阅读说明：本技术 核酸投递用聚合物 (Polymers for nucleic acid delivery ) 是由 H.卡布拉尔 内田智士 宫崎拓也 于 2019-02-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供用于投递核酸的聚合物。本发明提供选自下述均聚物(a)和嵌段共聚物(b)的聚合物：均聚物(a),其包含具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链；嵌段共聚物(b),其为具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链与聚乙二醇链的嵌段共聚物。(The present invention provides polymers for delivering nucleic acids. The present invention provides a polymer selected from the following homopolymers (a) and block copolymers (b): a homopolymer (a) comprising a polyglycidyl chain having a side chain containing a primary amine; a block copolymer (b) having a polyglycidyl chain having a side chain containing a primary amine and a polyethylene glycol chain.)

核酸投递用聚合物

技术领域

本发明属于涉及向靶细胞或组织投递核酸的技术领域，更具体而言，本发明涉及聚阳离子荷电性聚合物作为核酸投递用载体的使用和新型聚阳离子荷电性聚合物。

背景技术

从在细胞质中翻译治疗用蛋白质的方面出发，mRNA作为核酸药物而受到关注。此外，关于作为核酸药物之一的质粒DNA，从***至宿主基因组DNA中、输送至细胞核的必要性的方面出发，确认了mRNA相对于质粒DNA的优越性(例如，非专利文献1)。然而，即使全身给与mRNA单体，从迅速受到基于酶的分解、源自磷酸基的负电荷导致的难以被细胞摄取、发生免疫反应等方面出发，也必须开发mRNA输送载体(例如，非专利文献2)。

作为mRNA输送载体之一，聚离子复合物(PIC)型高分子胶束的开发得到推进。例如确认了，当将包含聚乙二醇和聚阳离子的嵌段共聚物作为输送载体并向其添加mRNA时，嵌段共聚物与mRNA通过静电相互作用而形成高分子胶束，能够使mRNA内含在芯内(例如，非专利文献3)。此外，通过使用包含聚乙二醇和聚氨基酸的嵌段共聚物作为嵌段共聚物，而实现了mRNA的酶解的抑制、电荷中和带来的细胞摄取量的增加、高基因表达量(例如，非专利文献3)。

然而，对于向活体的应用，重要的是进一步提高对于酶解、活体中富含的聚阴离子的稳定性。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：U.Sahin et.al.,Nat.Rev.Drug Discovery 13(2014)759-780.

非专利文献2：N.B.Tsui et.al.,Clin.Chem.48(2002)1647-1653.

非专利文献3：S.Uchida et.al.,Biomaterials 82(2016)221-228.

发明内容

发明所解决的技术问题

本发明的目的是提供用于投递RNA等核酸的聚合物。

本发明人为了解决所述问题进行了深入研究的结果，通过设计包含聚乙二醇与聚缩水甘油基胺的嵌段共聚物，将伯胺导入聚缩水甘油基链的侧链，而成功解决所述问题，完成了本发明。

解决问题的技术手段

即，本发明如下。

(1)选自下述均聚物(a)和嵌段共聚物(b)：

均聚物(a)，其包含具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链；

嵌段共聚物(b)，其为具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链与聚乙二醇链的嵌段共聚物。

(2)根据(1)所述的聚合物，其中，

均聚物由下述式I表示，

[化学式1]

式中，R¹表示介由亚甲基或酯键的伯胺，R^5a和R^5b分别独立地表示氢原子、卤素原子或-OCOCH(NH₂)R³所示的基团，m表示2～5000的整数，

R³表示氢原子或化学式2所示的基团，

[化学式2]

式中，R⁴表示任选具有取代基并且碳原子数为1～20的烃基或任选具有取代基的杂环式官能团，j表示0～5的整数。

(3)根据(2)所述的聚合物，其中，

介由亚甲基或酯键的伯胺由下述化学式3表示，

[化学式3]

式中，R³表示氢原子或化学式4所示的基团，或者R³和R⁴分别独立地表示任意氨基酸在蛋白质中的侧链结构，R⁶表示氢原子或者1个或多个任意氨基酸，k表示0～5的整数，

[化学式4]

式中，R⁴表示任选具有取代基并且碳原子数为1～20的烃基或任选具有取代基的杂环式官能团，j表示0～5的整数。

(4)根据(1)所述的聚合物，其中，

嵌段共聚物由下述式II表示，

[化学式5]

式中，R¹表示介由亚甲基或酯键的伯胺，R^2a和R^2b分别独立地表示氢原子或化学式6所示的基团，L^1a和L^1b分别独立地表示连接基团，m表示2～5000的整数，

[化学式6]

式中，R²⁰表示配体分子或-O-CH₃所示的基团，L²表示连接基团，n表示5～20000的整数，

(5)根据(4)所述的聚合物，其中，

介由亚甲基或酯键的伯胺由下述化学式7表示，

[化学式7]

式中，R³表示氢原子或化学式8所示的基团，或者R³和R⁴分别独立地表示任意氨基酸的侧链，R⁶表示氢原子或者1个或多个任意氨基酸，k表示0～5的整数，

[化学式8]

式中，R⁴表示任选具有取代基并且碳原子数为1～20的烃基或任选具有取代基的杂环式官能团，j表示0～5的整数。

(6)根据(2)～(5)中任一项所述的聚合物，其中，

R¹为-CH₂NH₂或-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂所示的基团。

(7)根据(2)～(5)中任一项所述的聚合物，其中，

R¹为化学式9所示的基团，

[化学式9]

式中，R³表示氢原子或化学式10所示的基团，

[化学式10]

-CH₂-R⁴

式中，R⁴表示丙基、任选具有取代基的吲哚基或任选具有取代基的苯基。

(8)根据(4)～(7)中任一项所述的聚合物，其中，

L^1a和/或L^1b为-CH₂CH₂O-所示的基团。

(9)根据(4)～(8)中任一项所述的聚合物，其中，

R²为化学式11所示的基团，

[化学式11]

式中，n表示5～20000的整数。

(10)一种聚离子复合物，其包含(1)～(7)中任一项所述的聚合物和核酸。

(11)根据(10)所述的聚离子复合物，其中，

核酸为RNA或DNA。

(12)根据(11)所述的聚离子复合物，其中，

RNA为siRNA、mRNA、反义RNA、RNA适配体、自我复制RNA(self-replicating RNA)、miRNA(micro RNA)或长链非编码RNA(lncRNA，long no n cording RNA)。

(13)根据(11)所述的聚离子复合物，其中，

DNA为反义DNA、DNA适配体、pDNA(质粒DNA)或MCDNA(minicir cle DNA)。

(14)一种试剂盒，其用于制备向靶细胞或组织投递核酸的装置，其中，

所述试剂盒包含(1)～(9)中任一项所述的聚合物。

(15)一种试剂盒，其用于制备向靶细胞或组织投递核酸的装置，其中，

所述试剂盒包含(10)～(13)中任一项所述的聚离子复合物。

(16)一种方法，其是制造具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链与聚乙二醇链的嵌段共聚物的方法，其中，

使聚乙二醇脱水后，进行环氧开环聚合，得到聚乙二醇与具有侧链的聚缩水甘油基链的嵌段共聚物，将伯胺导入该聚缩水甘油基链的侧链。

(17)根据(16)所述的方法，其中，

使用甲苯进行脱水。

(18)根据(16)或(17)所述的方法，其中，

使用1,2-环氧-5-己烯或表氯醇进行环氧开环聚合。

发明效果

通过本发明，使RNA药物可应用在医疗中。例如，siRNA的情况下能够抑制成为活体内疾病的原因的基因表达，mRNA的情况下能够安全并且持续性地供给治疗用蛋白质。此外，可显著地抑制RNA的酶解，提高RNA导入效率。

附图说明

[图1]是表示进行了包含PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PG Leu的高分子胶束对分解酶的稳定性试验结果的图。

[图2]是表示使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA的向培养细胞导入基因的试验结果的图。

[图3]是表示使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyr的肝素中的耐聚阴离子性试验结果的图。

[图4]是表示使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyr的肝素中的耐聚阴离子性试验结果的图。

[图5]是表示使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA的活体内的稳定性试验结果的图。

[图6]是表示使用了PEG-PLL和PEG-PGLeu的水解试验结果的图。

[图7]是表示进行使用了PEG-PLL、PEG-PGLeu的对于培养细胞的毒性试验结果的图。

[图8]是表示伴随着胶束形成的反应热的图。

[图9]是表示PEG-PGTrp聚合物和胶束的荧光强度的图。

[图10]是表示PEG-PGTyr聚合物和胶束的荧光强度的图。

[图11]是表示mRNA胶束对血清中的酶解的稳定性的图。

[图12]是表示mRNA胶束向培养细胞导入萤光素酶基因的图。

[图13]是表示内含mRNA的胶束在血中的滞留性的图。

[图14]是表示由内含mRNA的胶束带来的萤光素酶基因的导入的图。

[图15]是表示由内含mRNA的胶束带来的萤光素酶基因的导入的图。

[图16]是表示生理盐条件下的聚合物中的伯胺量的图。

[图17]是表示生理盐条件下的聚合物中的伯胺量的图。

具体实施方式

本发明涉及包含聚乙二醇与聚缩水甘油基胺的嵌段共聚物或由聚缩水甘油基胺形成的均聚物，并且聚缩水甘油基链的侧链上导入有伯胺。

本发明人等着眼于嵌段共聚物的主链的化学结构。可认为，在包含质粒DNA等柔软性较低的双链核酸与柔软性较低的聚氨基酸的聚离子复合物中，在形成高分子胶束前后未观察到熵的变化，但是在包含mRNA等柔软性较高的单链核酸与柔软性较低的聚氨基酸的聚离子复合物中，在形成高分子胶束后，mRNA的运动被聚氨基酸大幅限制，由此使熵大幅减少(例如，K.Hayas hi et.al.,Macromol.Rapid Commun.37(2016)486-493.)。

因此，本发明人考虑能否通过柔软性较高的嵌段共聚物来提高形成高分子胶束后mRNA的运动性、降低熵的减少。具体而言，关于聚阳离子链，通过将主链结构设为包含醚键的聚缩水甘油基链，而设计了柔软性较高的嵌段共聚物。此外，通过设计聚阳离子链的侧链亚甲基数较少的嵌段共聚物，而确认侧链亚甲基数对稳定性的影响。此外，针对活体的医疗应用，进行了生物分解性聚合物的设计。具体而言，介由生物分解性酯键而在聚缩水甘油基链的侧链结构中导入了氨基酸。

1.聚合物

本发明提供选自下述均聚物(a)和嵌段共聚物(b)的聚合物：

均聚物(a)，其包含具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链；

嵌段共聚物(b)，其为具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链与聚乙二醇链的嵌段共聚物。

本发明的聚合物例如为下述式I或II所示的。

均聚物(a)，其包含具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链：

下述式I表示的均聚物：

[化学式12]

式中，R¹表示介由亚甲基或酯键的伯胺，R^5a和R^5b分别独立地表示氢原子、卤素原子或-OCOCH(NH₂)R³，m表示2～5000的整数，

R³表示氢原子或下述化学式13表示的基团，

[化学式13]

式中，R⁴表示任选具有取代基并且碳原子数为1～20的烃基或任选具有取代基的杂环式官能团，j表示0～5的整数。

所述式I表示的聚合物中，作为介由亚甲基的伯胺或介由酯键的伯胺，例如可举出下述式表示的：

[化学式14]

R³表示氢原子或下述化学式15表示的基团，或者R³和R⁴分别独立地表示任意氨基酸在蛋白质中的侧链结构，R⁶表示氢原子或者1个或多个任意氨基酸，k表示0～5的整数，

[化学式15]

式中，R⁴表示任选具有取代基并且碳原子数为1～20的烃基或任选具有取代基的杂环式官能团，j表示0～5的整数。

R³和R⁴例如为任意氨基酸(例如20种氨基酸)在蛋白质中的侧链结构。

此外，本发明中，-NHR⁶的R⁶可设为任意氨基酸(例如20种天然氨基酸、人工氨基酸)、二肽、三肽、四肽等。此外，在将R⁶设为1个或多个任意氨基酸的情况下，可形成酰胺键而进行添加。

例如，可代替实施例所述的PGLeu、PGGTry的亮氨酸、色氨酸，而设为半胱氨酸、组氨酸、其它碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸)。设为半胱氨酸时，可形成二硫键，此外，在设为组氨酸时，可赋予聚合物以内体逃逸能力。设为碱性氨基酸时，可增加阳离子电荷。此外，也可设为PGLeu键合色氨酸而成的二肽(PGLeu-Trp)、PGLeu键合半胱氨酸而成的二肽(PGLeu-Cys)、PGLeu键合组氨酸而成的二肽(PGLeu-His)。

键合任意氨基酸时，-NHR⁶的NH部分变为不是伯胺，但是键合的氨基酸具有伯胺，因此这些化合物也包含在本发明中的“介由酯键的伯胺”中。

本发明中，-NHR⁶的R⁶可举出-(COCR³NH)_p-H表示的基团。R³与上述相同。p为重复单元，表示1～10000的整数。

此处，作为任选具有取代基的杂环式官能团，例如可举出：吲哚环、吡咯烷酮基、呋喃环、吡啶环、吗啉环、环氧环、嘌呤环、嘧啶环等。

此外，式I中，作为卤素原子可举出F、Cl、Br、I等。

式I表示的聚合物中，R^5a和R^5b，在介由亚甲基的伯胺的情况下可设为Br(溴)，在介由酯键的伯胺的情况下可设为-OCOCH(NH)R³的结构。

嵌段共聚物(b)，其为具有含伯胺侧链的聚缩水甘油基链与聚乙二醇链的嵌段共聚物：

[化学式16]

式II中，R¹表示介由亚甲基的伯胺或介由酯键的伯胺，这些伯胺的详细与上述相同。

R^2a和R^2b分别独立地表示氢原子或亲水性基团。作为亲水性基团，例如可举出：

下述化学式17表示的基团(例如聚乙二醇)：

[化学式17]

式中，R²⁰表示-O-CH₃表示的基团或配体分子，L²表示连接基团，n表示5～20000的整数。

R^2a和R^2b，除了上述式表示的基团(聚乙二醇)之外，也可设为其他亲水性基团(亲水性聚合物)。作为这样的亲水性基团，例如可举出：聚乙烯亚胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、2-丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、N-(2-甲基丙烯酸酰胺)乙基磷酸胆碱、4-甲基丙烯酰氧基丁基磷酸胆碱等。

配体分子表示将特定的活体分子进行靶向使用的化合物，例如可举出抗体、蛋白质、氨基酸、低分子药剂、活体高分子的单体等。

本发明中，L^1a和L^1b分别独立地表示连接基团，m表示2～5000的整数。连接基团表示嵌段共聚物的各嵌段间的间隔物，例如可表示单键或-CH₂CH₂O-表示的基团。

作为R¹，例如可举出-CH₂NH₂或-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂表示的基团。此外，R¹可举出下述化学式18表示的基团：

[化学式18]

式中，R³表示氢原子或下述化学式19表示的基团，

[化学式19]

-CH₂-R⁴

式中，R⁴表示丙基、任选具有取代基的吲哚基或任选具有取代基的苯基。

R^2a和/或R^2b，例如可举出下述式表示的基团：

[化学式20]

式中，n表示5～20000的整数。

<就烃基、取代基等而言>

烃基为饱和或不饱和的非环式或环式。在烃基为非环式的情况下，可以为直链状或支链状。烃基包含：碳原子数1～20(记载为“C_1-20”。其他碳原子数的情况也同样)烷基、C_2-20烯基、C_2-20炔基、C_4-20烷基二烯基、C_6-18芳基、C_7-20烷基芳基、C_7-20芳基烷基、C_3-20环烷基、C_3-20环烯基、C_1-20烷氧基、C_6-20芳氧基、C_7-20烷基芳氧基、C_2-20烷氧基羰基等。

作为C_1-6烷基，例如可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。

作为C_1-20烷基，例如可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。

作为C_2-20烯基，例如可举出乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基烯丙基、2-丁烯基等。

作为C_2-20炔基，例如可举出乙炔基、丙炔基、丁炔基等。

作为C_4-20烷基二烯基，例如可举出1,3-丁二烯基等。

作为C_6-18芳基，例如可举出苯基、1-萘基、2-萘基、茚基、联苯基、蒽基、菲基等。

作为C_7-20烷基芳基，例如可举出邻甲苯基、间甲苯基、对甲苯基、2,3-二甲苯基、2,5-二甲苯基、邻异丙基苯基、间异丙基苯基、对异丙基苯基、均三甲苯基等。

作为C_7-20芳基烷基，例如可举出苄基、苯乙基、1-萘基甲基、2-萘基甲基、1-苯基乙基、苯基丙基、苯基丁基、苯基戊基、苯基己基、甲基苄基、二甲基苄基、三甲基苄基、乙基苄基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基、二乙基苄基等。

作为C_3-20环烷基，例如可举出环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。

作为C_3-20环烯基，例如可举出环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基等。

作为C_1-20烷氧基，例如可举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等。

作为C_6-20芳氧基，例如可举出苯氧基、萘氧基、联苯氧基等。

作为C_7-20烷基芳氧基，例如可举出甲基苯氧基、乙基苯氧基、丙基苯氧基、丁基苯氧基、二甲基苯氧基、二乙基苯氧基、二丙基苯氧基、二丁基苯氧基、甲基乙基苯氧基、甲基丙基苯氧基、乙基丙基苯氧基等。

作为C_2-20烷氧基羰基，例如可举出甲氧基羰基、乙氧基羰基、2-甲氧基羰基、叔丁氧基羰基等。

作为任选具有取代基的烃基、任选具有取代基的杂环式官能团中的取代基的具体例，例如可举出卤素原子(F、Cl、Br、I)、羟基、硫醇基、硝基、氰基、甲酰基、羧基、氨基、甲硅烷基、甲磺酰基、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-8环烷基、C_6-10芳基、C_1-6烷氧基、C_1-7酰基或C_2-7烷氧基羰基等。

本发明中，优选任选具有取代基的苯基、任选具有取代基的杂环式官能团，但不限于此。

式I表示的聚合物的分子量(Mn)没有限定，可以为200～500000，优选为1000～100000。

此外，式II表示的嵌段共聚物的分子量(Mn)没有限定，可以为400～1400000，优选为1000～144000。此外，各个嵌段部分中，PEG部分的分子量例如为200～200000，优选为200～44000。聚缩水甘油基链部分的分子量例如为200～500000，优选为1000～100000。

2.聚合物的制造

(1)式I表示的聚合物的制造

式I表示的聚合物的制造方法如下文所述。

通过以四正辛基溴化铵为引发剂的环氧开环聚合，得到由具有侧链的聚缩水甘油基链形成的均聚物。环氧开环聚合，只要具有环氧基的结构作为聚合单体就没有特别限定，例如可使用：表氯醇、1,2-环氧-5-己烯、1-烯丙基-2,3-环氧丙烷、表溴醇、3,4-环氧-1-丁烷、1,2-环氧-9-癸烯、2,3-环氧丙基炔丙基醚等。

聚合后，优选对化学合成得到的嵌段共聚物的分子量分布和聚合度进行分析。

此外，为了通过与RNA的静电相互作用而制备多聚物，向得到的嵌段共聚物的聚缩水甘油基链的侧链导入伯胺。就向聚缩水甘油基链的侧链导入伯胺而言，通过在硼氢化氨基化中适当选择溶剂，而能够实现高收率。这样得到的在侧链导入有伯胺的聚缩水甘油基链，也称为聚缩水甘油基胺。

(2)式II表示的聚合物的制造

式II表示的聚合物的制造方法如下文所述。

就嵌段共聚物的化学合成而言，认为作为引发剂的聚乙二醇链的吸水性会阻碍聚合。因此，在聚合前通过共沸对聚乙二醇进行脱水。接着，进行环氧开环聚合，得到包含聚乙二醇与具有侧链的聚缩水甘油基链的嵌段共聚物。该情况下，通过甲苯等对聚乙二醇进行脱水，能够进行环氧开环聚合，合成分子量分布和聚合度得到了控制的嵌段共聚物。环氧开环聚合，只要具有环氧基的结构作为聚合单体就没有特别限定，例如可使用：表氯醇、1,2-环氧-5-己烯、1-烯丙基-2,3-环氧丙烷、表溴醇、3,4-环氧-1-丁烷、1,2-环氧-9-癸烯、2,3-环氧丙基炔丙基醚等。

聚合后，优选对化学合成得到的嵌段共聚物的分子量分布和聚合度进行分析。

此外，为了通过与RNA的静电相互作用而制备高分子胶束，在得到的嵌段共聚物的聚缩水甘油基链的侧链导入伯胺。就向聚缩水甘油基链的侧链导入伯胺而言，通过在硼氢化氨基化中适当选择溶剂，能够实现高收率。由此得到的在侧链导入了伯胺的聚缩水甘油基链，也称为聚缩水甘油基胺。

本发明中，作为式II表示的聚合物的具体例，可举出后述的制造例2～7所述的聚合物。

3.聚离子复合物

本发明的聚离子复合物(聚合物复合体)是可以通过将核酸和本发明的聚合物在缓冲液中混合而得到的高分子化合物的复合体，也称为聚离子复合物(PIC)或聚离子复合物型高分子胶束(PIC胶束)。

在形成本发明的聚离子复合物的聚合物为包含PEG和聚缩水甘油基胺的嵌段共聚物的情况下，核酸和聚阳离子部分发生静电相互作用而形成芯部分，其外侧由PEG包覆。

本发明的聚合物复合体，例如可以通过将核酸和聚合物在任意缓冲液中混合而容易地进行制备。

就本发明的PIC的尺寸而言，例如，基于动态光散射测定法(DLS)的粒径为60～80nm。

聚合物和核酸的混合比没有限定，例如，嵌段共聚物中的阳离子性基团(例如氨基)的总数(N)与核酸中的磷酸基的总数(P)的比(N/P比)优选为1～30，更优选为1～10，进一步优选为1～3。

作为该制造方法的具体例，可参照后述实施例所述的合成图示。

本发明的聚离子复合物中，作为核酸的输送载体的功能，可将血清中的稳定性和蛋白质翻译效率作为指标而进行评价。此外，对于活体内丰富存在的聚阴离子的稳定性的评价或作为体内(in vivo)环境中的输送载体的功能，可将血中滞留性作为指标进行评价。

本发明的另一方式中，为了针对临床应用设计生物分解性输送载体，可以设计在聚缩水甘油基链的侧链介由酯键而导入有氨基酸的生物分解性嵌段共聚物。该情况下，由于酯键的开裂，使得活体内聚合物的毒性减少。酯键的开裂，可以通过进行生理盐条件中的聚合物内的伯胺的定量而评价。聚合物毒性的评价中，也可使用活细胞而进行。

例如，就导入有作为氨基酸之一的亮氨酸的生物分解性聚合物而言，作为RNA的输送载体的功能评价，进行活体内丰富存在的聚阴离子和血清中的稳定性的评价。此处，由于亮氨酸中的异丁基而使得聚离子复合物的疏水性相互作用提高。

此外，对本申请发明的胶束在血清中的稳定性进行评价时，表现出比聚赖氨酸链构成的胶束更高的稳定性，结果表现出高翻译效率。此外，从也提高对于活体内丰富存在的聚阴离子的稳定性的方面出发，期待在活体内中表现出高稳定性。使用尤其是耐酶性存在大问题的mRNA，对体内(in vivo)环境中的血中滞留性进行评价。此时，本申请发明的胶束的情况下，表现出比具有聚赖氨酸链的胶束更优异的血中滞留性。由此，通过导入具有低应变的醚键的聚缩水甘油基链，实现了提高活体内的mRNA对于酶解的抗性。

就生物分解性输送载体而言，对导入聚合物和氨基酸之间的酯键在生理盐条件中的开裂进行评价时，确认到伴随水解的伯胺的减少，对于培养细胞的毒性减少。此外，就导入有作为疏水性氨基酸之一的亮氨酸的生物分解性聚合物构成的高分子胶束而言，对对于活体内丰富存在的聚阴离子的稳定性进行评价时，表现出比不具有作为疏水性官能团的异丁基的聚合物更高的稳定性。由此，成功开发了在活体内中具有高稳定性和低毒性的输送载体。

4.核酸

本发明的聚离子复合物中，作为芯部分的构成成分而内含的核酸，在一个实施方式中为DNA或RNA。作为RNA，可举出：mRNA、siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)、反义核酸(反义RNA)、适配体(RNA适配体)、自我复制RNA(self-replicating RNA)、miRNA(micro RNA)、长链非编码RNA(lncRNA、long non cording RNA)等。作为DNA，可举出反义核酸(反义DNA)、适配体(DNA适配体)、pDNA(质粒DNA)、MCDNA(minicircle DNA)等。

siRNA是可利用RNA干涉(RNAi:RNA interference)而抑制目的基因的表达的物质即可，例如，作为目的基因，可优选举出癌症(肿瘤)基因、抗凋亡基因、细胞周期相关基因、增殖信号基因等。此外，siRNA的碱基长通常低于30碱基(例如19～21碱基)即可，没有限定。

siRNA等的核酸分子为聚阴离子，因此能够通过静电相互作用而与所述嵌段共聚物的聚阳离子部分的侧链结合(缔合)。

5.核酸投递装置用试剂盒

本发明的核酸投递装置用试剂盒包含本发明的聚合物。该试剂盒可优选用于例如利用RNAi对于各种靶细胞进行的基因治疗、利用了mRNA的蛋白质治疗。

本发明的试剂盒中，聚合物的保存状态没有限定，可考虑其稳定性(保存性)和使用容易性等而选择溶液态或粉末状等状态。

本发明的试剂盒，除了所述聚合物以外，可以包含其他构成要素。作为其他构成要素，例如可举出：导入细胞内的核酸、用于溶解或稀释等的各种缓冲液、溶解用缓冲液、各种蛋白质和使用说明书(使用手册)等，可根据使用目的和使用的聚合物的种类而适宜选择。

本发明的试剂盒，用于制备以待导入靶细胞内的期望的核酸(例如mRNA或siRNA)为芯部分的聚离子复合物(PIC)，制备得到的PIC可有效用于向靶细胞投递核酸的装置。

6.核酸投递装置

本发明中，提供包含所述聚离子复合物的核酸投递装置。本发明的投递装置，可以将难以以稳定的状态向靶细胞内投递的核酸制成提高了对于酶解的抗性的稳定化状态。

本发明的投递装置可适用于人类、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猫等各种动物等各种动物，没有限定。向被试验动物的给药方法，通常采用静脉滴注等非口服方法，给药量、给药次数和给药期间等的各条件可根据被试验动物的种类和状态而适宜设定。

本发明的投递装置可用于向成为各种疾病的原因的细胞中导入期望的核酸的治疗(基因治疗)中。因此，本发明也可以提供包含所述多聚物的各种疾病的治疗用药物组合物、包含该药物组合物作为有效成分的各种疾病用基因治疗剂和使用所述PIC的各种疾病的治疗方法(特别是基因治疗方法)。

给药的方法和条件与上述相同。此外，作为各种疾病，例如可举出癌症(例如肺癌、胰腺癌、脑癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、膀胱癌等)、心血管疾病、运动性疾病、中枢神经系统疾病等，没有特别限定。

就所述药物组合物而言，可适宜选择并使用药剂制造中通常使用的赋形剂、填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、防腐剂、调味剂、舒缓剂、稳定剂和张力剂等，通过常规方法进行制备。此外，药物组合物的形态，通常采用静脉内注射剂(包含滴注)，例如以单位给药量安瓿或多给药量容器的状态等进行提供。

实施例

以下，通过实施例对本发明进一步具体性地进行说明。但是，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1

各种聚合物的合成

制造例1：聚乙二醇-block-聚(L-赖氨酸)的合成

合成图示：

[化学式21]

将末端具有氨基的聚乙二醇通过真空干燥而脱水，将作为聚合单体的ε-三氟乙酸-L-赖氨酸(Lysine)-N-羧酸酐(Lys(TFA)-NCA)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在35℃下进行1晚聚合反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，将聚合物溶解在甲醇中，添加氢氧化钠水溶液在室温进行1晚反应。反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。得到的聚合物(以下，也称为PEG-PLL)是可用下述结构式表示的聚合物，n＝272，m＝83。

[化学式22]

制造例2：聚乙二醇-block-聚(缩水甘油基丁基胺)的合成

合成图示：

[化学式23]

将末端具有羟基的聚乙二醇溶解在甲苯(toluene)中，在180℃加热1小时而使聚乙二醇脱水。添加作为聚合单体的1,2-环氧-5-己烯和作为催化剂的三异丁基铝，在室温进行1晚聚合反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，将聚合物溶解在四氢呋喃中，添加硼烷在66℃下进行1晚回流。添加粉末状的羟胺-O-磺酸并在室温下进行1晚反应。反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。得到的聚合物(以下，也称为PEG-PGBA)是可通过下述结构式表示的聚合物，n＝272，m＝93。

[化学式24]

制造例3：聚乙二醇-block-聚(缩水甘油基甲基胺)的合成

合成图示：

[化学式25]

将末端具有羟基的聚乙二醇溶解在甲苯中，在180℃加热1小时而使聚乙二醇脱水。添加作为聚合单体的表氯醇(Epichorihydrin)和作为催化剂的三异丁基铝，在室温进行1晚聚合反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，将聚合物溶解在DMF中，添加叠氮化钠并在180℃下进行1晚反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。此外，将聚合物溶解在DMF中，添加三苯基膦并在室温下进行1晚反应。反应后添加水并进行1晚反应，反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。得到的聚合物(以下，也称为PEG-PGMA)是可通过下述结构式表示的聚合物，n＝272，m＝81。

[化学式26]

制造例4：聚乙二醇-block-聚(缩水甘油基甘氨酸)的合成

合成图示：

[化学式27]

将末端具有羟基的聚乙二醇溶解在甲苯中，在180℃加热1小时而使聚乙二醇脱水。添加作为聚合单体的表氯醇和作为催化剂的三异丁基铝，在室温进行1晚聚合反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，添加氢氧化钠水溶液并进行1晚反应，反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。此外，将聚合物溶解在DMF中，添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-甘氨酸(glycine)和二甲基氨基吡啶、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺并进行1晚反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，将聚合物溶解在DMF中，添加哌啶并进行1晚反应。反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。得到的聚合物(以下，也称为PEG-PGGly)是可通过下述结构式表示的聚合物，n＝272，m＝81。

[化学式28]

制造例5：聚乙二醇-block-聚(缩水甘油基亮氨酸)的合成

合成图示：

[化学式29]

将末端具有羟基的聚乙二醇溶解在甲苯中，在180℃加热1小时而使聚乙二醇脱水。添加作为聚合单体的表氯醇和作为催化剂的三异丁基铝，在室温进行1晚聚合反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，添加氢氧化钠水溶液并进行1晚反应，反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。此外，将聚合物溶解在DMF中，添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-亮氨酸(Leucine)和二甲基氨基吡啶、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺并进行1晚反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，将聚合物溶解在DMF中，添加哌啶并进行1晚反应。反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。得到的聚合物(以下，也称为PEG-PGLeu)是可通过下述结构式表示的聚合物，n＝272，m＝81。

[化学式30]

制造例6：聚乙二醇-block-聚(缩水甘油基色氨酸)的合成

合成图示：

[化学式31]

将末端具有羟基的聚乙二醇溶解在甲苯中，在180℃加热1小时而使聚乙二醇脱水。添加作为聚合单体的表氯醇和作为催化剂的三异丁基铝，在室温进行1晚聚合反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，添加氢氧化钠水溶液并进行1晚反应，反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。此外，将聚合物溶解在DMF中，添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-色氨酸(Tryptophan)和二甲基氨基吡啶、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺并进行1晚反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，将聚合物溶解在DMF中，添加哌啶并进行1晚反应。反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。得到的聚合物(以下，也称为PEG-PGTry)是可通过下述结构式表示的聚合物，n＝272，m＝81。

[化学式32]

制造例7：聚乙二醇-block-聚(缩水甘油基酪氨酸)的合成

合成图示：

[化学式33]

将末端具有羟基的聚乙二醇溶解在甲苯中，在180℃加热1小时而使聚乙二醇脱水。添加作为聚合单体的表氯醇和作为催化剂的三异丁基铝，在室温进行1晚聚合反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，添加氢氧化钠水溶液并进行1晚反应，反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。此外，将聚合物溶解在DMF中，添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-酪氨酸(Tryosine)和二甲基氨基吡啶、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺并进行1晚反应。反应后通过使用了***的再沉淀法而进行纯化，通过真空干燥得到粉末状的聚合物。接下来，将聚合物溶解在DMF中，添加哌啶并进行1晚反应。反应后进行对于水的透析而进行纯化，通过冷冻干燥得到粉末状的聚合物。得到的聚合物(以下，也称为PEG-PGTyr)是可通过下述结构式表示的聚合物，n＝272，m＝81。

[化学式34]

实施例2

使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeu的血清中的耐酶性试验

该实施例中，通过胎牛血清(FBS)评价包含PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeu的高分子胶束对于分解酶的稳定性。

<材料和方法>

PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeu和萤光素酶mRNA形成的胶束，将PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeu溶液与mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。需要说明的是，此处所谓的N/P比是指通过下述式定义的量，下文中如果没有特别说明，N/P比就是指该量。

N/P比＝(溶液中的聚合物的氨基的总数)/(溶液中的核酸的磷酸基的总数)

将FBS用10mM HEPES buffer(pH7.3)以成为50％的方式稀释，向其添加胶束溶液后，在37℃静置15分。然后，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)从溶液提取mRNA。使提取得到的mRNA逆转录为互补DNA(cDNA)后，通过qRT-PCR对残存的cDNA进行定量评价。将未在FBS存在下进行37℃静置的情况的mRNA量设为100％，表示为相对值。

<结果>

如图1表示，包含PEG-PGBA的胶束表现出比包含PEG-PLL的胶束更高的耐酶性。这一事实表明，通过PEG-PGBA的柔软的聚缩水甘油基链而提高了耐酶性。另一方面，包含PEG-PGMA的胶束表现出与包含PEG-PGBA的胶束相同程度的耐酶性，由此确认了，侧链亚甲基数对于耐酶性没有影响。此外，包含PEG-PGLeu的胶束表现出比包含PEG-PGBA的胶束更高的耐酶性。这一事实表明，通过PEG-PGLeu的疏水性的异丁基而提高了耐酶性。

实施例3

使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA的向培养细胞的基因导入

该实施例中，通过萤光素酶mRNA评价包含PEG-PLL、PEG-PGBA或PEG-PGMA的高分子胶束向培养细胞导入基因的能力。

<材料和方法>

PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

作为细胞的制备，将HuH-7细胞以1.0×10⁴cells/well接种在96孔板，替换(200μL/well)为添加有10％FBS的DMEM，将制备得到的各胶束溶液滴加在培养基中，而进行转染。作为mRNA量，以200ng/well进行给药。原样孵育24小时后，测定培养基中的发光强度。

<结果>

如图2表示，包含PEG-PGBA的胶束表现出比包含PEG-PLL的胶束更高的基因表达。这一事实表明，通过PEG-PGBA的柔软的聚缩水甘油基链提高了耐酶性，使mRNA向细胞内投递。另一方面，包含PEG-PGMA的胶束表现出与包含PEG-PGBA的胶束相同程度的基因表达效率，由此确认了侧链亚甲基数对于基因表达效率没有影响。

实施例4

使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyr的肝素中的耐聚阴离子性试验

该实施例中，通过肝素评价包含PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyr的高分子胶束对于聚阴离子的稳定性。

<材料和方法>

PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyr和荧光标记萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将包含PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyr溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

将肝素用10mM HEPES buffer(pH7.3)稀释，与胶束溶液以各种的S/P比而混合，在室温静置6小时。需要说明的是，此处所谓的S/P比是指通过下述式定义的量。

S/P比＝(溶液中的肝素的阴离子的总数)/(溶液中的核酸的磷酸基的总数)

将胶束溶液用10mM HEPES buffer(pH7.3)稀释，通过荧光相关光谱法测定荧光标记mRNA的扩散系数。

<结果>

如图3表示，包含PEG-PGBA的胶束表现出比包含PEG-PLL的胶束更高的耐聚阴离子性。这一事实表明，通过PEG-PGBA的柔软的聚缩水甘油基链而提高了耐聚阴离子性。另一方面，包含PEG-PGMA的胶束表现出与包含PEG-PGBA的胶束同样的扩散系数，由此确认了侧链亚甲基数对于耐聚阴离子性没有影响。

此外，如图4表示，包含PEG-PGLeu的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更高的耐聚阴离子性。这一事实表明，通过PEG-PGLeu的疏水性的异丁基而提高了耐聚阴离子性。此外，包含PEG-PGTry的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更高的耐聚阴离子性。这一事实表明，通过PEG-PGTry与mRNA中的嘌呤碱基的相互作用而提高了耐聚阴离子性。此外，包含PEG-PGTyr的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更高的耐聚阴离子性。这一事实表明，通过PEG-PGTry与mRNA中的嘧啶碱基的相互作用而提高了耐聚阴离子性。

实施例5

使用了PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA的活体内中的稳定性试验

该实施例中，通过小鼠血中的滞留性评价包含PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA的高分子胶束在活体内的稳定性。

<材料和方法>

PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

通过Balb/C小鼠的尾静脉，将包含40μg的mRNA的胶束溶液给药200μL。2.5、5、10分钟后，从尾静脉采集2μL的血液。从采集得到的血液中，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取mRNA，使提取得到的mRNA逆转录为cDNA后，通过qRT-PCR对cDNA进行定量评价。

<结果>

如图5表示，包含PEG-PGBA的胶束表现出比包含PEG-PLL的胶束更优异的血中滞留性。这一事实表明，通过PEG-PGBA的柔软的聚缩水甘油基链而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了活体中的稳定性。另一方面，包含PEG-PGMA的胶束表现出与包含PEG-PGBA的胶束相同程度的血中滞留性，由此确认了侧链亚甲基数对于血中滞留性没有影响。

实施例6

使用了PEG-PLL和PEG-PGLeu的水解试验

该实施例中，通过基于荧光胺法的聚合物内的伯胺定量而评价PEG-PLL和PEG-PGLeu在生理盐条件中的水解的时间依赖性。

<材料和方法>

将PEG-PLL和PEG-PGLeu溶解在PBS(pH7.4)中，在37℃静置1、3、6、24小时。然后，通过超滤除去水解脱离的L-亮氨酸，通过冷冻干燥而得到粉末状的聚合物。

将聚合物溶解在PBS中，添加溶解在PBS中的荧光胺，测定荧光强度。基于N-丁基胺而将荧光强度转换为伯胺数，设为聚合物内的伯胺数。

<结果>

如图6表示，PEG-PLL中伯胺数未发现变化，但是PEG-PGLeu中伯胺数减少。这一事实表明，PEG-PGLeu在生理条件中通过酯键的开裂而水解为安全的聚乙二醇-block-聚甘油(以下也称为PEG-PGlycerol)和L-亮氨酸。

实施例7

使用了PEG-PLL、PEG-PGLeu的对于培养细胞的毒性试验

该实施例中，通过聚合物添加后的细胞存活率而评价PEG-PLL和PEG-PGLeu对于培养细胞的毒性。

<材料和方法>

将PEG-PLL、PEG-PGLeu溶解在10mM HEPES buffer(pH7.3)中，制成聚合物溶液的稀释系列。

作为细胞的制备，将HEK293细胞以1.0×10⁴cells/well接种在96孔板，替换(200μL/well)为添加有10％FBS的DMEM，将各聚合物溶液滴加在培养基中。原样孵育24小时后，替换为添加有10％FBS的DMEM，通过Cell coun ting kit-8(CCK-8)法测定细胞存活数。将添加有10mM HEPES buffer代替聚合物溶液的设为100％，计算细胞存活率。

<结果>

如图7表示，确认到因PEG-PLL中高浓度的聚合物溶液的添加而使细胞存活率减少，但是未确认到因PEG-PGLeu中高浓度的聚合物溶液的添加而使细胞存活率减少。这一事实表明，PEG-PGLeu在培养基中水解为安全的PEG-PGlycerol和L-亮氨酸，通过使聚合物中正电荷的电荷密度减少而减少了细胞毒性。

实施例8

使用了PEG-PGBA、PEG-PLL的mRNA胶束的热力学稳定性的评价

该实施例中，通过等温滴定量热法(ITC)而评价包含PEG-PGBA、PEG-P LL的高分子胶束的热力学稳定性。

实验方法

在mRNA溶液(11μM,10mM HEPES buffer(pH7.3))中滴加PEG-PGBA或PEG-PLL溶液(110μM,10mM HEPES buffer(pH7.3))，通过iTC200(GE Healthcare)测定伴随PIC形成的反应热。此外，通过ORIGIN7软件解析得到的测定数据，而计算结合率、焓、熵、结合常数。

结果

如图8和表1表示，包含PEG-PGBA的胶束表现出比包含PEG-PLL的胶束更低的焓变和更高的熵变。这一事实表明，通过柔软的PGBA链而使与mRNA的接触面积增加并且使表面能量减少、和促进与mRNA的离子对形成并促进游离水的释放。其结果，使PEG-PGBA和mRNA的结合常数增大。

「表1]

表1 mRNA胶束的结合率和热力学参数。

实施例9

使用了PEG-PGTrp、PEG-PGTyr的与mRNA的相互作用的评价

该实施例中，通过测定荧光强度而评价包含PEG-PGTrp、PEG-PGTyr的高分子胶束中的聚合物与mRNA的相互作用。

实验方法

PEG-PGTrp、PEG-PGTyr和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-P GTrp、PEG-PGTyr溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。此外，PEG-PGTrp、PEG-PGTyr和Homo-poly(L-天冬氨酸)(Homo-PAsp,PAsp链的聚合度为80)形成的胶束，通过将PEG-PGTrp、PEG-PGTyr溶液和Homo-PAsp溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。此处，Homo-PAs p与PEG-PLL同样通过将正丁基胺设为引发剂的NCA聚合法而合成。

通过Nanodrop(Thermo Fisher Scientific,USA)测定聚合物和制备得到的胶束溶液的荧光强度(Ex/Em＝280/350nm)。将聚合物的荧光强度设为1而标准化得到的荧光强度。

结果

如图9和图10表示，通过向聚合物添加mRNA而使荧光强度减少。这一事实表明，聚合物中的色氨酸和酪氨酸与其他聚合物或mRNA中的碱基发生π-π相互作用。此外，通过添加不具有碱基的Homo-PAsp而使荧光强度增加。这一事实表明，聚合物中的色氨酸和酪氨酸与mRNA中的碱基发生π-π相互作用。

实施例10

使用了PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly的血清中的耐酶性试验

该实施例中，通过胎牛血清(FBS)评价包含PEG-PGTrp、PEG-PGTyr的高分子胶束对于分解酶的稳定性。

实验方法

PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

将FBS用10mM HEPES buffer(pH7.3)以成为50％的方式稀释，向其添加胶束溶液后，在37℃静置15分钟。然后，使用RNeasy Mini Kit(QIAGE N)从溶液提取mRNA。使提取得到的mRNA逆转录为互补DNA (cDNA)后，通过qRT-PCR对残存的cDNA进行定量评价。将未在FBS存在下进行37℃静置的情况的mRNA量设为100％，表示为相对值。

结果

如图11表示，包含PEG-PGLeu的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更优异的稳定性。这一事实表明，通过PEG-PGLeu的疏水性的异丁基而提高了耐酶性。此外，包含PEG-PGTrp和PEG-PGTyr的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更优异的稳定性。这一事实表明，通过色氨酸和酪氨酸与mRN A中碱基的π-π相互作用而提高了耐酶性。

实施例11

使用了PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly的向培养细胞的基因导入

该实施例中，通过萤光素酶mRNA评价包含PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly的高分子胶束向培养细胞导入基因的能力。

实验方法

PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

作为细胞的制备，将HuH-7细胞以1.0×10⁴cells/well接种在96孔板，替换(200μL/well)为添加有10％FBS的DMEM，将制备得到的各胶束溶液滴加在培养基中，而进行转染。作为mRNA量，以200ng/well进行给药。原样孵育24小时后，测定培养基中的发光强度。

结果

如图12表示，包含PEG-PGLeu的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更优异的基因表达效率。这一事实表明，通过PEG-PGLeu的疏水性的异丁基而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了培养条件中的稳定性。此外，包含P EG-PGTrp和PEG-PGTyr的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更优异的稳定性。这一事实表明，通过色氨酸和酪氨酸与mRNA中碱基的π-π相互作用而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了培养条件中的稳定性。

实施例12

使用了PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly的活体内的稳定性试验

该实施例中，通过小鼠血中的滞留性评价包含PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly的高分子胶束在活体内的稳定性。

实验方法

PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

通过Balb/C小鼠的尾静脉，将包含40μg的mRNA的胶束溶液给药200μL。2.5、5、10分钟后，从尾静脉采集2μL的血液。从采集得到的血液中，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取mRNA，使提取得到的mRNA逆转录为cDNA后，通过qRT-PCR对cDNA进行定量评价。

结果

如图13表示，包含PEG-PGLeu的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更优异的血中滞留性。这一事实表明，通过PEG-PGLeu的疏水性的异丁基而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了活体中的稳定性。此外，包含PEG-PGTrp和PEG-PGTyr的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更优异的血中滞留性。这一事实表明，通过色氨酸和酪氨酸与mRNA中碱基的π-π相互作用而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了活体中的稳定性。

实施例13

使用了PEG-PGBA、PEG-PLL的向活体内的基因导入

该实施例中，通过小鼠肺中的萤光素酶表现效率而评价包含PEG-PGBA、PEG-PLL的高分子胶束向活体内的基因导入的效率。

实验方法

PEG-PGBA、PEG-PLL和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-PGBA、PEG-PLL溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

通过Balb/C小鼠的气管，将包含67μg的mRNA的胶束溶液给药200μL。24小时后摘取肺。向摘取的肺中添加细胞溶解液(1x passive lysis buffer,Pro mega,USA)，通过MULTI-BEADS SHOCKER(安井器械株式会社)破碎后测定溶液中的发光强度。

结果

如图14表示，包含PEG-PGBA和PEG-PLL的胶束表现出比mRNA单体的给药组更优异的基因表达效率。这一事实表明，通过使高分子胶束内含mR NA而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了活体中的基因导入效率。此外，包含PEG-PGBA的胶束表现出比包含PEG-PLL的胶束更优异的基因表达效率。这一事实表明，通过PEG-PGBA的聚醚骨架而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了活体中的基因导入效率。

实施例14

使用了PEG-PGTrp、PEG-PGGly的向活体内的基因导入

该实施例中，通过小鼠肺中的萤光素酶表现效率而评价包含PEG-PGTrp、PEG-PGGly的高分子胶束向活体内的基因导入效率。

实验方法

PEG-PGTrp、PEG-PGGly和萤光素酶mRNA形成的胶束，通过将PEG-PGTrp、PEG-PGGly溶液和mRNA溶液以使得N/P比为3的方式混合而进行制备。

通过Balb/C小鼠的气管，将包含67μg的mRNA的胶束溶液给药200μL。24小时后摘取肺。向摘取的肺中添加细胞溶解液(1x passive lysis buffer,Pro mega,USA)，通过MULTI-BEADS SHOCKER(安井器械株式会社)破碎后测定溶液中的发光强度。

结果

如图15表示，包含PEG-PGTrp的胶束表现出比包含PEG-PGGly的胶束更优异的基因表达效率。这一事实表明，通过PEG-PGTrp的色氨酸与mRNA中碱基的π-π相互作用而提高了耐酶性和耐聚阴离子性，提高了活体中的基因导入效率。

实施例15

使用了PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly的水解试验

该实施例中，通过基于荧光胺法的聚合物内的伯胺定量而评价PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly在生理盐条件中的水解的时间依赖性。

实验方法

将PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly溶解在PBS(pH7.4)中，在37℃静置1、3、6、24小时。然后，通过超滤除去水解脱离的L-亮氨酸，通过冷冻干燥而得到粉末状的聚合物。

将聚合物溶解在PBS中，添加溶解在PBS中的荧光胺，测定荧光强度。基于N-丁基胺而将荧光强度转换为伯胺数，设为聚合物内的伯胺数。

结果

如图16表示，PEG-PLL中伯胺数未发现变化，但是PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly中伯胺数减少。这一事实表明，所述聚合物在生理条件中通过酯键的开裂而水解为安全的聚乙二醇-block-聚甘油和氨基酸单体。

实施例16

使用了PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly的对于培养细胞的毒性试验

该实施例中，通过聚合物添加后的细胞存活率而评价PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly对于培养细胞的毒性。

实验方法

将PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly溶解在10mM HEPES buffer(pH7.3)中，制成聚合物溶液的稀释系列。

作为细胞的制备，将HEK293细胞以1.0×10⁴cells/well接种在96孔板，替换(200μL/well)为添加有10％FBS的DMEM，将各聚合物溶液滴加在培养基中。原样孵育24小时后，替换为添加有10％FBS的DMEM，通过Cell coun ting kit-8(CCK-8)法测定细胞存活数。将添加有10mM HEPES buffer代替聚合物溶液的设为100％，计算细胞存活率。

结果

如图17表示，确认到因PEG-PLL中高浓度的聚合物溶液的添加而使细胞存活率减少，但是未确认到因PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly中高浓度的聚合物溶液的添加而使细胞存活率减少。这一事实表明，PEG-PGLeu、PEG-PGTrp、PEG-PGTyr、PEG-PGGly在培养基中水解为安全的PEG-PGlycerol和氨基酸单体，通过使聚合物中正电荷的电荷密度减少而减少了细胞毒性。