐,或前述任一项的立体异构体。
在本发明该实施方式的某些方面中,LNP包含下述可电离的阳离子脂质中的一种或多种:DLinDMA、DlinKC2DMA、DLin-MC3-DMA、 CLinDMA或S-辛基CLinDMA(参见国际专利申请公开号 WO2010/021865)。在本发明该实施方式的其他方面中,LNP包含下述可电离的和阳离子脂质中的一种或多种:(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3- 壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺或N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六碳-8-胺,其分别在公开为WO 2012/040184的 PCT/US2011/0523238中进行了描述,其全部内容通过引用并入本文。
在本发明该实施方式的某些方面中,可电离的和阳离子脂质可以包含在WO 2017/049245中描述的脂质,其全部内容通过引用并入本文。
在本发明该实施方式的某些方面中,LNP包含在国际专利申请公开号WO2011/022460A1中描述的一种或多种可电离的阳离子脂质,或其任何药学上可接受的盐,或者其中的任何化合物或盐的立体异构体。
当相同组成的结构在某些原子或基团的空间排列方面不同时,其是立体异构体,并且在分析其之间的相互关系时具有重要意义的考虑因素是拓扑结构。如果两个立体异构体之间的关系是对象与其不可重叠的镜像的关系,则这两个结构是对映体,并且每个结构都被称为手性。立体异构体还包括非对映异构体、顺反异构体和构象异构体。非对映异构体可以是手性或非手性的,不是彼此的镜像。在这些原子是或被视为刚性结构一部分的情况下,顺反异构体仅在原子相对于指定平面的位置不同。构象异构体是可以通过绕正式单键旋转而相互转化的异构体。这种构象异构体的实例包括具有椅式和船式构象的环己烷构象,碳水化合物,具有交错、重叠和偏转构象的线性烷烃构象等。参见J.Org.Chem.35,2849(1970)。
很多有机化合物以光学活性形式存在,其具有旋转平面偏振光平面的能力。在描述光学活性化合物时,前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+) 和(-)用于表示该化合物使平面偏振光旋转的符号,其中(-)或l 表示该化合物是左旋的。带有(+)或d前缀的化合物是右旋的。对于给定的化学结构,对映异构体是相同的,只是其是彼此不可重叠的镜像。对映异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物。本文所述的很多阳离子脂质可以具有一个或多个手性中心,因此可以以不同的对映体形式存在。如果需要,可以用星号(*)表示手性碳。当在本发明的式中将与手性碳连接的键表示为直线时,应理解,式中包含手性碳的(R)和(S)构型,以及因此对映异构体及其混合物。如在本领域中所使用的,当期望指定关于手性碳的绝对构型时,与一个手性碳连接的键可以被描绘为楔形(与平面上方的原子键合),而另一个可以被描绘为一系列短平行线或楔形短平行线(与平面下方的原子键合)。Cahn-Ingold-Prelog 系统可用于将(R)或(S)构型分配给手性碳。
当本发明的阳离子脂质包含一个手性中心时,化合物以两种对映体形式存在,并且本发明包括对映体和对映体混合物,如称为外消旋混合物的特定的50:50混合物。对映异构体可以通过本领域技术人员公知的方法来拆分,如形成非对映异构体的盐,其可以通过例如结晶来分离(参见CRC Handbook of Optical Resolutions via DiastereomericSalt Formation by David Kozma(CRC Press,2001));形成非对映异构体的衍生物或复合物,其可以通过例如结晶、气相-液相色谱或液相色谱分离;使一种对映体与对映体特异性试剂发生选择性反应,例如酶促酯化;或者在手性环境中进行气相-液相色谱或液相色谱,例如在手性支持物(例如,具有键合的手性配体的二氧化硅)上或在手性溶剂存在下进行。将意识到的是,在通过上述分离方法之一将所需对映异构体转化为另一种化学实体的情况下,需要进一步的步骤以释放所需对映异构体形式。或者,可以通过使用光学活性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成,或通过不对称转化将一种对映体转化为另一种对映体来合成特定的对映体。
应将指定本文所述阳离子脂质手性碳处的特定绝对构型理解为是指化合物的指定对映体形式为对映体过量(ee),或换而言之,基本上不含其他对映体。例如,在化合物的“S”形式中基本上不含化合物的“R”形式,因此其“S”形式是对映体过量的。相反的是,在化合物的“R”形式中基本上不含化合物的“S”形式,因此其“R”形式是对映体过量的。如在本文中所使用的,对映体过量是存在超过 50%的特定对映体。在特定的实施方式中,当指定特定的绝对构型时,所示化合物对映体过量为至少约90%。
当本文所述的阳离子脂质具有两个或更多个手性碳时,其可以具有两个以上的光学异构体并且可以以非对映异构体形式存在。例如,当有两个手性碳时,该化合物最多可具有4个光学异构体和2对对映异构体((S,S)/(R,R)和(R,S)/(S,R))。成对的对映体(例如,(S,S)/(R,R)) 是彼此的镜像立体异构体。不是镜像的立体异构体(例如,(S,S)和 (R,S))是非对映异构体。非对映异构体对可以通过本领域技术人员公知的方法分离,例如色谱法或结晶法,并且可以如上所述分离每对中的各个对映异构体。本文所述的LNP包括此类阳离子脂质的每种非对映异构体及其混合物。
LNP还可以包含本文所述的两种或更多种阳离子脂质的任何组合。在某些方面中,阳离子脂质通常占所述颗粒中存在的总脂质的约 0.1至约99.9摩尔%。在某些方面中,阳离子脂质可以占从约80至约 99.9%的摩尔%。在其他方面中,阳离子脂质可以占所述颗粒中存在的总脂质的从约2%至约70%、从约5%至约50%、从约10%至约45%、从约20%至约99.8%、从约30%至约70%、从约34%至约59%、从约 20%至约40%或从约30%至约40%(摩尔%)。
本文所述的LNP可进一步包含非阳离子脂质,其可以是能够产生稳定复合物的多种中性不带电、两性离子或阴离子脂质中的任何一种。尽管其可以带负电荷,但其优选是中性的。可用于本发明的非阳离子脂质的实例包括与与磷脂相关的物质,如天然磷脂、合成磷脂衍生物、脂肪酸、甾醇及其组合。天然磷脂包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(磷脂酸酯)(PA)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰胆碱(lyso PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、N-酰基-PE、磷酸肌醇和磷酸鞘脂。磷脂衍生物包括磷脂酸(DMPA、DPPA、DSPA)、磷脂酰胆碱(DDPC、DLPC、 DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC)、磷脂酰甘油(DMPG、 DPPG、DSPG、POPG)、磷脂酰乙醇胺(DMPE、DPPE、DSPE、 DOPE)和磷脂酰丝氨酸(DOPS)。脂肪酸包括C14:0、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、和花生四烯酸(C20:4)、C20:0、C22:0和卵磷脂。
在本文所述LNP的某些实施方式中,非阳离子脂质选自卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷 -1-羧酸酯(DOPE-mal)。非阳离子脂质还包括甾醇,如胆固醇、豆甾醇或豆甾烷醇。胆固醇是本领域公知的。参见美国专利申请公开号: U.S.2006/0240554和U.S.2008/0020058。在某些实施方式中,LNP 包含磷脂和甾醇的组合。
当存在时,以在LNP中存在的总脂质的摩尔百分比计,非阳离子脂质通常占约0.1%至约65%、约2%至约65%、约10%至约65%或约25%至约65%。本文所述的LNP还包含聚乙二醇(PEG)脂质缀合物(“PEG-脂质”),其可以用作双层稳定组分。PEG脂质的脂质组分可以是任何上述非阳离子脂质,包括天然磷脂、合成磷脂衍生物、脂肪酸、甾醇及其组合。在本文所述LNP的某些实施方式中, PEG-脂质包括如在例如国际专利申请公开号WO 05/026372中所述的与二烷氧基丙基偶联的PEG(PEG-DAA),如在例如美国专利公开号20030077829和2005008689中所述的与二酰基甘油偶联的PEG (PEG-DAG);与磷脂酰乙醇胺(PE)偶联的PEG(PEG-PEG)、或与1,2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯偶联的PEG(PEG-DSG)或者其任何混合物(参见例如美国专利号5,885,613)。
在一个实施方式中,PEG-DAG缀合物是二月桂基甘油(C12) -PEG缀合物、PEG二肉豆蔻基甘油(C14)缀合物、PEG-二棕榈酰基甘油(C16)缀合物、PEG-二月桂基甘氨酰胺(C12)缀合物、PEG- 二肉豆蔻基甘油酰胺(C14)缀合物、PEG-二棕榈酰基甘氨酰胺(C16) 缀合物或PEG-二硬脂酰基甘氨酰胺(C18)。本领域技术人员将容易意识到,其他二酰基甘油也可用于PEG-DAG缀合物中。
在某些实施方式中,PEG-脂质包括但不限于PEG-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘氨酰胺 (PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在某些实施方式中,PEG-脂质是与二肉豆蔻酰基甘油偶联的PEG (PEG-DMG),例如如在下述中所述的Abrams等,2010,Molecular Therapy 18(1):171,以及美国专利申请公开号US 2006/0240554和US 2008/0020058,包括例如2KPEG/PEG200-DMG。
在某些实施方式中,PEG-脂质(如PEG-DAG、PEG-胆固醇、 PEG-DMB)包括平均分子量范围约500道尔顿至约10,000道尔顿、约750道尔顿至约5,000道尔顿、约1,000道尔顿至约5,000道尔顿、约1,500道尔顿至约3,000道尔顿或约2,000道尔顿的聚乙二醇。在某些实施方式中,PEG-脂质包括PEG400、PEG1500、PEG2000或 PEG5000。
上文所述任何脂质中的酰基优选为衍生自具有约C10至约C24 碳链的脂肪酸的酰基。在一个实施方式中,酰基是月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
以在所述颗粒中存在的总脂质的摩尔%计,PEG-脂质缀合物通常占约0.1%至约15%、从约0.5%至约20%、从约1.5%至约18%、从约 4%至约15%、从约5%至约12%、从约1%至约4%或约2%。
在本发明的某些实施方式中,LNP包含一种或多种阳离子脂质、胆固醇和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
在本发明的某些实施方式中,LNP包含一种或多种阳离子脂质、胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
在本发明的某些实施方式中,LNP包含以下述摩尔比组合的脂质化合物:
阳离子脂质(20-99.8摩尔%)
非阳离子脂质(0.1-65摩尔%)和
PEG-DMG(0.1-20摩尔%)。
在本发明的某些实施方式中,LNP包含以下述摩尔比组合的脂质化合物:
阳离子脂质(30-70摩尔%)
非阳离子脂质(20-65摩尔%)和
PEG-DMG(20-65摩尔%)。
在本实施方式的某些方面中,非阳离子脂质是胆固醇。示例性 LNP可以包含约摩尔比58/30/10的阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG。
在本实施方式的某些方面中,非阳离子脂质是胆固醇和DSPC。示例性LNP可以包含约下述摩尔比的阳离子脂质/胆固醇/DSPC/PEG-DMG:59/30/10/1;58/30/10/2;43/41/15/1;42/41/15/2; 40/48/10/2;39/41/19/1;38/41/19/2;34/41/24/1;和33/41/24/2。
LNP的制备
例如,可以通过快速沉淀法形成LNP,其需要使用如下所述的密闭体积混合设备如密闭体积T-混合器、多入口涡旋混合器(MIVM) 或微流体混合器装置将溶于乙醇的脂质组分与水溶液进行微混合。脂质溶液在乙醇中以特定摩尔比含有一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质(例如,DSPC)、PEG-DMG和任选地胆固醇。水溶液由柠檬酸钠或乙酸钠缓冲盐溶液组成,其pH范围为2-6,优选 3.5-5.5。将两种溶液加热至25℃-45℃(优选30℃-40℃)的温度范围,然后在密闭体积混合器中混合,从而立即形成LNP。当使用密闭体积的T-混合器时,T-混合器的内径(ID)范围为0.25至1.0mm。使用程控注射泵将醇溶液和水溶液递送至T-混合器的入口,总流速为 10-600mL/分钟。在密闭体积混合器中将醇溶液和水溶液混合,其比例范围为1:1至1:3vol:vol,但是目标值为1:1.1至1:2.3。在此混合阶段使用的乙醇体积分数,试剂溶液流速和t-混合器管道ID的组合具有将LNP的粒径控制在30至300nm之间的作用。在顺序进行的多阶段在线混合过程中,将所得的LNP混悬液两次稀释到范围在6-8 之间的较高pH缓冲液中。对于第一次稀释,将LNP混悬液与较高 pH(pH 6-7.5)的缓冲溶液混合,混合比范围为1:1至1:3vol:vol,但目标值为1:2vol:vol。该缓冲溶液的温度范围为15-40℃,目标值为 30-40℃。将所得的LNP混悬液进一步与较高pH(例如,6-8)的缓冲溶液混合,混合比范围为1:1至1:3vol:vol,但目标值为1:2vol:vol。此后缓冲溶液的温度范围为15-40℃,目标值为16-25℃。在阴离子交换过滤步骤之前,将混合的LNP保持30分钟至2小时。孵育期间的温度范围为15-40℃,目标值为30-40℃。孵育后,将LNP混悬液通过包含阴离子交换分离步骤的0.8μm过滤器进行过滤。该过程使用的管道ID范围从1mmID至5mm ID和流速从10至2000mL/分钟。将LNP浓缩并通过超滤过程进行渗滤,在此过程中,将醇除去,并将缓冲液交换为最终缓冲液,如磷酸盐缓冲盐水或适用于冷冻保存的缓冲系统(例如,包含蔗糖、海藻糖或其组合)。超滤过程使用切向流过滤形式(TFF)。该过程使用的膜的标称分子量截留范围从30-500 KD,目标值为100KD。膜形式可以是中空纤维或平板盒。具有适当分子量截留值的TFF过程将LNP保留在渗余物中,滤液或渗透液中含有酒精和最终的缓冲液废物。TFF过程是一个多步过程,初始浓度为20-30mg/mL的脂质浓度。浓缩后,将LNP混悬液对最终缓冲液 (例如,pH 7-8的磷酸盐缓冲液(PBS),pH 7-8的10mM Tris、140mM NaCl或者pH 7-8的10mM Tris、70mM NaCl、5wt%蔗糖)渗滤5-20个体积以除去醇并进行缓冲液交换。然后通过超滤将物质另外浓缩1-3倍。LNP制备过程的最后步骤是在无菌条件下将浓缩的 LNP溶液无菌过滤到适宜容器中。无菌过滤是通过使LNP溶液通过预过滤器(Acropak 500PES 0.45/0.8μm胶囊)和生物负荷减少过滤器(Acropak 500PES 0.2/0.8μm胶囊)来完成的。过滤后,将瓶装 LNP产品储存在适宜储存条件下(2℃-8℃,或-20℃,如果是冷冻制剂)。
在一些实施方式中,本文提供的组合物的LNP具有小于1000nm 的平均几何直径。在一些实施方式中,LNP的平均几何直径大于50nm 但小于500nm。在一些实施方式中,LNP的群体平均几何直径为约 60nm、75nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、225nm、 250nm、275nm、300nm、325nm、350nm、375nm、400nm、425nm、 450nm或475nm。在一些实施方式中,平均几何直径在100-400nm、100-300nm、100-250nm或100-200nm之间。在一些实施方式中,平均几何直径在60-400nm、60-350nm、60-300nm、60-250nm或 60-200nm之间。在一些实施方式中,平均几何直径在75-250nm之间。在一些实施方式中,LNP群体中30%、40%、50%、60%、70%、 80%、90%或更多LNP的直径小于500nm。在一些实施方式中,LNP 群体中10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多LNP的直径大于50nm但小于500nm。在一些实施方式中,LNP 群体中10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多LNP的直径为约60nm、75nm、100nm、125nm、150nm、175nm、 200nm、225nm、250nm、275nm、300nm、325nm、350nm、375nm、 400nm、425nm、450nm或475nm。在一些实施方式中,LNP群体中10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多LNP 的直径在100-400nm、100-300nm、100-250nm或100-200nm之间。在一些实施方式中,LNP群体中10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多LNP的直径在60-400nm、60-350nm、60-300 nm、60-250nm或60-200nm之间。
在一个特定实施方式中,LNP的尺寸范围在约1至1000nm之间,优选地在约10至500nm之间,更优选地在约100至300nm之间和优选地100nm。
核酸/多核苷酸
在一些实施方式中,本公开的DNA是密码子优化的。密码子优化方法是本领域公知的,并且可以使用本文所提供的。在一些实施方式中,密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠;GC含量偏倚以增加mRNA稳定性或减少二级结构;尽量减少可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基序列;定制转录和翻译控制区;***或除去蛋白运输序列;去除/添加编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如,糖基化位点);添加、去除或打乱蛋白结构域;***或缺失限制性位点;修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点;调整翻译率,使蛋白的各个结构域正确折叠;或者减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域公知的-非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、 DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专利方法的服务。在一些实施方式中,使用优化算法优化开放阅读框架(ORF)序列。
在一些实施方式中,密码子优化序列与天然存在的或野生型序列具有少于95%序列同一性、少于90%序列同一性、少于85%序列同一性、少于80%序列同一性或少于75%序列同一性。
在一些实施方式中,密码子优化序列与天然存在的或野生型序列具有65%至85%之间(例如,约67%至约85%之间,或约67%至约 80%之间)的序列同一性。在一些实施方式中,密码子优化序列与天然存在的或野生型序列具有65%至75%之间(或约80%)的序列同一性。
治疗方法
本文提供了用于在人和其他哺乳动物中预防和/或治疗RSV的组合物(例如,药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。可以将RSV病毒疫苗用作治疗剂或预防剂。可以将其用作预防和/或治疗感染性疾病的药物。在示例性方面中,本公开的RSV免疫原性组合物用作疫苗以提供对RSV病毒的预防性保护。在施用本公开的RSV疫苗之后,可以实现对RSV病毒的预防性保护。疫苗可以施用一次、两次、三次、四次或更多次。尽管不太理想,但可以向感染个体施用疫苗以达到治疗应答。可能需要相应地调整剂量。
在一些实施方式中,本公开的RSV免疫原性组合物可以用作在受试者中预防RSV感染的方法,所述方法包括向所述受试者施用至少一种本文提供的RSV免疫原性组合物。在一些实施方式中,本公开的RSV免疫原性组合物可以用作在受试者中治疗RSV感染的方法,所述方法包括向所述受试者施用至少一种本文提供的RSV免疫原性组合物。在一些实施方式中,本公开的RSV免疫原性组合物可以用作在受试者中降低RSV感染的发生率的方法,所述方法包括向所述受试者施用至少一种本文提供的RSV免疫原性组合物。在一些实施方式中,本公开的RSV免疫原性组合物可以用作抑制RSV从感染RSV的第一受试者扩散到未感染RSV的第二受试者的方法,所述方法包括向所述第一受试者和所述第二受试者的至少一者施用至少一种本文提供的RSV免疫原性组合物。
在本发明的方面,提供了一种在受试者中引发针对RSV的免疫应答的方法。该方法涉及向受试者施用本文所述的RSV免疫原性组合物,从而在受试者中诱导对RSV具有特异性的免疫应答。
预防有效剂量是在临床上可接受的水平上防止病毒感染的治疗有效剂量。在一些实施方式中,治疗有效剂量是疫苗包装说明书中列出的剂量。
治疗性和预防性组合物
例如,本文提供了用于在人和其他哺乳动物中预防、治疗或诊断 RSV的组合物(例如,药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。可以将 RSV免疫原性组合物(包括疫苗)用作治疗剂或预防剂。可以将其用作预防和/或治疗感染性疾病的药物。在一些实施方式中,根据本公开的RSV免疫原性组合物可以用于治疗RSV。
作为主动免疫方案的一部分,可以向健康个体进行RSV免疫原性组合物(包括RSV疫苗)的预防性或治疗性施用,或者在处于潜伏期的感染早期或症状发作后的主动感染过程中,进行上述预防或治疗。在一些实施方式中,提供给细胞、组织或受试者的本公开疫苗的量可以是对免疫预防有效的量。
可以将包括RSV疫苗在内的RSV免疫原性组合物与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例,预防性或治疗性化合物可以是佐剂或强化剂。如在本文中所使用的,当提及预防性组合物 (如疫苗)时,术语“强化剂”指预防性(疫苗)组合物的额外施用。在早期施用预防性组合物后可以给予强化剂(或强化疫苗)。从预防性组合物的初次施用到强化剂之间的施用时间可以是但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7 小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6 天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5 个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18 个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11 年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20 年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65 年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。在一些实施方式中,从预防性组合物的初次施用到强化剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1 年。
在一些实施方式中,RSV免疫原性组合物(包括RSV疫苗)可以肌内、皮内或鼻内施用,类似于本领域公知的灭活疫苗的施用。在一些实施方式中,RSV免疫原性组合物(包括RSV疫苗)是通过肌内施用的。
RSV免疫原性组合物(包括RSV疫苗)可根据感染的流行程度或未满足的医疗需求的程度或水平在各种环境中使用。疫苗具有优越的性能,因为其产生的抗体效价要大得多,并且比市售的抗病毒剂/ 组合物更早产生应答。
本文提供的药物组合物包含RSV免疫原性组合物,其任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
包括RSV疫苗的RSV免疫原性组合物可以单独或与一种或多种其他组分一起配制或施用。例如,此类组合物可以包含其他组分,其包括但不限于佐剂。
在一些实施方式中,RSV免疫原性组合物不包含佐剂(其是无佐剂的)。
长期以来,铝已被证明主要通过刺激TH2应答来刺激针对共同施用的抗原的免疫应答。优选地,本文提供的组合物的铝佐剂不是铝沉淀物形式。铝沉淀疫苗可能会增强对靶抗原的免疫应答,但已证明其是高度异质的制剂,并且结果不一致(参见Lindblad E.B.Immunology and Cell Biology 82:497-505(2004))。而相反的是,铝吸附疫苗可以以标准化方式进行,这是用于向人施用的疫苗制剂的基本特征。此外,认为所需抗原在铝佐剂上的物理吸附在佐剂功能中具有重要作用,其可能部分是通过能够从注射部位清除较慢或通过抗原呈递细胞更有效地摄取抗原。
本发明的铝佐剂可以是氢氧化铝(Al(OH)3)、磷酸铝(AlPO4)、羟基磷酸铝、无定形羟基磷酸硫酸铝(AAHS)或所谓的“铝” (KA1(SO4)-12H2O)形式(参见Klein等,Analysis ofaluminium hydroxyphosphate vaccine adjuvants by(27)A1MAS NMR.,J.Pharm. Sci.89(3):311-21(2000))。在本文提供的本发明的示例性实施方式中,铝佐剂是羟基磷酸铝或AAHS。在铝佐剂中磷酸盐与铝的比例范围可以是从0至1.3。在本发明这一方面的优选实施方式中,磷酸盐与铝的比例在0.1至0.70范围内。在特别优选的实施方式中,磷酸盐与铝的比例在0.2至0.50范围内。MAPA是羟基磷酸铝的水性混悬液。 MAPA通过将氯化铝与磷酸钠以1:1的体积比混合以沉淀羟基磷酸铝来制备。在混合过程之后,用高剪切混合器将物料减小尺寸,以实现 2-8μm范围内的目标聚集物粒度。然后,将产物对生理盐水进行渗滤并进行蒸汽灭菌。参见例如,国际专利申请公开号WO2013/078102。
在本发明的一些实施方式中,铝佐剂是AAHS形式(在本文中可互换地称为默克铝佐剂(MAA))。在中性pH值下,MAA带有零电荷,而AlOH带有净正电荷,和AlPO4通常带有净负电荷。
本领域技术人员将能够确定铝佐剂的最佳剂量,该最佳剂量既安全又有效地增加了对靶抗原多肽的免疫应答。有关铝的安全性以及 FDA许可疫苗中铝的含量的讨论,参见Baylor等,Vaccine 20:S18-S23 (2002)。在通常情况下,铝佐剂的有效和安全剂量为150至600μg/ 剂量(300至1200μg/mL浓度)。在本发明制剂和组合物的特定实施方式中,每剂疫苗的铝佐剂在200至300μg之间。在本发明制剂和组合物的替代实施方式中,每剂疫苗的铝佐剂在300至500μg之间。
包括RSV疫苗的RSV免疫原性组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起配制或施用。在一些实施方式中,组合物包含至少一种其他活性物质,例如,治疗活性物质、预防活性物质或者两者的组合。组合物可以是无菌的、无热源的或者无菌的和无热源的。药物制剂(如疫苗组合物)的配制和/或生产中的一般注意事项可以参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版, Lippincott Williams&Wilkins,2005(其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方式中,包括RSV疫苗的RSV免疫原性组合物向人、人类患者或受试者施用。
本文所述的RSV免疫原性组合物的制剂可以通过药理学领域中公知或此后开发的任何方法来制备。在通常情况下,这种制备方法包括以下步骤:使活性成分(例如,多肽或多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合,然后,如有必要和/或期望,则将产品分开、成形和/或包装到期望的单剂量或多剂量单元中。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将变化,这取决于所治疗受试者的身份、体型和/或状况,并进一步取决于组合物将被施用的途径。举例来说,组合物可以包含0.1%至100%之间(例如,0.5至50%之间、1-30%之间、5-80%之间、至少80%(w/w))的活性成分。
疫苗施用方式
包括RSV疫苗的RSV免疫原性组合物可以以导致治疗有效结果的任何途径施用。这些包括但不限于皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向需要其的受试者施用组合物的方法。所需的确切量因受试者而异,这取决于受试者的物种、年龄和一般状况,疾病的严重程度,特定的组合物,其给药方式,其活性模式等。RSV免疫原性组合物通常以剂量单位形式配制,以易于施用和剂量均匀。但是,应该理解,疫苗组合物的每日总用量可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者而言,特定的治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素,包括正在治疗的病症和病症的严重程度;所用特定化合物的活性;所用特定组合物;患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食;所用特定化合物的施用时间、施用途径和***速率;治疗持续时间;与所用特定化合物组合或同时使用的药物;以及医学领域众所周知的因素。
在一些实施方式中,RSV免疫原性组合物可以以每天、每天一次或多次、每周、每月等足以递送0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001 mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005 mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg 至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg 至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg受试者体重的剂量水平施用,以获得期望的治疗、诊断、预防或成像作用。在示例性实施方式中,RSV 免疫原性组合物疫苗组合物可以以足以递送0.0005mg/kg至0.01 mg/kg(例如,约0.0005mg/kg至约0.0075mg/kg,例如约0.0005mg/kg、约0.001mg/kg、约0.002mg/kg、约0.003mg/kg、约0.004mg/kg或约0.005mg/kg)的剂量水平施用。
在一些实施方式中,RSV免疫原性组合物可以以足以递送0.025 mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至 0.750mg/kg或0.025mg/kg至1.0mg/kg的剂量水平施用一次或两次 (或更多次)。
可以将本文所述的RSV免疫原性药物组合物配制成本文所述的剂型,如鼻内、气管内或可注射的(例如,静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、真皮内、心内、腹膜内,鼻内和皮下)。
本发明的应用不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的构建细节和元件的排布。本发明能够具有其他实施方式并且能够以各种方式被实践或执行。另外,本文所使用的措词和术语是出于描述的目的,并且不应被视为限制。本文中“包括(including)”、“包含(comprising)”或“具有(having)”、“含有(containing)”、“涉及(involving)”及其变体的使用旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及其他项目。
实施例
实施例1:具有通过肽接头连接的F1和F2片段的单链突变体的产生
野生型RSV F多肽在翻译后被宿主弗林蛋白酶切割成F1和F2片段。为评价未被弗林蛋白酶切割并仍为单一多肽的单链RSV突变体,在融合前稳定DS-Cav1突变(S155C、S190F、V207L和S290C)背景下(McLellan等2013),使用具有各种长度(8-14a.a.)的柔性氨基酸接头替代WT RSV的氨基酸98-146(该氨基酸包含弗林蛋白酶切割位点、p27肽和部分融合肽)。在这些突变体中,将T4噬菌体纤维蛋白三聚结构域(foldon)附加到RSV F胞外域的C端,然后是蛋白酶切割位点和纯化标签。针对哺乳动物密码子的使用,对突变体 RSV F序列进行密码子优化,克隆到表达载体中,并瞬时转染到Expi293悬浮细胞(Life Technologies)中。质粒转染后第3至7天收获细胞物上清液,以评估这些突变体与针对RSV F的不同抗体的结合。简言之,在室温下,用细胞培养物上清液包被96孔Ni-NTA包被板(Thermo Scientific)1小时。通过添加含2%(v/v)胎牛血清白蛋白(BSA)的PBS并且在室温下孵育1小时来封闭未结合的位点。使用含0.05%(v/v)的吐温TM20(聚山梨醇脂20)(PBS-T)洗板,并使用系列稀释的抗体(D25或(帕利珠单抗))在室温下孵育1小时。再次用PBS-T洗板,并在室温下与以1:2,000稀释的山羊抗-人IgG HRP缀合的二抗(Thermo Fisher)一起孵育1小时。再用PBS-T洗涤并用ddH2O短暂漂洗后,加入Super AquaBlue ELISA 底物(eBiosience),并立即在405nm处读板5min。计算每个孔的 mOD/min。
图1A和1B显示了新鲜收集的构建体40a(具有8a.a.接头的 DS-Cav1)转染后第7天的细胞培养物上清液(图1A)或在4℃下储存8天的那些(图1B)与D25和(帕利珠单抗)单克隆抗体的结合。LZF40a突变体显示出较低的融合前特异性mAb D25结合。与帕利珠单抗(其与融合前和融合后F均反应)的结合较高,表明该突变体表达良好。图2A和2B显示了新鲜收集的LZF55a、LZF56a 和LZF57a(分别具有10、12或14氨基酸接头的DS-Cav1;分别为图2A、2B、2C)转染后第3天的细胞培养物上清液或在4℃下储存7天的那些(分别为图2D、2E和2F)与D25和帕利珠单抗的结合。基于与帕利珠单抗的反应性,所有三个突变体均表达良好。在这些突变体中,LZF57a(具有14氨基酸接头的DS-Cav1)显示出最高的融合前特异性mAb D25结合,并在4℃下储存7天后保持D25结合。
除了ELISA以外,还使用抗-RSV F血清在western印迹上分析了在不同转染后时间点收集的细胞培养物上清液。使用具有还原剂的 SDS上样缓冲液(Life Technologies)处理上清液,进行凝胶电泳,然后电转移至硝酸纤维素膜(Life Technologies)上。将膜在含印迹级封闭剂(BioRad)的1X TBST(Tris缓冲盐水+吐温)中在4℃下封闭过夜。将膜与针对野生型RSV F蛋白胞外域的多克隆豚鼠血清 (Sino Biological)孵育,然后与AP偶联的山羊抗豚鼠IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology)孵育。与原始DS-Cav1相比,单链RSV突变体LZF55a、LZF56a和LZF57a显示出显著改善的表达水平(图3)。 DS-Cav1在凝胶上显示为两个条带:上面的条带代表未切割的F蛋白,下面的条带代表弗林蛋白酶切割的F1片段。单链RSV突变体LZF55、 LZF56和LZF57在凝胶上显示为单一主要条带,代表未切割的F。
实施例2:其他稳定突变
单克隆抗体4D7与RSV融合后F蛋白上的抗原性位点I反应,并且可用于评估融合前F结构的稳定性(Flynn等,2016)。通过ELISA 评估新鲜收集的DS-Cav1或构建体LZF57a的细胞培养物上清液与 D25和4D7的结合(图4C)。尽管构建体LZF57a保留了D25结合,表明其是融合前构象,但与原始DS-Cav1构建体相比,其似乎表现出增加的4D7结合,这表明当引入单链接头时可能会有细微的构象变化。为进一步稳定LZF57a单链RSV突变体构建体,进行了基于结构的设计,以生成具有二硫键突变;空腔填充突变;和/或融合后去稳定化突变的变体。特别地,基于融合前F蛋白晶体结构的二硫键突变体 D486C/D489C的模型表明,在内的分子间二硫键可能有助于进一步稳定融合前构象(数据未显示)。将选择的突变与LZF57a突变组合,并且如上所述用融合前特异性mAb D25和4D7进行评价。与构建体LZF57a相比,突变体LZF 111a(对应于具有D486C/D489C 突变的LZF57a)显示出降低的4D7结合,表明其可能采用更像融合前的构象(图4B、4C和4D)。图10显示了LZF111和LZF57构建体的示意图。
为进一步表征LZF111突变体,采用此前描述的改良方法 (McLellan 2013)从培养物上清液中纯化了RSV F蛋白(DS-Cav1 和LZF111a)。简言之,使用Ni-琼脂糖层析(GEHealthcare)纯化具有his标签的蛋白。通过用凝血酶消化过夜来除去标签。在透析过程中进行消化以降低咪唑浓度。为除去共洗脱污染物和未切割的F蛋白,需要对样品进行第二次Ni-琼脂糖层析步骤。通过凝胶过滤层析 (Superdex 200,GE Healthcare)对F蛋白进行进一步纯化,并将其储存在含50mM HEPES pH 7.5、300mM NaCl的缓冲液中。在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE分析,以评估二硫键的形成(图4D)。简言之,使用含有或不含还原剂的SDS上样缓冲液(Life Technologies)处理纯化的蛋白样品,在95℃下加热2-3分钟,并用于NuPAGE(Invitrogen)凝胶电泳。使用Gel Code Blue染色溶液 (Pierce)将凝胶染色,并用水脱色。如所预期的那样,在还原条件下,DS-Cav1在凝胶上显示为两个条带,代表切割的F1和F2片段。在非还原条件下,DS-Cav1主要以接近50kDa的条带出现,代表通过天然二硫键连接在一起的一个切割的F1片段和一个F2片段。正如所预期的,在任一条件下,单链RSV突变体LZF57主要表现为在凝胶上未切割的单体F0条带。在还原和非还原条件下,LZF57的迁移率变化最可能是由于还原条件下致密性的丧失而导致表观分子量的增加。在还原条件下,单链RSV突变体LZF111也主要以未切割的单体F0条带出现在凝胶上。在非还原条件下,尽管在50kDa和100kDa 处(与单体和二聚体形式一致)有两个占第二位优势(subdominant) 的较低条带,但LZF111的主要条带向上移动了接近150kDa,与三聚体的分子量一致。由于D486C/D489C突变是LZF57和LZF111构建体之间的唯一区别,因而该数据表明,设计的分子间二硫键确实在大多数LZF111分子中形成。
实施例3:LZF111稳定性研究
为分析纯化RSV F蛋白的二级结构,在Chirascan光谱仪(Applied PhotophysicsLtD,UK)上获得圆二色性(“CD”)光谱。使用Zeba 旋转柱(Pierce)将缓冲液交换成10mMNa2HPO4,然后将其1:2稀释到10mM Na2HPO4中,产生的DsCav-1和LZF111的最终蛋白浓度分别为3.9μM和4.4μM,对样品进行了分析。使用具有0.5mm路径长度的石英比色杯以未稀释的方式记录CD光谱。将温度对照设为 20℃。将带宽设为1nm。以1nm的间隔获取185nm至260nm之间的数据点,每个时间点采样时间为5s。在温度平衡10分钟后,分别应用三个技术重复,获得样品和缓冲液光谱。从样品光谱中扣除平均缓冲液光谱。使用Origin Pro 7.5SR7软件包(Origin Lab Corporation),使用Savitzky-Golay算法(多项式2,左右两个数据点)对所得数据点进行平滑处理。DS-Cav1和LZF 111的CD光谱几乎相同(图5A 和5B)。使用神经网络对CD光谱(185nm至260nm)进行重建,进一步分析二级结构,该神经网络在具有已解析3D结构的蛋白的CD 光谱上进行训练(软件CDNN:圆二色性神经元网络)(图6),表明LZF111的修饰未导致融合前F蛋白的二级结构发生重大变化。
使用DS-Cav1和LZF111蛋白进行差示扫描荧光法(DSF)分析以评价其稳定性。通过连续稀释制备DS-Cav1蛋白(0.27-35μM)在 50mM HEPES,300mM NaCl中的溶液(pH 7.5)。使用配备Cary 温度控制器的Cary Eclipse荧光计(Agilent Technologies,CA),在光径长度为3mm x 3mm的微型石英比色杯中检测每个85μL蛋白样品的荧光信号。在330nm和350nm处记录固有蛋白荧光。将激发波长设为280nm,缝隙宽度为10nm。将发射狭缝宽度设为2.5nm。在每次测量之前,将光电倍增管电压调整为500V至800V之间的值,以使荧光信号最大化。使用从20℃到95℃以1℃/min的温度斜率以 0.5℃的增量进行热解折叠实验。将样品在起始温度下平衡1min,每个数据点的荧光信号平均1.5s。一个多池支架可以同时分析至多4个样品。导出原始数据,以使用7.5SR7进行进一步处理,以获得荧光强度随温度变化的熔解曲线。使熔融曲线平滑(多项式阶数=1,点数=12),并将350nm和330nm之比一阶导数的峰中心用作熔解温度(Tm)。通过最高信号强度对数据进行归一化,以辅助比较不同蛋白样品或蛋白浓度。DS-Cav1有两个过渡(transition)中点(60.85±1.98℃和80.7±0.93℃),表示为从相同样品类型分析的所有蛋白浓度获得的平均值(Flynn等,2016)(图7)。对于LZF111,显示的Tm(~81℃)从15μM的单一浓度获得(图7)。在~60.85℃时没有较低Tm,在~81℃时较高Tm的较窄峰,这表明LZF111与 DS-Cav1相比具有更高的稳定性。
对于亚单位疫苗抗原,在4℃或更高温度下具有长期稳定性是期望的性质。为了评估DS-Cav1的长期稳定性,我们此前已使用了利用 D25和4D7的抗体结合测定以及生物物理分析。我们的数据证实,在 4℃下长期储存后,DS-Cav1发生构象变化,采用了能够结合4D7的替代结构(Flynn等,2016)。为了评价LZF111的长期稳定性,将纯化的DS-Cav1蛋白或构建体LZF111冷冻或在4℃下保存1、2或3 个月,并在ELISA结合测定中用D25、4D7和帕利珠单抗进行评价。简言之,将纯化的蛋白用PBS稀释至1μg/mL,并在4℃下在96孔ELISA板(NUNC)中包被过夜。通过添加含2%(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS并在室温下孵育1小时封闭未结合的位点。使用含 0.05%(v/v)
20(聚山梨醇脂20)的PBS(PBS-T)洗板,并在室温下与抗体(D25或帕利珠单抗)的系列稀释物孵育1小时。使用PBS-T再次洗板,并在室温下与以1:2,000稀释的山羊抗-人(针对 D25和帕利珠单抗)或抗-小鼠(针对4D7)IgG HRP缀合的二抗 (Thermo Fisher)孵育1小时。再用PBS-T洗涤并用ddH2O短暂漂洗后,加入SuperAquaBlue ELISA底物(eBiosience),并立即在405 nm处读板5min。计算每个孔的mOD/min。图8A、8B和8C表明,在4℃下保存1个月后,尽管两种构建体均保持了D25和帕利珠单抗的相对性,但是使用DS-Cav1检测到4D7结合显著增加,而改良的 LZF111未检测到。此外,在4℃下储存2个月和3个月后,LZF111 没有观察到4D7结合增加(图8D和8E),这表明LZF111的长期稳定性优于DS-Cav1。实施例4:免疫原性研究
设计小鼠免疫原性研究,以比较DS-Cav1和LZF111亚单位疫苗的免疫原性。检测的动物是来自Charles River Laboratories的雌性 BALB/c小鼠。每组10只小鼠在第0周和第3周分别用三种不同剂量 (2μg、0.4μg和0.2μg)的纯化DS-Cav1或LZF 111a蛋白与铝佐剂免疫两次。每次免疫后2周取血,并分析血清。为评估针对融合前F 蛋白的结合抗体效价,用2μg/mL纯化的重组RSV F蛋白DS-Cav1 包被immulon12HB微量酶标板(NUNC),并在4℃下孵育过夜。然后洗板,并使用含3%脱脂奶粉的PBS-T(封闭缓冲液)在室温下封闭1小时。将待测样品在封闭缓冲液中系列稀释4倍(从稀释度1:50 开始),转移至RSV F包被的板中,并在室温下孵育2小时。用PBS-T 洗涤3次后,将在封闭缓冲液中以1:3,000稀释的HRP缀合的抗-小鼠IgG二抗(Invitrogen)添加到板中,再孵育1小时。再次洗板,并在黑暗中用SuperBluTurbo TMB(Virolabs)显影。5分钟后终止反应,并在VersaMax ELISA酶标仪(MolecularDevices)上于450nm 处读取吸光度。ED10ELISA效价是通过GraphPad Prism 7软件中的四参数曲线拟合来确定的,该效价表明给出最大信号10%的血清样品的有效稀释度。图9A显示了第二次给药后血清中针对融合前F蛋白的ED10ELISA效价。底部水平虚线表示检测限。数据表明,在不同剂量下,与DS-Cav1相比,LZF111诱导相似的抗-融合前F抗体水平。
还对小鼠血清进行了中和测定,在检测前将血清在56℃下处理 30min以灭活补体。从1:4的稀释度开始,在含2%FBS的EMEM中制备血清样品的两倍系列稀释物。将稀释的血清一式两份添加到96 孔板中,并与RSV Long毒株(100pfu/mL)混合,总体积为100μl。将病毒和血清样品的混合物在37℃、5%CO2条件下孵育1小时。孵育后,以每孔1.5×104个细胞的浓度添加Hep-2细胞。将板在37℃、 5%CO2条件下孵育3天。然后洗涤细胞,并用80%丙酮固定15分钟。随后,对RSV感染细胞进行免疫染色。简言之,将RSV F和N特异性单克隆抗体添加到具有固定细胞的测试板中,并在室温下孵育1小时。洗涤后,加入生物素化的山羊抗-小鼠IgG并孵育1小时。再次洗板并通过双通道近红外检测(NID)系统显影。将红外染色-链霉亲和素(用于检测RSV特异性信号)和两种用于测定归一化的细胞染料添加到96孔板中,并避光孵育1小时。洗板,避光干燥20分钟,然后在Licor Aerius1自动成像系统上读取,该系统使用700通道激光进行细胞归一化和800通道激光检测RSV特异性信号。计算出 800/700比率,并通过GraphPad Prism 7软件中的四参数曲线拟合确定血清中和效价(IC50)。PD2血清针对RSV Long毒株的血清中和效价如图9B中所示。底部水平虚线表示检测限。数据表明,在不同剂量下,与DS-Cav1相比,LZF111诱导相似的中和抗体水平。
实施例5:棉鼠的免疫原性研究
在本实施例中,在棉鼠RSV攻击模型中进行测定以检测 mRNA/LNP疫苗的免疫原性和功效。更具体地,使用雌性Sigmodon hispidus棉鼠,并在6-7周龄开始免疫。制备所使用的mRNA疫苗并在脂质纳米颗粒中配制。在本研究中评价的mRNA疫苗包括:
MRK-04膜结合DS-Cav1(稳定的融合前F蛋白)
MRK-04_nopolyA_3mut膜结合DS-Cav1(稳定的融合前F蛋白)
mVRC-1(v2)膜结合单链sc9mDS-Cav1、A149C、Y458C(稳定的融合前F蛋白)
mLZF-111膜结合单链mDS-Cav1、D486C、D489C(稳定的融合前F蛋白)
每组8只棉鼠肌肉注射100μL疫苗进行免疫,每个股四头肌注射 50μL。各组接种了下述疫苗:
组别
疫苗
浓度(μg/ml)
剂量(μg)
1
无
NA
NA
2
MRK-04,I.M.
250
25
3
MRK-04_nopolyA_3mut,I.M.
250
25
4
MRK-04_nopolyA_3mut,I.M.
50
5
5
MRK-04_nopolyA_3mut,I.M.
10
1
6
mVRC-1(v2),I.M.
250
25
7
mVRC-1(v2),I.M.
50
5
8
mVRC-1(v2),I.M.
10
1
9
mLZF-111,I.M.
250
25
10
mLZF-111,I.M.
50
5
11
mLZF-111,I.M.
10
1
在实验的第0天和第28天免疫动物。在第28天和第56天,从每只动物中抽血并用于血清学测定。在第56天,用1×105.5PFU RSV A2鼻内攻击棉鼠。接种后四天,通过CO2吸入处死动物,取出肺(左叶)和鼻甲,并在湿冰上在10体积含SPG的Hanks平衡盐溶液(Lonza) 中匀浆。通过以2000rpm离心10分钟使样品澄清,分装样品,速冻,并立即在-70℃下冷冻保存。
RSV中和测定:
使用下述程序评价每只动物的棉鼠血清中和RSV-A(Long毒株) 的能力:
1.将所有血清样品置于设置在56℃下的干浴培养箱中30分钟以使其热灭活。然后,将样品和对照血清在病毒稀释剂(含2%FBS的 EMEM)中以1:3稀释,并将一式两份的样品添加到测定板中并进行系列稀释。
2.将RSV-Long冻存病毒从冰箱中取出,并在37℃水浴中快速解冻。在病毒稀释液中将病毒稀释至2000pfu/mL。
3.将50μL稀释的病毒添加到96孔板的每个孔中,除了用作“无病毒”对照的一列细胞以外。
4.将HEp-2细胞经胰酶消化、洗涤、以1.5x 105个细胞/ml的浓度重悬于病毒稀释剂中,并将100mL悬浮细胞添加到96孔板的每个孔中。然后,将板在37℃、5%CO2条件下孵育72小时。
5.孵育72小时后,用PBS洗涤细胞,并在16-24℃下用溶于PBS 的80%丙酮固定10-20分钟。除去固定剂,并将板风干。
6.然后,将板用PBS+0.05%吐温彻底洗涤。将检测单克隆抗体 143-F3-1B8和34C9在测定稀释剂(1%BSA-PBS-0.1%吐温)中稀释至2.5μg/mL,并将50μL稀释抗体加入96孔板的各孔中。随后,将板在摇床上在16-24℃下的湿盒中孵育60-75分钟。
7.孵育后,将板彻底洗涤。
8.将生物素化的马抗-小鼠IgG在测定稀释剂中以1:200稀释,并添加至96孔板的每个孔中。如上所述孵育板并洗涤。
9.在测定稀释剂中制备IRDye 800CW链霉亲和素(最终稀释度为1:1000)、Sapphire 700(稀释度为1:1000)和5mM DRAQ5溶液 (稀释度为1:10,000)的混合物,并向96孔板的每个孔中添加50mL 混合物。如上所述避光孵育板,洗涤并风干。
10.然后使用Aerius成像仪读板。随后使用Graphpad Prism中的4参数曲线拟合计算血清中和效价。
第1次给药后(第28天)和第2次给药后(第56天)确定的效价如图11中所示。发现所有mRNA疫苗均以剂量依赖性方式激发中和效价。无论所评价的剂量如何,所有mRNA疫苗在第2次给药后均导致效价增加。与MRK-04和MRK-04_nopolyA_3mut相比, mVRC-1(v2)和mLZF111诱导更高的效价,其在5倍更低剂量下显示出更好或相似的血清中和效价。
竞争alphaLISA
表征了针对RSV F-蛋白的用于中和抗体的特定表位的免疫应答。抗原位点II是帕利珠单抗的结合位点,帕利珠单抗是为预防高危婴儿和幼儿下呼吸道感染而开发的单克隆抗体。抗原位点是由RSV自然感染激发的更有效的(potent)中和抗体的结合位点。此外,我们还制备了靶向位点I的抗体(4D7),该位点是融合前构象中未呈现的表位。因此,与D25不同的是,激发4D7竞争性抗体将提示在体内产生了postF样蛋白。开发了一种竞争alphaLISA,以表征对各种基于mRNA的疫苗产生应答的抗原位点抗原位点I和抗原位点II。
为测量竞争抗体效价,将10ul在HiBlock缓冲液(PerkinElmer) 中系列稀释的样品置于384孔alphaLISA板中。将稀释样品与5μl事先已与融合前稳定的RSV F蛋白(DS-Cav1)或融合后RSV F蛋白 (RSV F wt)缀合的AlphaLISA受体小珠(100ug/ml)混合。在室温下孵育30min后,将10ul在Hiblock缓冲液中稀释的生物素化D25、帕利珠单抗或4D7抗体添加到每个孔中。再孵育30min后,将25ul 在HiBlock缓冲液中的链霉亲和素供体小珠(20μg/ml)加入每个孔中,并避光孵育30min。然后,在EnVision_Alpha读板器上读板(在 615nm处检测)。
图12中显示了在第56天(PD2后4周)测得的帕利珠单抗、D25 和4D7的竞争抗体效价。竞争数据表明mVRC-1(v2)诱导了较低水平的4D7-融合后F竞争抗体,而D25-融合前效价和帕利珠单抗效价不受影响。与MRK-04_nopolyA_3mut和mLZF-111相比,这种不同的竞争特征与表达更稳定融合前蛋白的mVRC-1(v2)mRNA相关。
C.棉鼠攻击结果
棉鼠肺和鼻匀浆中RSV滴度的测量方法如下所述。通过离心澄清肺和鼻匀浆,并在EMEM中按1:10和1:100稀释。在24孔板中,从未稀释(纯)样品开始,然后是稀释匀浆液,以每孔50μl一式两份感染汇合的HEp-2单层。在37℃下5%CO2培养箱中孵育1小时后,将孔用0.75%甲基纤维素培养基覆盖,并将板再放入37℃孵箱中。孵育4天后,除去覆盖物,并将细胞用0.1%结晶紫染色剂固定1 小时,然后漂洗并风干。对噬斑计数并以每克组织的噬斑形成单位表示病毒滴度。
为评估疫苗介导的保护,攻击后5天在肺和鼻中测量病毒滴度。所有mRNA疫苗均在肺部产生了全面保护,但是mVRC-1(v2)和 mLZF111在鼻中显示出更好的保护性,其在5倍更低剂量下显示出比 MRK-04和MRK-04_nopolyA_3mut更好或相似的功效(图13)。
实施例6:非洲绿猴的免疫原性和功效
在本实施例中,在非洲绿猴RSV攻击模型中进行测定以检测 mRNA/LNP疫苗的免疫原性和功效。
更具体地,使用体重在1.6到2.65kg之间的雄性和雌性成年非洲绿猴,通过中和抗体效价确定其为RSV阴性。制备所使用的mRNA 疫苗并在脂质纳米颗粒中配制。在本研究中评价的mRNA疫苗包括:
MRK-04_nopolyA_3mut膜结合DS-Cav1(稳定的融合前F蛋白)
mVRC-1(v2)膜结合单链sc9mDS-Cav1、A149C、Y458C(稳定的融合前F蛋白)
mLZF-111膜结合单链mDS-Cav1、D486C、D489C(稳定的融合前F蛋白)
每组4只非洲绿猴用500μL疫苗肌肉注射至一个三角肌进行免疫。各组均接种了表1中所列的下列疫苗。
表1:在非洲绿猴中针对免疫原性进行检测的疫苗制剂
组别
疫苗
浓度(μg/ml)
剂量(μg)
1
MRK-04_nopolyA_3mut,I.M.
50
25
2
MRK-04_nopolyA_3mut,I.M.
10
5
3
mVRC-1(v2)
50
25
4
mVRC-1(v2)
10
5
5
mLZF-111
50
25
6
mLZF-111
10
5
7
RSV A2 5.5log10pfu,I.N.
NA
NA
8
无
NA
NA
在实验第0天、第28天和第56天免疫动物。在第0、14、28、 42、56和70天,从每只动物中抽血并用于血清学测定。在第70天,用1x105.5PFU RSV A2鼻内攻击非洲绿猴。在攻击后第1-14天收集鼻咽拭子,并在攻击后第3、5、7、9、12和14天收集肺灌洗样品以检测病毒复制。
A.RSV中和测定:
如上所述,评价了来自每只动物猴血清的RSV-A(Long毒株) 的中和。在第1次给药后和第2次给药后确定的NT50效价如图14中所示。每次给药后,所有接受mRNA疫苗组的效价都增加了。在第 10周(第3次给药后2周),用mRNA疫苗获得的GMT比接受RSV A2的动物高出1至2个数量级,具体取决于剂量和所检测的mRNA。来自mVRC-1(v2)免疫动物的血清样品显示出最高的中和效价,显示相对于MRK-04_nopolyA_3mut而言,其效价高出五倍。
B.竞争ELISA
如上所述,确定帕利珠单抗、D25和4D7的竞争ELISA效价,以表征对各种基于mRNA的疫苗的抗原位点
抗原位点I和抗原位点II应答。图15显示了在第10周(PD3后2周)测得的帕利珠单抗、D25 和4D7竞争抗体的效价。竞争数据表明,mVRC-1(v2)诱导了较低水平的4D7-融合后F竞争抗体,而D25-融合前效价和帕利珠单抗效价不受影响。这种不同的竞争特征与mVRC-1(v2)mRNA相关,其表达比MRK-04_nopolyA_3mut和mLZF-111更稳定的融合前蛋白。
C.非洲绿猴攻击结果
如上所述,为了评价疫苗功效,在接种疫苗后第70天,用1x105.5 PFU RSV A2鼻内攻击非洲绿猴,并在攻击后收集鼻咽拭子和肺灌洗样品以检测病毒的存在情况。
为了测量非洲绿猴肺灌洗样品中的RSV滴度,按照下面概述的方法进行用于测量病毒滴度的病毒噬斑测定程序。简言之,稀释样品并一式两份添加到含有汇合的HEp-2细胞单层的24孔板中。将板在 37℃下孵育1小时。孵育1小时后,吸出样品接种物,并加入1ml 含有0.75%甲基纤维素的覆盖物。将板在37℃下孵育5天。孵育5 天后,将细胞固定并用结晶紫/戊二醛溶液染色。计数噬斑,将滴度表示为pfu/ml。对支气管肺泡灌洗(BAL)液中病毒含量的分析(图 16A-16C)表明,只有mVRC-1(v2)(25μg)可以在肺中提供全面保护,并且在较低剂量(5μg)下可以提供最佳保护。
为了测量非洲绿猴鼻咽拭子中的RSV滴度,进行了如下RSV RT-qPCR测定来检测RSV A:
1)设备和材料:
A.设备
1.Stratagene Mx3005P实时PCR系统和MxPro软件
2.Jouan GR422离心机或等效产品
3.Jouan板架或等效产品
B.试剂
1.
Probe Rt-PCR试剂盒(1000),目录号#2044452.水,分子生物学级无DNA酶和蛋白酶,5Prime,目录号 #2900136
3.TE缓冲液,10mM Tris 1mM EDTA ph 8.0,Fisher Bioreagents,目录号#BP2473-100
4.病毒引物:RSV A正向和反向引物,Sigma定制,HPLC 纯化。将引物储备液在分子级水中重构至100uM,并在 -20℃下储存。
5.RSV双重标记探针,Sigma定制,HPLC纯化。将探针储备液在TE缓冲液中重构至100uM,并避光在-20℃下储存。
6.内部制备RSV A标准品,并在-20℃下储存。通过设计针对RSV A的N基因的引物对来产生测定标准品。RSV A 标准品的产物长度为885bp。使用QIAGEN OneStep RT-PCR产生此标准品。
7.Promega,16病毒总核酸纯化试剂盒(产品 #AS1150)
C.耗材
1.Stratagene光学盖8x条,目录号#401425
2.Stratagene Mx3000P 96孔板,带裙边(skirted),目录号# 401334
3.ART过滤的移液器吸头
2)RT-PCR反应和设定
A.完全反应混合物(master mix)的制备
1.按照以下设定制备完全反应混合物,使其最终反应体积为 50μL。下表给出了每孔中的体积。最终引物浓度为300 nM,最终探针浓度为200nM。
试剂
μL
2X反应混合物
25
RSV A F 100uM
0.2
RSV A R 100uM
0.2
RSV A FAM 100uM
0.1
RT酶混合物
0.5
水
19
2.在每个孔中加入45μL完全反应混合物。用板盖盖好板,并用铝箔纸包裹以避光。
B.标准曲线的制备
1.从-20℃下取出标准品。
2.使用10倍稀释,将标准品稀释至终浓度为1e6个拷贝/5μL 至1个拷贝/5μL。
C.样品的制备
1.使用16病毒总核酸纯化试剂盒(Promega,产品 #AS1150)制备用于RT-PCR反应的鼻咽拭子和肺灌洗样品。
2.按照生产厂商的方案提取200μL样品,并洗脱到50μL 中用于PCR反应。
D.加入样品
1.向适当的孔中加入5μL提取样品。添加样品后,在添加标准曲线之前,需仔细盖好样品孔。
2.在适当的孔和盖中加入5μL稀释的标准品。
3.向无模板对照(NTC)的孔中加入5μL分子级水。
4.将板包裹在铝箔中,然后将板转移到离心机中。
5.以100rpm的转速离心板2min,以拉下可能在孔侧面上的所有样品或反应混合物。
6.将板包裹在铝箔中,并转移至Stratagene仪器中。
E.热循环仪:Stratagene MX 3005P
1.将板置于Stratagene Mx3005P中,并将热分布条件设定为:
步骤
时间
温度
逆转录
30min
50
PCR初始活化步骤
15min
95
2步循环:
变性
16sec
94
退火/延伸的组合
60sec
62
循环数
40
2.Stratagene Mx3005p软件分析结果
鼻样本中检测到的平均RNA拷贝数如图17A-17C所示。所有基于mRNA的疫苗的保护作用在鼻中都不太明显,但是mVRC-1(v2) 的功效与MRK-04_nopolyA_3mut相比高5倍。
实施例6:在感染过RSV的非洲绿猴中的免疫原性
在感染过RSV的非洲绿猴中检测了在LNP中配制的mRNA疫苗的免疫原性。
选择通过ELISA和中和抗体效价确认为RSV血清阳性的雌性或雄性体重为2.85至4.65kg的健康成年非洲绿猴(n=4或5/组)以供研究。选择用于本研究的动物库已在此前的研究中通过实验方法感染了RSV,并根据其研究前的RSV中和效价在研究组中进行了分配,因此所有组在研究开始时均具有相似的组GMT。感染过RSV的动物提供了对免疫接种的免疫记忆回忆应答模型,其可以反映在血清阳性成人中能够预期的应答,但需要注意的是,RSV暴露后AGM中的抗体应答比人的免疫库更偏向于融合后F蛋白表位。
在第0周时,通过肌内(IM)途径向每只动物施用单剂疫苗。研究设计中还包括仅接受PBS的对照组。如表2所述施用疫苗。接种疫苗后,每天观察动物的接种部位是否有任何变化,或其他活动或进食习惯的变化,其可能表明对疫苗有不良反应,但没有发现。收集血清样品,以评估RSV中和抗体效价,以及帕利珠单抗(位点II)、D25 (位点
)和4D7(位点I)的竞争抗体效价。表2:在RSV血清阳性的非洲绿猴中针对免疫原性进行检测的疫苗制剂
组别
疫苗
浓度(μg/ml)
剂量(μg)
1
MRK-04_nopolyA_3mut,I.M.
10
5
2
mVRC-1(v2),I.M.
10
5
3
mVRC-1(v2),I.M
2
1
4
mLZF-111
10
5
5
mLZF-111
2
1
6
无(PBS)
NA
NA
使用上述方法在基线和疫苗接种后2周收集的血清样品中测量单个动物的NT50效价,结果如图18所示。如结合RSV F蛋白的血清抗体水平的增加(融合前和融合后RSV F,数据未显示)和血清中和抗体水平的提高所证明的,发现所有疫苗均具有高度免疫原性。mVRC-1 (v2)诱导中和效价的最高强化(最高剂量时>100倍),并且在降低5倍剂量时显示出与MRK-04_nopolyA_3mut相似的效力。类似地,相对于MRK-04_nopolyA_3mut,mLZF-111也显示出增强的效力。在 PBS对照组中未观察到效价增加。
为评价在疫苗接种动物中强化应答的质量,在接种后2周收集的血清中确定了帕利珠单抗(位点II)、D25(位点
)和4D7(位点 I)的竞争抗体效价。如上文所述,抗原位点II是在F蛋白的融合前和融合后构象上均发现的中和表位,位点是融合前特异性中和表位,而4D7是融合后特异性表位。由于对融合后构象存在基线免疫偏倚(bias),因而在免疫接种之前,感染过RSV的AGM没有可检测到的D25竞争抗体效价。然而,所有这三种mRNA抗原均诱导高D25 竞争抗体效价,表明AGM在RSV感染后确实引起了能够通过免疫接种强化的抗原位点免疫应答。mVRC-1(v2)免疫接种后,D25竞争抗体效价的强化最高(>450倍),并且在降低5倍剂量时再次显示出与MRK-04_nopolyA_3mut相似的效力。与幼稚动物(棉鼠和AGM)不同的是,我们在mVRC-1(v2)组感染过RSV的AGM 中观察到4D7/post-F特异性抗体的高度强化,证实基线抗体库能够确定免疫接种后表位特异性抗体谱的结果。由于认为在人类中来自自然 RSV感染的B细胞记忆库强烈偏向于融合前构象,因而我们推测人类进行mVRC-1(v2)免疫会优先增强针对这些表位的抗体,已知这些抗体具有更强的中和活性,将导致超过MRK-04_nopolyA_3mut的更高的功效。表3:氨基酸接头、TEV切割位点、凝血酶切割位点和Strep标签的序列
表4:抗原多肽序列
仅使用常规实验,本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的本公开的具体实施方式的很多等同形式。这些等同形式旨在由所附权利要求涵盖。
本文公开的包括专利文件在内的所有参考文献的全部内容各自通过引用并入本文。
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