治疗微管蛋白羧肽酶相关的疾病的方法和药物组合物
阅读说明：本技术 治疗微管蛋白羧肽酶相关的疾病的方法和药物组合物 (Methods and pharmaceutical compositions for treating tubulin carboxypeptidase related diseases ) 是由 A·安德烈 M-J·穆丁 C·博世 C·艾劳德 L·佩里斯 P·德拉格朗热 于 2018-10-26 设计创作，主要内容包括：通过使用有效的独特的不可逆抑制剂的化学蛋白质组学,发明人发现主要脑微管蛋白羧肽酶(TCP)是血管抑制素-1(VASH1)与小血管抑制素结合蛋白(SVBP)的复合物。当与SVBP复合时,VASH1及其同源物血管抑制素2(VASH2)在微管上表现出稳健而特异的Tyr/Phe羧肽酶活性。因此,发明人首次鉴定了血管抑制素和血管抑制素/SVBP复合物的酶活性。敲减培养的神经元中的血管抑制素或SVBP导致酪氨酸化的α-微管蛋白水平显著降低,并出现严重的分化缺陷。此外,敲减血管抑制素破坏发育中的小鼠新皮层中的神经元迁移。这些结果将血管抑制素/SVBP复合物鉴定为TCP酶。因此,本发明涉及使用血管抑制素或血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的抑制剂来治疗微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病如神经疾患和心血管疾病的方法和药物组合物。(Through chemoproteomics using potent unique irreversible inhibitors, the inventors found that the major brain Tubulin Carboxypeptidase (TCP) is a complex of angiostatin-1 (VASH1) and small angiostatin binding protein (SVBP). When complexed with SVBP, VASH1 and its homolog angiostatin 2(VASH2) exhibit robust and specific Tyr/Phe carboxypeptidase activity on microtubules. Thus, the inventors have identified for the first time the enzymatic activities of angiostatin and the angiostatin/SVBP complex. Knockdown of angiostatin or SVBP in cultured neurons results in a significant reduction in tyrosinated α -tubulin levels and the appearance of severe differentiation defects. In addition, knockdown of angiostatin disrupts neuronal migration in the developing mouse neocortex. These results identified the angiostatin/SVBP complex as a TCP enzyme. Accordingly, the present invention relates to methods and pharmaceutical compositions for treating Tubulin Carboxypeptidase (TCP) -associated diseases, such as neurological disorders and cardiovascular diseases, using inhibitors of angiostatin or the activity or expression of the angiostatin/SVBP complex.)
技术领域
本发明涉及使用血管抑制素(Vasohibin)或血管抑制素/SVBP(小血管抑制素结合蛋白)复合物的活性或表达的抑制剂治疗微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病如神经疾患和心血管疾病的方法和药物组合物。
背景技术
微管是α/β微管蛋白二聚体的细胞骨架聚合物，主要参与细胞***、运动和形态发生。在微管蛋白的去酪氨酸化/酪氨酸化循环中，α-微管蛋白的C-末端酪氨酸被隐蔽的肽酶(TCP)除去，并由微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL，)重新添加参见综述((Barra等人(1988),MolNeurobiol,2:133)1)。这个循环是微管蛋白所独有的，在从脊索动物到哺乳动物的进化中大多是保守，并且在体内起着至关重要的作用((Erck等人(2005),Proc Natl Acad Sci US A,102:7853)2)。α-微管蛋白的微管蛋白去酪氨酸化/酪氨酸化是有丝***(Badin-Larcon等人(2004),Proc Natl Acad Sci U S A,101:5577；Barisic和Maiato(2016),Trends Cell Biol；Barisic等人(2015),Science,348:799)(Barisic和Maiato,2016；Barisic等人,2015)(3-5)(Gobrecht等人(2016),Journal of Neuroscience 36.14:3890-3902.；Konishi和etou(2009),Nat Neurosci,12:559；Marcos等人(2009),PloS one,4:e5405；Peris等人(2006),J Cell Biol,174:839-849)、神经元生理学(6-8)、以及肌肉机械转导(Kerr等人(2015),Nature communications,6:8526；Robison等人(2016),Science,352:aaf0659)(9,10)的重要调控信号。因此，异常的酪氨酸化水平与细胞转化和肿瘤侵袭性(Lafanechere等人(1998),J Cell Sci,111(Pt 2):171；Whipple等人(2007),Exp CellRes,313:1326)(11,12)、神经元紊乱(Erck等人(2005),Proc Natl Acad Sci USA,102:7853；Peris等人(2006),J Cell Biol,174:839；Peris等人(2009),J Cell Biol,185:1159)(2)、以及心力衰竭和心肌病(Robison等人(2016),Science,352:aaf0659)(10,13)相关。尽管去酪氨酸化反应在40年前首次描述(14)，但是TCP的鉴定仍然未知，因此仍然缺乏对该循环的全面了解。
因此，为了调节在病理状态下TCP酶的活性，需要鉴定该TCP酶的性质。
发明内容
本文中，发明人成功地将血管抑制素/SVBP复合物鉴定为TCP酶，并研究了其下调对神经元生理的影响。
因此，本发明涉及血管抑制素或血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的抑制剂，其用于在有此需要的受试者中治疗微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病，例如心血管和神经疾患的方法。
本发明还涉及用于筛选可用于治疗微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病的多种候选化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)测试每种候选化合物抑制血管抑制素或血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的能力，和(b)选择能够抑制所述血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的阳性候选化合物。
具体实施方式
α-微管蛋白的可逆的去酪氨酸化对微管动力学和功能至关重要，其缺陷参与癌症、脑紊乱和心肌病。然而，负责去酪氨酸化的微管蛋白酪氨酸羧肽酶(TCP)的鉴定仍然没有成功。本文中发明人使用化学蛋白质组学和一种独特的不可逆抑制剂，发现主要的脑TCP是血管抑制素-1(VASH1)与小血管抑制素结合蛋白(SVBP)的复合物。当与SVBP复合时，VASH1及其同源物血管抑制素-2(VASH2)在微管上表现出稳健而特异的Tyr/Phe羧肽酶活性。因此，发明人首先证明了血管抑制素和血管抑制素/SVBP复合物的酶活性。敲减培养的神经元中的血管抑制素或SVBP导致酪氨酸化的α-微管蛋白水平明显降低并发生严重的分化缺陷。此外，血管抑制素的敲减破坏发育中的小鼠新皮层中的神经元迁移。这些结果将血管抑制素/SVBP复合物鉴别为TCP酶。
因此，本发明涉及一种血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的抑制剂，在需要其的受试者中其用于治疗微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病的方法中。
如本文所用，术语“微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病”是指与微管蛋白的去酪氨酸化/酪氨酸化循环紊乱相关的一组疾病。涉及微管蛋白羧肽酶(TCP)的病理学例子包括神经疾患和心血管疾病。
TTL酶和受控量的酪氨酸化的微管蛋白对于神经元组织至关重要((Erck等人(2005),Proc Natl Acad Sci U S A,102:7853)。TTL的表达在人类老化的脑中((Loerch等人(2008),PloS one,3:e3329))以及阿尔茨海默氏病患者的脑中(未发表的数据)降低。已经表明，阿尔茨海默氏病动物模型中的这些缺陷与突触可塑性和认知能力受损同时发生(Andrieux实验室未发表的结果)。因此，应使用TCP抑制剂重建脑中酪氨酸化/去酪氨酸化微管蛋白的生理量，恢复认知能力或防止与疾病相关的认知能力的进一步下降(认知能力是指执行从最简单到最复杂的任何任务所需的技能：学习、记忆、解决问题、决策等)。
此外，最近的研究表明，降低微管去酪氨酸化促进神经再生(Gobrecht等人(2016),The Journal of neuroscience:the official journal of the Society forNeuroscience,36:3890)，并且受损的轴突中酪氨酸化的α-微管蛋白的增加是逆行损伤信号传递和轴突再生所必需的(Song等人,2015)。靶向微管动力学改变了疤痕组织形成的抑制性环境的组成，并使得更易于再生轴突。微管在轴突再生中具有双重功能。除了它们在支持轴突生长中的作用外，它们还为逆行信号回到细胞核提供了转运途径(Blanquie和Bradke,2018)。
因此，在一个具体的实施方案中，TCP相关的疾病包括神经疾患，例如神经退行性疾病。
本文所用的术语“神经疾患”定义为直接或间接影响受试者神经系统的正常功能或解剖的疾病、疾患或病症。
在本发明的上下文中，术语“神经退行性疾患”定义为中枢神经系统或周围神经系统的细胞受到影响或缺失的疾病。
特别优选的神经退行性疾患是阿尔茨海默氏病(AD)。有充分的文献记载，微管是阿尔茨海默氏病病理学的关键参与者(Matsuyama和Jarvik,1989；Dent,2016；Brandt andBakota,2017)。最近的结果表明，在阿尔茨海默氏病患者的脑中TTL表达下降(未发表的数据)，而去酪氨酸化的微管蛋白则增加(如以下实施例所示)。此外，在来自缺失了血管抑制素1或SVBP蛋白的转基因小鼠的原代神经元培养物中，β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性得到了预防(结果也显示在下面)。微管是三个细胞骨架成分之一，对于维持轴突完整性和形成轴突转运的轨道至关重要(Eira等人2016)。轴突转运缺陷是神经退行性疾病的直接原因。α-微管蛋白的可逆去酪氨酸化对于微管动力学和功能(例如轴突转运)至关重要，以及在树突棘；中枢神经系统中兴奋性神经元的突触后区室中至关重要(Dent，2016)。在一些神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症和tau病变，如渐进性核上性麻痹)中观察到微管动力学的改变(Baird和Benneth,2013；Dubey等人,2015；Cartelli和Cappelletti,2017)。最近的研究还表明，成人脑中MT的动力学在学习和记忆的主要过程中起作用，并且在退行性疾病中可能会受到损害(Dent等人，2016)。
在亨廷顿舞蹈病患者中，也有证据表明在神经元丧失之前存在突触和轴突功能障碍以及神经营养不良(Li和Conforti，2013)。
也已报道在体外或体内缺血(中风)模型中微管和/或微管蛋白被破坏(Ma等人,2010；Psilodimitrakopoulos等人,2013)。在多发性硬化症(MS)和相关模型(如实验性自身免疫性脑脊髓炎)中，已经表明在神经变性发生之前存在轴突转运改变(Van den Berg等人，2017)。与神经炎症相关的化学环境本身已经能够破坏与微管相关的轴突转运(Van denBerg等人，2017)。
优选地，神经疾患或神经退行性疾患选自多发性硬化症、中风、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏病。
神经疾患的其他例子还是外伤性脑损伤、脊髓损伤、颅内病变或椎内病变，包括但不限于脊髓挫伤、穿透、剪切、压迫或撕裂病变或鞭打摇晃婴儿综合症。
在一个优选的实施方案中，神经退行性疾患是阿尔茨海默氏病。
在另一个优选的实施方案中，神经疾患是中风。
本发明还涉及血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的抑制剂，其用作神经保护剂或神经营养剂。
微管中酪氨酸化/去酪氨酸化微管蛋白的控制还参与心肌细胞对肌节缩短和伸展的粘弹性阻力，因此参与心肌收缩性(Kerr等人(2015)Nature Comm.,6:8526；Robison等人(2016)Science,352:aaf0659；Chen等人(2018)Nature Med.,24:1225)。临床数据显示，在对照受试者和肥厚型心肌病患者中，心肌去酪氨酸化微管蛋白水平与左心室射血分数呈负相关(Robison等人(2016)Science,352:aaf0659)。因此，TCP抑制剂也可用于治疗肥厚型心肌病、缺血后心肌病、扩张型心肌病(Robison等人(2016)Science,352:aaf0659；Chen等人(2018)Nature Med.,24:1225)、肌营养不良症(dystrophinopathy)(Belanto等人(2016))。
在一个具体的实施方案中，TCP抑制剂用于治疗心力衰竭，特别是射血分数降低(缺血性、非缺血性)的心力衰竭和保留射血分数的心力衰竭(肥大型心肌病、糖尿病性心肌病)。
在一个具体的实施方案中，TCP相关的疾病是选自以下的心血管疾病：心肌梗塞、心肌梗塞诱发的心血管功能障碍、心力衰竭、心肌病和肌营养不良症。
在一个优选的实施方案中，心血管疾病是射血分数降低的心力衰竭(缺血性、非缺血性)。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得所需的药理和/或生理作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖在受试者中对疾病的任何治疗，包括：(a)延长生存时间；(b)降低由于该疾病导致的死亡风险；(c)在可能易患疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中防止该疾病的发生；(d)抑制疾病，即阻止其发展(例如，降低疾病进展速度)；和(e)缓解疾病，即引起疾病消退。
本文中可互换使用的术语“受试者”和“患者”是指哺乳动物，尤其是先前已被诊断出患有微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病(如心血管疾患和神经疾患)的人、或具有或发生微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病(如心血管疾患和神经疾患)的风险的人。通常，可以在脑活检后或通过使用神经影像程序(IRM，PetScan等)或与疾病相关的生物标记物对神经疾患(例如神经退行性疾病)进行诊断。
如本文所用，术语“血管抑制素”具有在本领域中的一般含义，并且由血管抑制素-1或血管抑制素-2蛋白组成。
如本文所用，术语“血管抑制素/SVBP复合物”具有在本领域中的一般含义。血管抑制素/SVBP复合物由血管抑制素-1或血管抑制素-2和SVBP(小血管抑制素结合蛋白)组成。
血管抑制素1由促血管生成的刺激性生长因子(例如VEGF)在内皮细胞中选择性诱导；它似乎是作为参与血管生成过程的活化内皮细胞的内在且高度特异性的反馈抑制剂发挥作用。VEGF以时间和浓度依赖性方式诱导血管抑制素1mRNA和蛋白质，而分泌的蛋白质拮抗VEGF的血管生成作用(Watanabe,K.等人(2004)J.Clin.Invest.114:898)。血管抑制素-2由不同的基因编码，产生最终编码9个同种型的13个剪接变体(Shibuya,T.等人(2006)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.26:1051,和NCBI RefSeq)，其是血管抑制素-1的同源物。血管抑制素和血管抑制素-2在人和小鼠之间的保守性均>95％。(有关血管抑制素蛋白和血管生成调节的综述，参见Sato Y J Biochem.2013Jan；153(1):5-11)。
如前所述，本发明的发明人首次鉴定了血管抑制素的酶活性。更具体地，他们证明了血管抑制素-1及其同源物血管抑制素-2(VASH2)具有非典型的Cys-His-Ser催化三联体，并且是转谷氨酰胺酶样半胱氨酸蛋白酶家族中未检测的成员。
SVBP是指小血管抑制素结合蛋白，其是由66个氨基酸组成的蛋白质。SVBP最初于2010年由一个东北大学的团队分离出来，被描述为血管抑制素1的分泌***蛋白，并有助于VASH1的抗血管生成活性(Suzuki Y等人，J Cell Sci 2010 123:3094-3101)。其他研究也将SVBP描述为VASH2蛋白的分泌***蛋白(Xue X.等人Oncogene.2013Mar 28；32(13):1724-34)。
因此，血管抑制素/SVBP复合物由血管抑制素-1或血管抑制素-2和SVBP(小血管抑制素结合蛋白)组成。
·血管抑制素活性的抑制剂
“血管抑制素活性的抑制剂”或“血管抑制素/SVBP复合物活性的抑制剂”在本领域中具有相同的一般含义，是指具有降低或抑制血管抑制素(或其复合物)或其成员之一的生物活性的能力的化合物(天然的或非天然的)。通常，所述化合物通过血管抑制素(或其复合物)抑制或减少微管蛋白的去酪氨酸化。例如，该化合物可以代替底物进入催化位点、或阻断血管抑制素(或其复合物)与微管蛋白/微管/微管相关蛋白(例如+Tips(加末端示踪蛋白))的相互作用、或可以与血管抑制素(或其复合物)结合使得血管抑制素不能结合微管蛋白/微管/微管相关蛋白(例如+Tips)、或者可以抑制血管抑制素/SVBP复合物的形成。通常，所述抑制剂是小的有机分子或生物分子(例如肽、脂质、抗体、适体)。
如本文所用，术语“+Tips”是指“加末端示踪蛋白”。加末端示踪蛋白是MAP(微管相关蛋白)蛋白，与生长中的微管尖端结合并在调节微管动力学中发挥重要作用。例如，已经观察到+TIP在有丝***过程中参与微管与染色体的相互作用。第一个被鉴定为+TIP的MAP是CLIP170(细胞质接头蛋白)，它已显示在微管解聚救援事件中起作用。+TIP的其他示例包括EB1、EB2、EB3、pl50Glued、Dynamitin、Lisl、CLIP115、CLASP1和CLASP2...)。
血管抑制素的“生物活性”或血管抑制素/SVBP复合物的“生物活性”(其是相同的)是指与微管蛋白的去酪氨酸化/酪氨酸化循环相关的α微管蛋白(单体、二聚体或聚合于微管中)的去酪氨酸化。
确定化合物为血管抑制素(或其复合物)活性的抑制剂的能力的测试是本领域技术人员众所周知的。本申请进一步提供了一种测试，其有利地允许筛选和选择血管抑制素和/或血管抑制素/SVBP复合物的候选抑制剂，即，TCP(参见下文)。在一个优选的实施方案中，抑制剂以足以抑制血管抑制素的生物活性的方式特异性结合血管抑制素(或其复合物)。与血管抑制素(或其复合物)的结合和对血管抑制素生物活性的抑制可以通过本领域众所周知的任何竞争性测定法来测定。例如，所述测定法可以包括测定被测试试剂作为血管抑制素活性抑制剂结合血管抑制素(或其复合物)的能力。结合能力由KD测量值反映。本文所用的术语“KD”是指解离常数，其获得自Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)，并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域众所周知的方法测定结合生物分子的KD值。在具体的实施方案中，“特异性结合血管抑制素(或其复合物)”的抑制剂意指以1μM或更小、100nM或更小、10nM或更小、或3nM或更小的KD结合人血管抑制素(或其复合物)多肽的抑制剂。然后可以进行竞争性测定法以确定该试剂抑制血管抑制素生物活性的能力。可以设想功能性测定法，以评估在细胞或体内诱导或抑制α微管蛋白去酪氨酸化的能力(参见实施例和图1)。
本领域技术人员可以容易地确定血管抑制素(或其复合物)活性抑制剂是否中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰血管抑制素的生物活性。为了检查血管抑制素活性的抑制剂是否以与最初鉴定的炔烃-epoY化合物相同的方式结合血管抑制素(或其复合物)和/或抑制细胞中α微管蛋白的去酪氨酸化，可以使用每种抑制剂进行检测。例如，如实施例部分(和在Arce等人(1978)J Neurochemistry(31)205-210,Argarana等人(1980)Journal ofNeurochemistry,34(1)114-118)中所述，使用[14C]酪氨酸化的紫杉醇稳定的微管或[14C]酪氨酸化的微管蛋白，通过放射性测试测量α微管蛋白的去酪氨酸化。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的活性抑制剂是抗体或其部分。
在该实施方案中，血管抑制素(或其复合物)的活性抑制剂是可以结合细胞中的血管抑制素(或其复合物)并阻断其生物活性的抗体(该术语包括抗体片段或部分)。
在优选的实施方案中，血管抑制素的活性抑制剂可以包含针对血管抑制素/SVBP复合物或血管抑制素的抗体，以使得所述抗体损害血管抑制素/活性(“中和抗体”)。
然后，对于本发明，如上所述选择具有以下能力的血管抑制素/SVBP复合物或血管抑制素的中和抗体：能够(i)与血管抑制素(或其复合物)结合和/或(ii)抑制通过血管抑制素(或其复合物)的α微管蛋白去酪氨酸化。
在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，该抗体是人源化抗体。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，该抗体是嵌合抗体。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的轻链。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的重链。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的Fab部分。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的F(ab')2部分。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的Fc部分。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的Fv部分。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的可变结构域。在本文描述的抗体或其部分的一个实施方案中，抗体的部分包含抗体的一个或多个CDR结构域。
如本文所用，“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体。具体地，“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，及其单价和二价片段。此外，“抗体”包括嵌合抗体、全合成抗体、单链抗体及其片段。抗体可以是人或非人抗体。可以通过重组方法将非人抗体人源化以降低其在人体中的免疫原性。
根据常规方法制备抗体。可以使用Kohler和Milstein(Nature,(1975)256:495)的方法产生单克隆抗体。为了制备可用于本发明的单克隆抗体，用血管抑制素(1或2)或SVBP的抗原形式以适当的间隔(例如，每周两次、每周一次、每月两次或每月一次)免疫小鼠或其他合适的宿主动物。可以在处死一周内对动物施用最后的“加强”抗原。通常希望在免疫过程中使用免疫佐剂。合适的免疫佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾、Ribi佐剂、Hunter's Titermax、皂苷佐剂例如QS21或Quil A、或含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其他合适的佐剂是本领域众所周知的。可以通过皮下、腹膜内、肌内、静脉内、鼻内或其他途径免疫动物。可以通过多种途径用多种形式的抗原免疫给定的动物。
简而言之，可以通过用重组细胞系(或多种其他表达系统，包括细菌、酵母或昆虫细胞)的表达来提供重组的血管抑制素/SVBP复合物(或其成员之一)。可以使用任何先前描述的方法来提供血管抑制素和/或SVBP的重组形式。免疫方案后，从动物的脾脏、***或其他器官中分离淋巴细胞，并使用如聚乙二醇的试剂将其与合适的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。融合后，将细胞置于培养基中，以允许通过使用标准方法(如Coding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice:Production and Application of MonoclonalAntibodies in Cell Biology,Biochemistry and Immunology,第3版,Academic Press,New York,1996中所述)使杂交瘤生长，而不是融合伴侣生长。培养杂交瘤后，分析细胞上清液中是否存在所需特异性的抗体，即选择性结合抗原的抗体。合适的分析技术包括ELISA、流式细胞仪、免疫沉淀和蛋白印迹。其他筛选技术是本领域众所周知的。优选的技术是确认抗体与构象完整、天然折叠的抗原结合的技术，例如非变性ELISA、流式细胞术和免疫沉淀。
显著地，如本领域中众所周知的，仅抗体分子的一小部分(即互补位)参与抗体与其表位的结合(一般地参见Clark,W.R.(1986)The Experimental Foundations of ModernImmunology Wiley&Sons,Inc.,New York；Roitt,I.(1991)Essential Immunology,第7版,Blackwell Scientific Publications,Oxford)。例如，Fc'和Fc区是互补级联的效应子，但不参与抗原结合。通过酶促切割了pFc'区的抗体，或产生的不含pFc'区的抗体(称为F(ab')2片段)保留了完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，通过酶促切割了Fc区的抗体，或产生的不含Fc区的抗体(称为Fab片段)保留了完整抗体分子的抗原结合位点之一。进一步地，Fab片段由共价结合的抗体轻链和称为Fd的抗体重链的一部分组成。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单个Fd片段可以与多达十个不同的轻链结合，而不改变抗体特异性)，并且Fd片段在分离时保留了表位结合能力。
如本领域所公知的，在抗体的抗原结合部分中，存在与抗原的表位直接相互作用的互补决定区(CDR)和保持互补位三级结构的构架区(FR)(一般地参见Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，都存在四个框架区(FR1至FR4)，分别被三个互补决定区(CDR1至CDRS)隔开。CDR，特别是CDR区，更特别是重链CDR，在很大程度上负责抗体的特异性。
现在在本领域中已经公认，哺乳动物抗体的非CDR区可以被同种特异性或异种特异性抗体的相似区域代替，同时保留原始抗体的表位特异性。这在“人源化”抗体的开发和使用中最明显地体现出来，其中非人CDR与人FR和/或Fc/pFc'区共价连接以产生功能性抗体。
由于血管抑制素(或其复合物)是细胞内靶标，因此作为活性抑制剂的本发明的抗体可以是没有Fc片段的抗体片段。
因此，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，本发明还提供F(ab')2Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗体，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已被同源的人或非人序列取代；嵌合F(ab')2片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已被同源的人或非人序列取代；嵌合Fab片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已被同源的人或非人序列取代；和嵌合Fd片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2区已被同源的人或非人序列取代。本发明还包括所谓的单链抗体。
各种抗体分子和片段可以源自任何通常已知的免疫球蛋白类别，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgE、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体是单结构域抗体。术语“单结构域抗体”(sdAb)或“VHH”是指可以在骆驼科哺乳动物中发现的抗体类型的单重链可变结构域，其天然地缺乏轻链。这种VHH也被称为
以下公开了或可获得中和性人血管抑制素(或其复合物或其成员之一)抗体的实例
·VASH 1，在Saito M等人The Journal of Biochemistry,160(4),2016年10月,第227–232页)；(Watanabe,K.等人(2004).J.Clin.Invest.114,898907)和Anti-Vasohibin1/VASH1 Antibody(C-Terminus)IHC-plusTM LS-B9515(Lifespan Bioscience)中；
·VASH2，在Koyanagi T.等人Cancer Sci.2017 Mar；108(3):512-519)；US9701744,和Anti-VASH2 Therapeutic Antibody(1760)TAB-248CQ(creative biolab),Anti-VASH2(H00079805-H01)Novus bio.中；
·SVBP，在Anti-SVBP antibody(HPA008507SIGMA)中。
·血管抑制素(或其复合物)表达的抑制剂
“血管抑制素表达的抑制剂”或“血管抑制素/SVBP复合物表达的抑制剂”是指天然或合成的化合物，其具有抑制或显著降低编码至少一种血管抑制素(或其复合物)的不同成员的至少一个基因的表达的生物学作用。
在一个具体的实施方案中，血管抑制素表达的抑制剂选自血管抑制素1或血管抑制素2表达的抑制剂。
在一个特定的实施方案中，血管抑制素/SVBP复合物表达的抑制剂选自血管抑制素1、血管抑制素2或SVBP表达的抑制剂。
表1：血管抑制素/SVBP复合物成员
如实施例部分所示(图3和图5)，在体外/体内研究中使用抑制血管抑制素l或血管抑制素2或SVBP表达的抑制剂明显增加了神经元的神经突和分支数量(图3)并改变了轴突分化的延迟(图5)。
在优选的实施方案中，血管抑制素/SVBP复合物表达的抑制剂是血管抑制素1和/或血管抑制素2表达的抑制剂。
用于本发明的表达抑制剂可以基于反义寡核苷酸构建体。反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，将通过与血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的至少一个)mRNA结合直接阻断其翻译，从而阻止蛋白质翻译或增加mRNA的降解，由此降低血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的至少一个)的水平，从而降低细胞中的活性。例如，可以例如通过常规的磷酸二酯技术合成至少约15个碱基并与编码血管抑制素/SVBP复合物(或其成员之一)的mRNA转录序列的独特区域互补的反义寡核苷酸，并通过例如静脉内注射或输注施用。使用反义技术特异性抑制其序列已知的基因的基因表达的方法是本领域众所周知的(例如，参见美国专利号6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321和5,981,732)。
小抑制性RNA(siRNA)也可以作为表达抑制剂发挥作用，以用于本发明。可通过使受试者或细胞与小的双链RNA(dsRNA)、或生成小的双链RNA的载体或构建体接触来降低血管抑制素(或其复合物)基因的表达，从而使血管抑制素/SVBP复合物基因表达被特异性抑制(即，RNA干扰或RNAi)。对于序列已知的基因，选择合适的dsRNA或dsRNA编码载体的方法是本领域众所周知的(例如，参见Tuschl,T.等人(1999)；Elbashir,S.M.等人(2001)；Hannon,GJ.(2002)；McManus,MT.等人(2002)；Brummelkamp,TR.等人(2002)；美国专利号6,573,099和6,506,559；和国际专利公开号WO 01/36646,WO 99/32619和WO 01/68836)。本发明的siRNA的全部或部分磷酸二酯键有利地被保护。通常使用本领域已知的方法通过化学途径来实现这种保护。例如，可以通过巯基或胺官能团或苯基保护磷酸二酯键。本发明的siRNA的5'-和/或3'-末端也有利地被保护，例如使用上述保护磷酸二酯键的技术。siRNA序列有利地包含至少十二个连续的二核苷酸或其衍生物。
如本文所用，在本发明的核酸序列方面，术语“siRNA衍生物”是指与血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的至少一个)或其片段具有至少90％同一性百分比的核酸，优选至少95％、例如至少98％、更优选至少98％的同一性百分比。
如本文所用，两个核酸序列之间的“同一性百分比”是指在待比较的两个序列之间相同核酸的百分比，该同一性百分比通过所述序列的最佳比对获得，并且该百分比纯粹是统计学上的，并且这两个序列之间的差异是在核酸序列上随机分布的。如本文所用，“最佳比对”或“最优比对”是指所确定的同一性百分比(见下文)是最高的比对。通常通过比较事先已经根据最佳比对比对的两个核酸序列来实现这两个核酸序列之间的序列比较；该比较是在比较区段上实现的，以鉴定和比较局部区域的相似性。除了手动方式外，还可以通过使用SMITH和WATERMAN(Ad.App.Math.,第2卷，第482页,1981)开发的全局同源性算法、使用NEDDLEMAN和WUNSCH(J.Mol.Biol.,第48卷，第443页,1970)开发的局部同源性算法、使用PEARSON和LIPMAN(Proc.Natl.Acd.Sci.USA,第85卷,第2444页,1988)开发的相似性方法、使用这些算法的计算机软件(威斯康星州遗传学软件包中的GAP,BESTFIT,BLAST P,BLASTN,FASTA,TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI USA)、通过使用MUSCLE多重比对算法(Edgar,Robert C.,Nucleic Acids Research,第32卷,第1792页,2004)实现进行比较的最佳序列比对。为了获得最佳的局部比对，优选使用BLAST软件。通过比较最佳比对的这两个序列来确定两个核酸序列之间的同一性百分比，为了获得这两个序列之间的最优比对，核酸序列相对于参考序列能够包含添加或缺失。通过以下计算同一性百分比：确定这两个序列之间相同位置的数目、然后将该数目除以比较位置的总数、然后将所得结果乘以100，得出这两个序列之间的同一性百分比。
shRNA(短发夹RNA)也可以作为表达抑制剂发挥作用，以用于本发明。
核酶也可以作为表达抑制剂发挥作用，以用于本发明。核酶是能够催化RNA特异性切割的酶促RNA分子。核酶作用的机制包括核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，然后进行核酸内切裂解。因此，在本发明的范围内工程化的发夹或锤头状基序核酶分子是有用的，其特异地且有效地催化血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的至少一个)mRNA序列的内切核酸裂解。首先通过扫描靶分子的核酶切割位点来鉴定任何潜在RNA靶标中的特定核酶切割位点，其通常包括以下序列：GUA、GUU和GUC。一旦鉴定出来，就可以评估对应于含有切割位点的靶基因区域的约15至20个核糖核苷酸之间的短RNA序列，以预测使寡核苷酸序列不适合的结构特征，例如二级结构。
可用作表达抑制剂的反义寡核苷酸和核酶均可通过已知方法制备。这些方法包括用于化学合成的技术，例如通过固相亚磷酰胺化学合成。或者，可以通过体外或体内转录编码RNA分子的DNA序列来产生反义RNA分子。可以将此类DNA序列掺入多种载体中，这些载体掺入了合适的RNA聚合酶启动子，例如T7或SP6聚合酶启动子。可以引入对本发明寡核苷酸的各种修饰，作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于向分子的5'和/或3'末端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列，或在寡核苷酸骨架内使用硫代磷酸酯或2'-O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
本发明的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA和核酶可单独或与载体结合在体内递送。在最广泛的意义上，“载体”是能够促进反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸向细胞递送的任何载体，优选向表达血管抑制素/SVBP复合物的细胞递送的任何载体。优选地，相对于不存在载体时所导致的降解程度，载体以降低的降解将核酸递送至细胞。通常，可用于本发明的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病毒、衍生自病毒或细菌来源的其他载体，这些载体已经通过***或掺入反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列而***纵。病毒载体是优选的载体类型，包括但不限于以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；腺病毒，腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；EB病毒；***瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒，例如逆转录病毒。人们可以容易地使用未指明但本领域已知的其他载体。
优选的病毒载体是基于非细胞病变的真核病毒，其中非必需基因已被感兴趣基因替代。非细胞病变的病毒包括逆转录病毒(例如慢病毒)，其生命周期包括将基因组病毒RNA逆转录成DNA，随后将原病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒已被批准用于人基因治疗试验。最有用的是那些复制缺陷的逆转录病毒(即，能够指导所需蛋白质的合成，但是不能制造感染性颗粒)。这样的遗传改变的逆转录病毒表达载体对于体内基因的高效转导具有一般的实用性。产生复制缺陷的逆转录病毒的标准方案(包括将外源遗传物质掺入质粒中、用质粒转染包装细胞系、通过包装细胞系生产重组的逆转录病毒、从组织培养基中收集病毒颗粒、和用病毒颗粒感染靶细胞的步骤)在Kriegler,1990和在Murry,1991中提供了。
对于某些应用而言，优选的病毒是腺病毒和腺相关病毒(AAV)，它们是已经被批准用于人基因治疗的双链DNA病毒。实际上已知12种不同的AAV血清型(AAV1至12)，每种具有不同的组织嗜性(Wu,Z Mol Ther 2006；14:316-27)。重组AAV衍生自依赖性细小病毒AAV2(Choi,VW J Virol 2005；79:6801-07)。可以将腺相关病毒1至12型工程化为复制缺陷的，并且能够感染多种细胞类型和物种(Wu,Z Mol Ther 2006；14:316-27)。它还具有以下优点：例如热和脂质溶剂稳定性；在多种谱系细胞(包括造血细胞)中的高转导频率；缺乏超感染抑制作用，因此允许多个系列的转导。据报道，腺相关病毒可以以位点特异性方式整合到人细胞DNA中，从而使***诱变的可能性和逆转录病毒感染特有的***基因表达的变异性最小。另外，在没有选择压力的情况下，在组织培养中对野生型腺相关病毒感染进行了100次以上传代，表明腺相关病毒基因组整合是一个相对稳定的事件。腺相关病毒也可以染色体外的方式发挥作用。
其他载体包括质粒载体。质粒载体已在本领域中广泛描述，并且是本领域技术人员众所周知的。参见例如Sambrook等人，1989。在最近几年中，质粒载体已被用作DNA疫苗，用于将抗原编码基因在体内传递给细胞。它们对此特别有优势，原因是其并不像许多病毒载体那样具有安全性的问题。然而，这些具有与宿主细胞相容的启动子的质粒可以表达来自质粒内可操作编码的基因的肽。一些常用的质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40和pBlueScript。其他质粒是本领域普通技术人员众所周知的。另外，可以使用限制性酶和连接反应来定制设计质粒，以去除和添加DNA的特定片段。质粒可以通过多种肠胃外、粘膜和局部途径递送。例如，可以通过肌内、皮内、皮下或其他途径注射DNA质粒。也可以通过鼻内喷雾剂或滴剂、直肠栓剂和口服施用质粒。也可以使用基因枪将质粒施用到表皮或粘膜表面。可以在水性溶液中给予质粒、将其干燥到金颗粒上、或者与另一种DNA递送系统结合，包括但不限于脂质体、树状聚合物、螺旋形物和微囊化。
在一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列在异源调节区(例如异源启动子)的控制下。该启动子可以是对单核细胞或巨噬细胞特异的。
以下公开了或可获得人和小鼠血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的一个)的表达抑制剂(siRNA)的示例：
·血管抑制素1：在Kitajima T.等人Anticancer Research October 2014vol.34(10)第5321-5329页；Miyashita H等人(2012).PLoS ONE 7(10):e46459；Watatani H等人Physiol Rep.2014June；2(6):e12054.Vasohibin-1Gene Silencers siRNA(h)，sc-61776，(SantaCruz Biotechnology)；SMARTpool:Accell VASH1 siRNA(Darmacon)；InvitrogenStealth mouse siRNA MSS280250，MSS280251，和MSS280252中；
·血管抑制素2：在Tu，M.等人(2016).(Cancer Letters；383(2)，28 Dec.；p.272-281)；Koyanagi T.等人(Cancer Science 104(12)Dec.2013 p.1705-1710)；Suenaga K.等人(PLoS One.2014；9(9):e104728)；Invitrogen Stealth mouse siRNA MSS213191，MSS280251，和MSS280252中；
·SVBP，在Suzuki Y等人(J Cell Sci 2010123:3094-3101)中。
在实施例部分中使用的小鼠血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的一个)的表达抑制剂(shRNA)的示例是
血管抑制素-1：CCGAGACATGCGGCTCAAGATTGGCAAGG(SEQ ID N°1)
血管抑制素-2：AGACAAATCGCCTGCTCTGACCGAGAAGA(SEQ ID N°2)；
·SVBP:AGAGTGGAGAAGGCTAAGCAGAAATCTGC(SEQ ID N°3)
药物组合物
血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的抑制剂可以与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释放基质(例如可生物降解的聚合物)组合以形成治疗组合物。
在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部或直肠施用的本发明的药物组合物中，活性成分可以单独或与另一种活性成分组合以单位施用形式作为与常规药物载体的混合物施用于动物和人。合适的单位施用形式包括口服途径形式(例如片剂、凝胶胶囊、粉剂、颗粒剂和口服混悬剂或溶液)、舌下和颊施用形式、气雾剂、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式以及直肠施用形式。
优选地，药物组合物包含对于能够被注射的制剂而言是药学上可接受的载体。这些药学上可接受的载体特别可以是等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物)，或干燥的，尤其是冷冻干燥的组合物，根据情况，可添加无菌水或生理盐水，以构建注射液。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散液；制剂包括芝麻油、花生油或丙二醇水性溶液；以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有一定程度的流动性，以至于存在容易的可注射性。其在生产和储存条件下必须是稳定的，并且针对微生物(如细菌和真菌)的污染必须是防腐的。
包含作为游离碱或药理学上可接受盐的本发明化合物的溶液可以在水中适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合而制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
可以将本发明的血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的抑制剂配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、等等)形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
载体也可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以例如通过使用如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。
通过将所需量的活性多肽掺入适当的溶剂中来制备无菌注射溶液，根据需要，所述溶剂中具有以上列举的几种其他成分，然后过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体包含基础分散介质和以上列举的成分中所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从之前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉剂。
在配制后，以与剂量配方相容的方式和治疗有效的量来施用溶液。该制剂易于以各种剂型施用，例如上述注射溶液的类型，但也可以采用药物释放胶囊等。
例如，对于水性溶液的肠胃外施用，如果需要，溶液应该适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在该方面，根据本公开，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，然后添加到1000ml皮下输液液体中或在建议的输注部位注射。根据被治疗受试者的病症，将必然地进行一些剂量的变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体受试者的适当剂量。
可以将本发明的血管抑制素/SVBP复合物活性或表达的抑制剂配制在治疗混合物中，以使每个剂量包含约0.0001至1.0毫克、或约0.001至0.1毫克、或约0.1至1.0或甚至约10毫克。也可以施用多个剂量。
除了将本发明的化合物配制成用于肠胃外施用(例如静脉内或肌内注射)外，也可以使用其他药学上可接受的形式包括，例如，用于口服施用的片剂或其他固体；脂质体制剂；定时释放胶囊以及当前使用的任何其他形式。
·筛选方法
本发明进一步涉及筛选候选血管抑制素/SVBP复合物抑制剂(也称为“TCP-抑制剂”)的方法。根据本发明的方法包括以下步骤：
(i)将候选化合物与血管抑制素/SVBP(TCP)和序列生物素基-V-D-S-V-E-G-E-G-E-E-E-D-E-E-Y(SEQ ID NO:13)的生物素化肽一起孵育；
(ii)通过质谱定量在步骤(i)结束时获得的混合物中存在的生物素化肽生物素基-V-D-S-V-E-G-E-G-E-E-E-D-E-E-Y(SEQ ID NO:13)和/或生物素化肽生物素基-V-D-S-V-E-G-E-G-E-E-E-D-E-E(SEQ ID NO:12)；和
(iii)根据步骤(ii)获得的结果确定候选化合物是否为TCP抑制剂。
SEQ ID NO：13的肽是TCP的底物，是与TTL反应的产物。因此，当候选化合物是TCP抑制剂时，在步骤(ii)中定量的该肽的量与在步骤(i)中最初孵育的肽的量基本相同。
SEQ ID NO：12的肽是TTL的底物，是与TCP反应的产物。因此，当候选化合物不是TCP抑制剂时，在步骤(i)期间该肽的量增加。
本方法允许快速、准确地检测TCP抑制剂(参见下面实施例7中给出的结果)。所要求保护的方法允许确定测试化合物的抑制特性；通常，本方法允许确定抑制剂的半数最大抑制浓度(IC50)。
上述筛选方法可进一步包括预孵育步骤，其中将TCP和测试化合物预孵育，然后使其与SEQ ID NO：13的肽接触。
孵育步骤在允许TCP活性的条件下进行。通常，孵育步骤在15℃至25℃之间的温度下进行。通常，孵育步骤在室温下进行。
在足以允许TCP活性的时间段内进行孵育步骤。通常，所述时间段为5至60分钟，更特别地为10至30分钟。
通过使用质谱(MS)进行定量步骤。通常，质谱仪是
在另一个实施方案中，筛选方法在步骤(i)和(ii)之间包括纯化步骤，其中分离SEQ ID NO：12或13的生物素化肽，以便在步骤(iii)中进行定量。
该纯化可以通过技术人员已知的任何用于分离生物素化肽的方法进行。特别地，可以通过使用允许特异性结合生物素的任何手段来进行纯化步骤。例如，可以使用包含链霉亲和素或抗生物素蛋白的任何装置。典型地，可以通过使用C型药筒、使用在电喷雾负离子模式下运行的质谱仪来进行所述纯化步骤。
本发明还涉及用于筛选可用于治疗微管蛋白羧肽酶(TCP)相关的疾病的多种候选化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)测试每种候选化合物抑制血管抑制素/SVBP复合物或血管抑制素活性或表达的能力，和(b)选择能够抑制所述血管抑制素/SVBP复合物或血管抑制素活性或表达的阳性候选化合物。
通常，候选化合物选自有机小分子、肽、多肽或寡核苷酸。其他潜在的候选化合物包括反义分子、siRNA、shRNA、sgRNA或核酶。
测试候选化合物是否可以抑制血管抑制素/SVBP复合物的活性或表达可以使用本领域已知的报告分子测定法或常规地对其进行修饰的报告分子测定法来确定。
例如，该方法可以包括使表达血管抑制素(或其复合物)的细胞与候选化合物接触、测量血管抑制素(或其复合物)介导的转录(例如，包含血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的至少一个)结合位点的启动子的活化)、和比较细胞反应与标准细胞反应。通常，在不存在候选化合物的情况下测量标准细胞反应。与标准相比，细胞反应降低表明该候选化合物是血管抑制素/SVBP复合物表达(或其成员中的至少一个)的抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定与血管抑制素/SVBP复合物(或其成员中的一个)特异性结合的配体的方法。例如，可以从表达结合血管抑制素(或其复合物)的分子的细胞制备细胞区室，例如细胞膜或其制备物。将该制备物与标记的血管抑制素/SVBP复合物或标记的血管抑制素孵育，并根据本领域已知的常规方法分离并表征与血管抑制素(或其复合物)结合的配体的复合物。或者，可以使与多肽相互作用的血管抑制素(或其复合物)与固体支持物结合，从而使细胞溶解的结合分子与柱结合，然后根据常规方法洗脱和表征。在另一个实施方案中，可以从表达结合血管抑制素(或其复合物)的分子的细胞制备细胞区室(例如细胞膜或其制备物)，所述结合血管抑制素(或其复合物)的分子例如是由血管抑制素(或其复合物)调节的信号传导或调节通路的分子，例如微管蛋白的去酪氨酸化。在不存在或存在候选化合物的情况下，使制备物与标记的血管抑制素(或其复合物)孵育。候选化合物与结合分子结合的能力反映在标记的配体的结合减少。无偿地结合(即不诱导血管抑制素/SVBP复合物或血管抑制素对血管抑制素/SVBP复合物或血管抑制素结合分子结合作用的效果)的分子，最有可能是血管抑制素/SVBP复合物或血管抑制素活性的良好抑制剂。
另一种方法包括通过确定例如表达血管抑制素(或其复合物)的细胞中来自含有血管抑制素/(或其复合物)结合位点的启动子的转录量来筛选抑制血管抑制素活性的化合物。这种方法可包括用编码血管抑制素(或其复合物)的DNA转染真核细胞，使该细胞表达血管抑制素(或其复合物)；使该细胞与候选化合物接触；和确定来自含有血管抑制素(或其复合物)结合位点的启动子的转录量。可以在这种方法中使用与含有血管抑制素(或其复合物)结合位点的启动子连接的报告基因(例如GFP)，在这种情况下，可以通过测定报道基因产物水平、或者在报告基因是酶的情况下测定报告基因产物的活性水平，来测量报告基因的转录量。与不表达血管抑制素(或其复合物)的细胞相比，表达血管抑制素(或其复合物)的细胞中来自含有血管抑制素(或其复合物)结合位点的启动子的转录量减少，将表明该候选化合物是血管抑制素活性的抑制剂。
另一方法包括通过测定α微管蛋白的去酪氨酸化水平来筛选抑制血管抑制素生物活性的化合物，例如，使用[14C]-酪氨酸化的紫杉醇稳定的微管进行放射性测试、如上所述和在实施例部分中描述的酶活性(TCP活性测定法)。
因此，可以对结合测试所选择的阳性候选化合物进行进一步的选择步骤，就进一步测定候选化合物对α微管蛋白去酪氨酸化的抑制特性，采用TCP活性测定法。
已经选择的阳性候选化合物也可以进行进一步的选择步骤，就进一步测定其对神经元的特性进行，所述神经元分离自患有神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病)的受试者、或分离自暴露于神经毒素β-淀粉样蛋白肽的神经元细胞系。例如，可以进一步选择已经用上述筛选方法选择的阳性候选化合物抑制阿尔茨海默氏病患者神经元或暴露于神经毒素β-淀粉样蛋白肽的神经元细胞系树突棘减少的能力。通常，筛选方法可以进一步包括以下步骤：i)使来自患有阿尔茨海默氏病患者的神经元或暴露于神经毒素β-淀粉样蛋白肽的神经元细胞系与选择的阳性候选化合物接触；ii)确定所述神经元的树突棘的密度；和iii)比较步骤ii)中确定的密度与在没有选择的阳性候选化合物的情况下进行步骤i)时确定的密度。可以通过将一定量的待测候选化合物添加至神经元的培养基中来进行如上所述的步骤i)。通常，制备多个培养样品，使得在不同的培养样品中添加递增量的待测候选化合物。通常，还制备至少一种不含候选化合物的培养样品，作为进一步比较的阴性对照。
最后，已经选择的阳性候选化合物可以进行进一步的选择步骤，进一步测定其在阿尔茨海默氏病的动物模型上的特性(关于阿尔茨海默氏病动物模型的综述，参见Sasaguri H.等人(2017)EMBO J.；36(17):2473-2487；或J等人(2008)NatureReviews Neuroscience 9,532-544；ort Laurijssens B.等人(2013)Drug DiscoveryToday:Technologies Volume 10,Issue 3,,Pages e319-e327)。通常，可以将选择的阳性候选化合物施用于动物模型、确定阿尔茨海默氏病的进展、和与未施用候选化合物的动物模型中阿尔茨海默氏病的进展进行比较。
通过以下附图和实施例将进一步说明本发明。但是，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1.小鼠脑TCP的纯化和鉴定。(A)来自小鼠脑的指定TCP富集部分(部分I至IV)(1μg蛋白质)的SDS-PAGE(银染色)。进行硫酸铵沉淀步骤，然后进行两个连续的离子交换柱阶段。(B)部分IV对抑制剂敏感。TPCK(甲苯磺酰基苯丙氨酰氯甲基酮)、TLCK(甲苯磺酰基-L-赖氨酰氯甲基酮)：含有Phe或Lys残基的商业丝氨酸/半胱氨酸抑制剂。部分IV显示出对TPCK的敏感性比对TLCK的敏感性高100倍的活性，这与对芳族残基的高亲和力一致。欧苷菊(Parthenolide)是一种细胞去酪氨酸化抑制剂，含有环氧亲电部分。E-64是CA族半胱氨酸蛋白酶的天然产物抑制剂，含有环氧亲电部分。EpoY、epoEY和epoEEY是设计的抑制剂，含有来自E-64的环氧化物分别与Y、EY或EEY氨基酸偶联。炔烃-epoY是epoY的可点击版本(clickable version)。结果表示为在具有DMSO的对照中酶活性的百分比(放射性测定法)(平均值+/-SD，n＝3-6)。(C)炔烃-epoY的结构。(D)使用Cu催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(点击反应)的TCP鉴定的最后步骤的示意图。(E)使用炔烃-epoY(非可点击的epoY用作对照)通过TAMRA探针标记来自部分IV的推定TCP。(F)小鼠血管抑制素-1和血管抑制素-2的示意图(69％的整体序列同源性；核心结构域为77％(透明蓝色框))。这些推定的转谷氨酰胺酶样半胱氨酸肽酶包含非典型的催化残基三联体(Cys，His，Ser)。
图2.与SVBP结合的血管抑制素是有效的微管蛋白酪氨酸羧肽酶。(A)在不存在或存在外源SVBP共表达的情况下，来自表达每种VASH(VI，V2)或其死亡形式的HEK293T细胞的内源微管蛋白的免疫印迹。酪氨酸化和去酪氨酸化微管蛋白特异的抗体被用于评估去酪氨酸化。针对α-微管蛋白、His和Flag的抗体分别显示出微管蛋白、血管抑制素和SVBP的量。未转染的细胞(-)显示微管蛋白修饰的内源水平。((B)来自表达mCherry-αlB-微管蛋白、每种VASH和SVBP的HEK293T细胞的蛋白提取物的免疫印迹。使用分别以EEY或EEA结束的αlB-微管蛋白的天然或突变形式。如(A)中所示测量去酪氨酸化/酪氨酸化微管蛋白的水平。mCherry抗体展示相同量的外源α-微管蛋白。(C)使用放射性标记的微管(6-8μM)评估纯化的VASH/SVBP复合物的去酪氨酸化活性，n＝3。活性和催化死亡形式的血管抑制素与SVBP在HEK293T细胞中共表达，并在钴树脂上纯化(图6A)。纯化的GFP-His构建体用作对照。理论上最大的酪氨酸释放由100％线表示。(D)通过免疫印迹评估纯化的VASH1/SVBP复合物(20或40nM)对脑微管或微管蛋白二聚体(5μM)的去酪氨酸化活性。用VASH2/SVBP复合物进行类似实验(图6B)。我们控制微管蛋白为二聚体或组装形式(图6C)，并且存在相同量的酶促复合物(图6D)。(E)纯化的VASH/SVBP复合物(600nM)对脑微管或重组GFP-EB1(5μM)的去酪氨酸化活性。羧肽酶A(CPA)用作阳性对照。针对酪氨酸化和去酪氨酸化EB1的抗体在(15)中进行了表征。
图3.VASH1和VASH2的下调影响神经元分化。(A)在脑组织和海马神经元中发现了Vash1、Vash2和Svbp转录本。使用50ng纯化的mRNA对所有指定的组织和细胞进行了45个循环的RT-PCR反应，但针对GAPDH仅进行了25个循环。(B)蛋白印迹分析VASH1和VASH2(shV1+shV2)或SVBP(shSVBP)下调对神经元中去酪氨酸化微管蛋白水平的作用。通过电穿孔用与turboGFP(tGFP)cDNA结合的shRNA转染神经元，之后即刻铺板，并在2DIV进行分析(结果来自三个独立神经元培养物的三次免疫印迹)。(C-E)血管抑制素下调对神经突生长和轴突分化的作用。如在B中所述转染神经元，并在2DIV和3DIV通过免疫染色进行分析。(C)在2DIV和3DIV从3至4个不同培养物的免疫荧光图像上手动计数III期神经元(带有轴突)。(D)使用AutoNeuriteJ macro对C中生成的免疫荧光影像的至少85个神经元(在2DIV)进行形态计量学分析(有关详细信息，参见方法部分)。*，P<0.05；***，P<0.0005，****，P<0.0001(t或MannWhitney检验)。
图4.血管抑制素的下调影响新生皮层神经元的径向迁移。(A)定量分析显示GFP阳性神经元在整个皮层中的分布，将皮层分为六个相等的区域。每个条件从5个脑获得数据，平均值±SEM。ns，无显著性，***p<0.001，****<0.0001(Mann Whitney检验)。(B)
图5.SVBP的下调改变神经元分化。(A)验证VASH1、VASH2和SVBP shRNA。用允许蛋白质和相应的shRNA或对照shRNA表达的质粒共转染HEK293T细胞。通过Western印迹分析粗蛋白提取物，其中分别用抗GFP和抗Flag检测VASH1/2或SVBP的存在，并用抗turboGFP检测shRNA的存在；(B-C)SVBP下调对神经突生长和轴突分化的作用。如图3B所示转染神经元，并在2DIV和3DIV通过免疫染色进行分析。(B)在2DIV和3DIV，对来自3至4种不同培养物的免疫荧光图像手动计数III期神经元(带有轴突)。(C)使用AutoNeuriteJ macro对B中生成的免疫荧光影像的至少27个神经元(在2DIV)进行形态计量学分析(有关详细信息，参见方法部分)，*，P<0.05；**，P<0.005；***，P<0.0005(t或Mann和Whitney检验)。
图6.VASH/SVBP复合物的纯化和特性。(A)纯化血管抑制素/SVBP复合物的蛋白印迹分析(上图)和SDS-PAGE(下图)。在HEK293T细胞中血管抑制素及其催化死亡形式与SVBP共表达，如图2所示，然后在钴树脂上纯化。使用仅含GFP构建体(带有His标签)作为对照。用抗His抗体探测GFP和血管抑制素，用抗Flag抗体探测SVBP。表示了未纯化的(裂解物)和纯化的(洗脱液)蛋白提取物的蛋白印迹分析以及纯化的蛋白提取物的SDS-PAGE。注意，SVBP与所有血管抑制素均被共纯化，但未与GFP共纯化。(B)纯化的VASH2/SVBP复合物对纯化的脑微管或微管蛋白二聚体的去酪氨酸化活性，如图(2D)所评估的。(C)通过SDS-PAGE控制(control)图(2D)中使用的未组装的微管(微管蛋白二聚体，Tub)或组装的微管(MT)。将MT和Tub提取物(500ng)在25℃和200,000g下离心15分钟。SN，上清液。(D)通过蛋白印迹控制图2D中使用的VASH1、VASH2和SVBP的量。
图7.去酪氨酸化/酪氨酸化循环和相关酶：微管蛋白羧肽酶(TCP)的中心位置。α-微管蛋白通常重新合成，具有C-末端芳族残基(对于大多数基因为酪氨酸，或对于α8基因为苯丙氨酸)(31)。当αβ-微管蛋白二聚体掺入微管并成为TCP底物时，α-微管蛋白可进入去酪氨酸化/酪氨酸化循环。TCP去除最后的芳族残基，产生带有去酪氨酸化α微管蛋白(或αΔ1-微管蛋白)的微管。也可以通过从编码没有最后的芳族残基的α-微管蛋白的α4基因直接重新合成获得去酪氨酸化的α微管蛋白池。为了完成循环，微管解聚并释放去酪氨酸化的二聚体，其可以通过微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)再酪氨酸化。TTL酶由单一蛋白质组成，而本研究中发现的TCP酶包含催化单元(血管抑制素)和辅助蛋白(SVBP，小血管抑制素结合蛋白)。由于祖先血管抑制素基因的复制事件，脊椎动物具有两个TCP催化亚基，血管抑制素-1(VASH1)和血管抑制素-2(VASH2)。去酪氨酸化的α-微管蛋白是其他修饰的来源。可以由CCP家族酶依次加工倒数第二和倒数第三的谷氨酸残基，以分别生成αΔ2-和αΔ3微管蛋白(28，32，33)。
图8.AD和对照患者脑中微管蛋白去酪氨酸化状态的比较。使用来自健康的年龄匹配者(对照)和AD患者(Braak I-VI期，分类为I-II(AD早期)、III-IV(AD中期)和V-VI(AD后期))的内嗅皮层、海马、颞叶和侧脑组织的蛋白质提取物进行免疫印迹分析。从3个独立的实验进行定量，在整个实验组中使用“对照”脑样品，以允许内部标准化。分析的样品是：对照n＝11，Braak分期(Braak stadium)I-II n＝5，Braak分期III-IV n＝6和Braak分期IV-Vn＝7。将去酪氨酸化和Δ2微管蛋白相对于总微管蛋白标准化。所有数据表示为平均值±SEM。使用混合模型进行Two ways ANOVA分析。变量源是Braak和脑区域。区域的影响并不显著，而Braak对Tub detyr/Tub tot(*p＝0.031)和TubΔ2/tub tot(**p＝0.0051)的影响显著。
图9：VASH1的表达下调影响脑中微管蛋白的酪氨酸化。酪氨酸化的微管蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白、Δ2-微管蛋白、α-微管蛋白和TTL的毛细管蛋白印迹(A)。VASH1 KO杂合子(+/-)、纯合子(-/-)和野生型小鼠(+/+)小鼠的海马中酪氨酸化(B)、去酪氨酸化(C)、Δ2(D)和总α-微管蛋白(E)和微管蛋白酪氨酸连接酶(F)水平的相对定量(平均值±SEM)。使用非参数Kruskal-Wallis检验、以及随后的Dunn多重比较检验进行统计比较。与WT小鼠相比，**p<0.01，****p<0.0001。
图10：SVBP的表达下调影响脑中微管蛋白的酪氨酸化。酪氨酸化的微管蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白、Δ2-微管蛋白、α-微管蛋白和TTL的毛细管蛋白印迹(A)。SVBP KO杂合子(+/-)、纯合子(-/-)和野生型小鼠(+/+)小鼠的海马中酪氨酸化(B)、去酪氨酸化(C)、Δ2(D)和总α-微管蛋白(E)和微管蛋白酪氨酸连接酶(F)水平的相对定量(平均值±SEM)。使用非参数Kruskal-Wallis检验、以及随后的Dunn多重比较检验进行统计比较。与WT小鼠相比，**p<0.01，****p<0.0001。
图11：VASH2的表达下调不影响脑中微管蛋白的酪氨酸化。酪氨酸化的微管蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白、Δ2-微管蛋白、α-微管蛋白和TTL的毛细管蛋白印迹(A)。VASH2 KO杂合子(+/-)、纯合子(-/-)和野生型小鼠(+/+)小鼠的海马中酪氨酸化(B)、去酪氨酸化(C)、Δ2(D)和总α-微管蛋白(E)和微管蛋白酪氨酸连接酶(F)水平的相对定量(平均值±SEM)。使用非参数Kruskal-Wallis检验、以及随后的Dunn多重比较检验进行统计比较。
图12：VASH1的表达下调影响心室中微管蛋白的酪氨酸化。α-微管蛋白、酪氨酸化的微管蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白、Δ2-微管蛋白和TTL的蛋白印迹分析(A)。VASH1 KO纯合子(-/-)、杂合子(+/-)和野生型小鼠(+/+)小鼠的心室中酪氨酸化(B)、去酪氨酸化(D)、Δ2(F)和总(C)α-微管蛋白和微管蛋白酪氨酸连接酶(E)水平的相对定量(平均值±SEM)。使用非参数one-way ANOVA进行统计比较。与WT小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
图13：SVBP的表达下调影响心室中微管蛋白的酪氨酸化。α-微管蛋白、酪氨酸化的微管蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白、Δ2-微管蛋白和TTL的蛋白印迹分析(A)。SVBP KO纯合子(-/-)、杂合子(+/-)和野生型小鼠(+/+)小鼠的心室中酪氨酸化(B)、去酪氨酸化(D)、Δ2(F)和总(C)α-微管蛋白和微管蛋白酪氨酸连接酶(E)水平的相对定量(平均值±SEM)。使用非参数one-way ANOVA进行统计比较。与WT小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
图14：VASH2的表达下调不影响心室中微管蛋白的酪氨酸化。α-微管蛋白、酪氨酸化的微管蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白、Δ2-微管蛋白和TTL的蛋白印迹分析(A)。VASH2 KO纯合子(-/-)、杂合子(+/-)和野生型小鼠(+/+)小鼠的心室中酪氨酸化(B)、去酪氨酸化(D)、Δ2(F)和总(C)α-微管蛋白和微管蛋白酪氨酸连接酶(E)水平的相对定量(平均值±SEM)。使用非参数one-way ANOVA进行统计比较。
图15.VASH1或SVBP的下调影响成熟神经元中微管蛋白酪氨酸化状态
对来自17DIV皮质神经元的蛋白质提取物进行了分析。从3个独立的免疫印迹进行定量，其中提取物来自3个不同胚胎(平均值±SEM，t检验)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图16.血管抑制素或SVBP缺失保护小鼠培养的神经元免受Aβ毒性诱导的树突棘损失。
(A)表达GFP的WT和SVBP-、VASH1-和VASH2-KO培养的神经元(17DIV)树突节段的代表性实例的共聚焦图像，这些培养的神经元用或不用100nM Aβ寡聚体处理48h。比例尺＝5μm。(B)用或不用100nM Aβ处理的WT 17DIV神经元的总树突棘密度(左)或树突棘成熟蘑菇形式(右)的图。所有数据表示为平均值±SEM。学生t检验。****p＜0.0001。(C)来自WT和SVBP-、VASH1-和VASH2-KO 17DIV培养的神经元的Aβ处理的神经元的总树突棘密度(左)或树突棘成熟蘑菇形式(右)的图。分别相对于WT和SVBP-、VASH1-和VASH2-KO的未处理的(对照)神经元的结果，以平均值±SEM表示结果。One Way ANOVA以及Sidak多重比较检验。****p＜0.0001。
图17.体外分析野生型和SVBP KO背根神经节(DRG)神经元的条件性轴突再生。
(A)在没有任何之前的条件(非损伤)或坐骨神经损伤(损伤)三天后分离并培养代表性成人DRG神经元。(B)定量每个神经元的最长神经突长度，n＝2个独立实验；条上的值对应于定量的神经元数量。误差条代表s.e.m.；统计分析：Kruskal-Wallis检验以及Dunn多重比较检验；ns，无统计学显著的差异；**P<0.01。与WT相比，预调节方案后SVBPKO DRG神经元的生长显著更快。
图18.VASH1/SVBP对抑制剂的敏感性。
使用基于Elisa的方法对肽生物素基-V-15-Y进行测定。测试了几种抑制剂：TPCK(甲苯磺酰基苯丙氨酰氯甲基酮)，商业的含有Phe残基的丝氨酸/半胱氨酸抑制剂；帕那替尼(ponatinib)，Abl酪氨酸激酶的商业有效抑制剂；EpoY和epoEEY，设计的抑制剂，分别含有偶联Y或EEY氨基酸的环氧基(Aillaud等人，2017)；炔烃-epoY，epoY的可点击版本。结果表示为在具有DMSO的对照中酶活性的百分比(至少重复两次的平均值)。
图19：校准曲线：在两个肽(生物素基-V-D-S-V-E-G-E-G-E-E-E-D-E-E和生物素基-V-D-S-V-E-G-E-G-E-E-E-D-E-E-Y)的2.7μM和20μM范围内获得校准曲线。使用1/x线性曲线拟合基于8点校准曲线计算浓度。
实施例
实施例1：鉴定血管抑制素/SVBP复合物为有效的微管蛋白酪氨酸羧肽酶
材料与方法：
动物。使用2-4个月龄之间的雄性或雌性小鼠。根据格勒诺布尔神经科学研究所(Institut des Neurosciences of Grenoble，GIN)的政策和法国立法，按照1986年11月24日欧洲共同体理事会指令(European Community Council Directive，86/609/EEC)进行实验。涉及动物的研究得到法国伊泽尔州人口保护局(Direction Départementale de laprotection des populations—Préfecture de l’Isère-France)和法国研究部认可的GIN 004伦理委员会的批准。
酪氨酸化微管蛋白和微管以及EB1的制备。通过在30℃下与纯化的鸡TTL(1mg/mL，Steinmetz小组提供的礼物)和0.1mM L-酪氨酸或[14C]-L-酪氨酸(0.125μCi/nmole)在40mM Pipes，pH 6.7、60mM KCl、2.5mM ATP、1mM DTT、12.5mM MgCl2中孵育45分钟，使牛脑微管蛋白(12mg/mL，根据(34)制备)酪氨酸化。通过在100mM PIPES，pH 6.7、1mM EGTA、1mMMgCl2、30％甘油、1mM GTP中稀释三分之一，在32℃下孵育45分钟，然后再与50μM紫杉醇(Calbiochem)孵育另外45分钟，以允许微管聚合。通过在100,000g、30℃下、在60％甘油垫上离心25分钟来沉淀微管。丢弃含TTL的上清液，并将酪氨酸化的微管重悬于100mM PIPES，pH 6.7、1mM EGTA、1mM MgCl2、10％甘油、80μM紫杉醇中，并保存在-20℃下。为了获得未聚合的酪氨酸化的微管蛋白，在整个过程中省略了紫杉醇。EB1的制备如(34)所述。
TCP活性测定。在使用[14C]-酪氨酸化的紫杉醇稳定的微管的放射活性测试中，使用2μM放射性标记的微管蛋白在100mM MES，pH 6.7、1mM EGTA和1mM MgCl2中测量了酶活性，图2D和S2D除外(如图例所示)。反应在37℃下进行45分钟(不与抑制剂孵育、或事先与抑制剂孵育，见图例)，通过在冰上添加20μg/ml牛血清白蛋白和10％高氯酸终止反应，并离心。通过测量上清液中的放射性来估计从微管切下的酪氨酸(减去零时的对照)。为了构成图S1A的表，测量来自等体积的不同级分的去酪氨酸化活性。在使用抑制剂的测试中，在与抑制剂预孵育20分钟后测试去酪氨酸活性(图S2C和S2D除外，如图例中所示，其使用不同的孵育时间)，使用抑制剂的结果表示为使用相应溶剂的对照中活性百分比。在使用蛋白印迹的测试中，用100mM MES，pH 6.7、1mM EGTA和1mM MgCl2中的5μM底物(紫杉醇稳定的微管、微管蛋白或EB1)溶液测定酶活性，持续时间如图所示。用羧肽酶A(2ng/mL)进行阳性对照。通过加入Laemmli缓冲液终止反应。与羧肽酶A(CPA)(其有效切割芳香族和脂肪族C-末端残基)的反应用作阳性对照。在使用在钴树脂上从HEK293T细胞中纯化的VASH/SVBP复合物的测试中，酶浓度是根据纯化的VASH1和VASH2与牛血清白蛋白标准品的凝胶内考马斯亮蓝染色估算的。
酶富集。根据之前的尝试(23，35)获得的启发，我们设计了对脑裂解物的三步纯化程序。所有步骤均在4℃下进行。将成年小鼠的脑在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.7)、1mM EGTA、1mM MgCl2、1μg/ml DNAse和蛋白酶抑制剂混合物(完全不含EDTA，Roche)中匀浆，并在100,000g下离心1h。收集上清液(级分I)。在步骤1(硫酸铵分级分离)中，将级分I缓慢加入到45％硫酸铵中，孵育15分钟，然后以15,000g离心20分钟。所得上清液在65％硫酸铵下进行相同的程序。将沉淀物以初始体积的八分之一重新悬浮在50mM MES pH 6.7、1mM EGTA、1mMMgCl2中，并使用用相同缓冲液平衡的Bio-Gel P30(Bio-Rad)进行脱盐(级分II)。在步骤2(强阴离子柱)中，将级分II上样到与BioLogic DuoFlow色谱系统(Biorad)连接的5mLHitrap Q XL柱(GE Healthcare)上，并收集未结合的蛋白质(级分III)。在步骤3(强阳离子柱)中：将级分III调节至pH值6.2和0.12M NaCl，上样至5mL Hitrap SP XL柱(GEHeathcare)。用0.12M至1M NaCl梯度洗脱蛋白质。蛋白质级分在50mM MES，pH 6.7、1mMEGTA、1mM MgCl2中平衡(通过用BioGel P-30脱盐)。在这些级分上进行TCP活性测定，合并具有活性的级分(组分IV)。典型实验的纯化数据示于图1A。为了快速富集酶，将脑匀浆直接进行到步骤3，然后脱盐。
点击化学(铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应，CuCAAC反应)。
将级分IV在pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中平衡，并浓缩至2mg/ml。在37℃下与10μM炔烃-epoY或10μM epoY(分别为可点击和对照的不可逆抑制剂，参见图1C、S2B中的结构)孵育1小时后，然后加入两个等体积的叠氮化物-琼脂糖珠(Jena Biosciences)并通过加入1mM CuSO4、100μM TBTA和1mM TCEP开始点击反应。在室温下3小时内完成反应。对于荧光标记，使用100μM 5/6-TAMRA-PEG3-叠氮化物(Jena Bioscience)代替叠氮化物-琼脂糖珠。
质谱样品制备。根据点击化学捕获试剂盒方案(Jena Bioscience)，实现非特异性结合蛋白的去除以及待分析肽的制备。迅速将琼脂糖结合的蛋白质还原并烷基化。用1％SDS和8M尿素洗涤珠。进行珠上胰蛋白酶解(使用测序级修饰的胰蛋白酶，Promega)，并在C18药筒(Ultra-Microspin columns,Harvard Apparatus)上纯化释放的肽。
基于质谱的蛋白质组学分析。如(36)中所述，使用120分钟的梯度通过与串联质谱连接的纳米液相色谱法(与LTQ-Orbitrap Velos Pro连接的Ultimate 3000，ThermoScientific)对肽进行分析。通过针对Uniprot(2017年3月版，鼠(Mus musculus)分类学)、经典污染物(自制)和使用Mascot的相应反向数据库(2.5.1版)进行同时搜索来鉴定肽和蛋白质。使用Proline软件(http://proline.profiproteomics.fr)过滤结果(如采用反向数据库策略，根据肽评分计算的1级肽保留，肽鉴定FDR<1％，每个鉴定的蛋白质组中最少1个特异性肽)，然后对来自对照和阳性样品的蛋白质组进行汇编、分组和比较。从最终鉴定的蛋白质列表中去除来自污染物数据库的蛋白质和其他角蛋白。仅仅进一步考虑在阳性样品的3个重复样品中鉴定出的具有最少3个特定光谱计数且在对照样品中不存在的蛋白质。
表达构建体。对小鼠血管抑制素-1(VASH1)和血管抑制素-2(VASH2)cDNA(登录号分别为NM_177354和NM_144879)进行PCR扩增，并***到自制的含CAG启动子的载体中，产生在N-末端具有Flag标签、并在C-末端具有超折叠GFP(sfGFP(37))和6His标签的蛋白质(Flag-血管抑制素-sfGFP-His)。相应的对照质粒编码Flag-sfGFP-His蛋白。通过在Flag-血管抑制素-sfGFP-His cDNA的下游引入含有脑心肌炎病毒IRES序列、然后是编码小鼠SVBP(登录号NM_024462)的cDNA、和C-末端Myc标签的盒，获得允许血管抑制素和SVBP结合表达的双顺反子质粒(Flag-血管抑制素-sfGFP-His/SVBP-Myc)。通过PCR引入点突变以生成酶促活性死亡的血管抑制素形式：对于VASH1，引入C179A突变；对于VASH2，引入C158A突变，分别根据登录号NP_796328和NP_659128的编号。
从OriGene获得编码具有C-末端Myc和Flag标签的小鼠SVBP的质粒(SVBP-Myc-Flag)。将小鼠Ebl cDNA(登录号NM_007896)***带有EGFP标签的载体中，以产生EB1-EGFP。在(15)中描述了用于在大肠杆菌中生产蛋白质的编码His-EB1的质粒。PCR扩增编码人微管蛋白α1B和小鼠微管蛋白α8的cDNA(登录号分别为NM_006082和NM_017379)，并***具有N-末端mCherry标签的载体中。通过PCR在α-微管蛋白cDNA中引入点突变以用丙氨酸代替最后的芳族残基：对于αlB-微管蛋白为Y451A，对于α8-微管蛋白为F449A，分别根据登录号NP_006073和NP_059075的编号。表达小鼠特异性shRNA的质粒来自OriGene：对于Vash1为TL511800B，对于Vash2为TL506751C，对于Svbp为TL517601B，对于对照为TR30021。通过DNA测序验证所有构建体。
从HEK293T细胞中纯化带有His标签的血管抑制素。在存在蛋白酶抑制剂混合物(完全无EDTA，Roche)的Tris缓冲液，pH 8.0、0.5％TritonX100、1mM MgCl2、200mM NaCl、5mM咪唑中裂解共转染了质粒、以允许GFP或活性/失活形式的血管抑制素和SVBP(Flag-sfGFP-His或Flag-(死亡)VASH1/2-sfGFP-His和SVBP-Myc-Flag)表达的HEK293T细胞。离心(在16.000g和4℃下10分钟)后，收集上清液，并将其添加到20μL钴树脂(Sigma)中，并在4℃下孵育3h。用裂解缓冲液洗涤3次后，使用200mM咪唑、Tris缓冲液，pH 8.0、1mM MgCl2、200mM NaCl洗脱蛋白质。通过在100mM Pipes、1mM EGTA和1mM MgC12中在4℃透析来平衡纯化的蛋白质，并直接用于放射性分析。
细胞培养和转染。如先前所述制备海马神经元和MEF(2)。HEK293T细胞保持在标准条件下。用JetPRIME转染试剂(Polyplus-Transfection)转染HEK293T细胞。使用AmaxaNucleofector试剂盒(Lonza)转染MEF和神经元。通常以1：1的比例用于cDNA共转染(对于VASH1/2，使用SVBP，或对于mCherry-微管蛋白，使用允许VASH1/2和SVBP结合表达的双顺反子质粒。
蛋白印迹和免疫荧光。使用对酪氨酸化的微管蛋白(YL1/2，Tyr-tub)或天然EB1(Tyr EB1)和C-末端去酪氨酸化的微管蛋白(deTyr-tub)或EB1(deTyr-EB1)具有特异性的抗体检测去酪氨酸化活性。用识别两种的抗体估计总微管蛋白或EB1的对照(总α-tub或α3A1，总EB1来自BD转导实验室)。在(15)中描述并表征了所有这些抗体。其他一抗，抗His、抗Flag、抗GFP、抗turboGFP、抗mCherry、抗Tau和抗锚蛋白分别来自Qiagen、MolecularProbes、Chromotek、Invitrogen、Sigma、Millipore和Santa-Cruz。对于蛋白印迹，转染24小时后收集细胞。在37℃下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)介质洗涤后，将细胞直接在Laemmli缓冲液中裂解。将蛋白质提取物上样至10％丙烯酰胺凝胶(
RT-PCR扩增。用Dynabeads纯化试剂盒(Invitrogen)制备来自细胞和组织的信使RNA。使用12.5μl的Superscript一步式RT-PCR系统(Invitrogen)与50ng RNA进行RT-PCR。使用以下引物在58℃下通过45个循环分别扩增来自小鼠Vash1、Vash2和Svbp的697、748和154bp的产物：5’-TACAAACCGCCCGCCTTCC(正向引物)和5’-ACAGACCCTGACAGCTACCAACA(反向引物)用于Vash1(SEQ ID N°4和N°5)，5’-GCAGCCTTCCATTGAGCGGT(正向引物)和5’-CAGTCAACCCAGGGCTTTGCC(反向引物)用于Vash2(SEQ ID N°6和N°7)，5’-CCAGCAGGAGCTGAAGCAAAGA(正向引物)和5’-GCACCAGTTCCTCTGCCGGG(反向引物)用于Svbp(SEQ ID N°8和N°9)。使用以下引物在64℃通过25个循环扩增GAPDH：5’-TCAACGGGAAGCCCATCACCA(正向引物)和5’-GTTTCTCCAGGCGGCACGTC(反向)引物(SEQ ID N°10和N°11)。
形态测定神经元分析。在带有电动支架的DMI6000 Leica显微镜上以20X N.A 0.5物镜获取固定并用抗微管蛋白抗体染色的2DIV神经元的嵌合图像。使用DoG滤镜增强后对图像进行分割。手动选择单个神经元的细胞体，并使用自制的AutoNeuriteJmacro单独处理神经元。简言之，使用“Analyze Skeleton 2D/3D ImageJ插件”(38)将神经元图像骨架化，并解析神经环路。使用“BinaryConnectivity”imageJ插件(由G.Landini开发，http://www.mecourse.com/landinig/software/software.html)标记神经突的末端。生成了每个神经突从末端到细胞体的图像。在路径重叠的神经突中，最长的神经突被定义为初级神经突。将初级神经突的图像从重叠神经突的图像中减去，从而定义了次级神经突和分支数。测量神经突的长度。为了避免骨架化伪影，不考虑具有小于12μm长度的神经突。如果长度为至少长48μm，并且比任何其他初级神经突长1.3倍，则在单个神经元的初级神经突中定义一个轴突。使用此macro，我们为每种情况选择了最少27个神经元，并比较了平均轴突长度、平均初级神经突数和分支频率。
在子宫内电穿孔、组织处理、免疫组化和分析。在(39)中提供了完整的描述。简而言之，使用允许表达shRNA的质粒在E14.5电穿孔麻醉的定时怀孕小鼠的胚胎(见上文)。四天后(El 8.5)，解剖胚胎脑、固定、冷冻切片并放在载玻片上进行分析。用抗tGFP一抗(1：300)在4℃下过夜孵育。细胞核用DAPI(Roche)复染。在带有电动支架的DMI6000 Leica显微镜上通过20X N.A 0.5物镜采集图像，并用图像J分析。将检测到转染细胞的皮层区域分为相同表面积的6个面元(bin)，其中计数GFP阳性(GFP+)神经元(每个条件5个胚胎，每个胚胎3个载玻片)。每个胚胎至少计数260个GFP+神经元。
结果：
为了富集TCP，设计了一个三步纯化方法，其中使用紫杉醇稳定的放射性标记的酪氨酸化微管作为底物，以跟踪活性。典型的方法给出接近400倍的最终纯化因数(图A)。最后的级分(IV)能够从掺入微管中的微管蛋白中切割C-末端酪氨酸，但是不能从EB1中切割。EB1是一种与α-微管蛋白具有相似的C-末端序列的蛋白(QEEY代替-GEEY)，通常在生理环境中不是TCP的底物(15)。
为了从级分IV中分离出负责TCP活性的蛋白质，有理由认为如其他化学蛋白质组学研究(16)的，可使用不可逆抑制剂。首先，测试了脑TCP对各种商业蛋白酶抑制剂的敏感性。几种丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂(AEBSF、TLCK、TPCK、E-64、欧苷菊)和巯基反应性化合物N-乙基马来酰亚胺抑制了活性(图1B)。这些结果与先前的研究一致(17)，强烈地表明推定的TCP的催化活性取决于催化的半胱氨酸。
尽管E-64仅显示出适度的抑制活性(IC 50约为300μM，图1B)，但是该天然产物是抑制剂设计的理想起点，因为其反应性环氧亲电部分可以显示出模拟天然蛋白质C-末端的肽或氨基酸。此外，广泛用于下调细胞中去酪氨酸化水平的化合物欧苷菊(4、6、9、10)具有环氧官能团，表明对其细胞效应至关重要(17)。因此合成了三种抑制剂，即epoY、epoEY和epoEEY，它们含有与来自α-微管蛋白C-末端的一个、两个或三个氨基酸偶联的环氧化物。发现EpoY是TCP活性最有效的抑制剂(IC 50约为500nM，图1B)。因此，合成了epoY的类似物(炔烃-epoY)，该类似物可用于通过使用对亲和标签的点击化学来纯化标记的靶标。炔烃-epoY保留了强的抑制效力(图1B)并且不可逆地抑制富集的酶活性。用炔烃-epoY(或对照epoY)、以及随后的点击反应以连接叠氮化物TAMRA红色荧光染料，进行IV级分的探针标记(图ID)。标记显示了约50kDa的少量蛋白质的特异性修饰(图IE)。为了鉴定这些抑制剂靶标，用炔烃-epoY或epoY作为对照预处理了级分IV，分离标记的蛋白质，并通过质谱分析了共价连接于珠的蛋白质(图1D)。来自三个独立实验的结果将血管抑制素-1(VASH1)蛋白鉴定为最可能的TCP候选物(表2)。仅在炔烃-epoY处理的样品中检测到覆盖几乎完整VASH1序列的肽。最近的生物信息学数据表明，血管抑制素-1及其同源物血管抑制素-2(VASH2)具有非典型的Cys-His-Ser催化三联体，并且是之前未检测到的转谷氨酰胺酶样半胱氨酸蛋白酶家族的成员(18)(图1F)。
表2
血管抑制素蛋白(41-42kDa)已被广泛表征为血管生成调节剂，但在分子水平上仍知之甚少(19)。最近的研究将SVBP(Ccdc23)鉴定为具有伴侣蛋白样功能的血管抑制素的高亲和力结合伴侣(20)。因此，检查了在没有或有SVBP的情况下，VASH蛋白在细胞中去酪氨酸化α-微管蛋白的能力。在HEK293T细胞中单独表达血管抑制素导致去酪氨酸化微管蛋白轻微增加，而两种蛋白与SVBP的表达均导致去酪氨酸化微管蛋白的显著增加，这对应于内源性酪氨酸化的微管蛋白几乎完全缺失。重要的是，血管抑制素上假定的催化半胱氨酸的突变(对于VASH1，为C179A，对于VASH2，为C158A(18))消除了其产生去酪氨酸化的微管蛋白的能力。同样，在鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，表达血管抑制素与SVBP导致内源性α-微管蛋白的完全去酪氨酸化(图2A)。
α-微管蛋白通常由C-末端酪氨酸和之前的两个谷氨酸编码。然而，α4-微管蛋白缺乏C-末端酪氨酸，而α8-微管蛋白含有C-末端苯丙氨酸残基。此外，苯丙氨酸可以代替酪氨酸掺入微管蛋白，并且可能是神经元功能障碍的原因(21)。因此通过在HEK293T细胞中过表达αlB-和α8-微管蛋白以及VASH1或VASH2和SVBP测试了血管抑制素的底物特异性。当与SVBP表达时，两种微管蛋白同种型均被活性血管抑制素裂解(图2B，2B)。然而，当酪氨酸突变为丙氨酸时，血管抑制素不能切割C-末端残基(图2B，2B)，证实了VASH蛋白对C-末端酪氨酸和苯丙氨酸残基的特异性。
为了进一步证实血管抑制素的催化功能以及它们与SVBP相互作用的性质，在没有或有SVBP的情况下，使其在HEK293T细胞中过表达，使用钴树脂纯化所得复合物。如先前的亲和力测量所预期的，SVBP与两种血管抑制素被共纯化(KD 30-90nM(20))，复合物的形成不依赖于催化活性(图6A)。重要的是，这两种蛋白质复合物可有效催化微管蛋白去酪氨酸化，而含有血管抑制素的催化活性死亡型的复合物则不能使微管蛋白去酪氨酸化(图2C)。与微管蛋白二聚体相比，两种复合物均能更快地裂解微管(图2D，6B)，这与脑TCP报道的特异性一致(1、22、23)。纯化的VASH1/SVBP复合物不能从EB1切割C-末端酪氨酸，表明其明显的微管蛋白偏好，然而，有趣地，VASH2/SVBP复合物能够在相同条件下部分地使EB1去酪氨酸化(图2E)。在大多数细胞类型中，包括神经元衍生的细胞类型中，C-末端酪氨酸切割显示为限于微管蛋白(1，15)。然而，EB1可以在特定的内皮细胞和肿瘤细胞中去酪氨酸化(24)，这可能与其VASH2含量或调节机制缺陷有关。
为了证实血管抑制素功能的重要性及其在微管蛋白去酪氨酸化中的作用，我们评估了在分化的神经元中敲减这些蛋白质表达的表型效应，其中去酪氨酸化/酪氨酸化循环对于生长锥寻路和轴突分化非常重要，即，对于神经元极化非常重要(2、7、8)。尽管使用商业抗体无法通过蛋白印迹检测小鼠神经元中的血管抑制素和SVBP，但是从培养的海马神经元以及成年和胚胎小鼠脑组织的RNA制备物中扩增得到它们的转录产物(图3A)。用质粒转染海马神经元，所述质粒表达靶向血管抑制素或SVBP的短发夹RNA(shRNA)，以及对照shRNA(图5A)。蛋白印迹分析显示，当两种血管抑制素或SVPB被下调时，去酪氨酸化的α-微管蛋白水平几乎降低了50％，表明它们在神经元微管的去酪氨酸化中的重要作用(图3B)。在敲减的动物中剩余的去酪氨酸化α-微管蛋白池可能是由于α4-微管蛋白的存在，该α4-微管蛋白在基因上缺乏C-末端酪氨酸，并在脑中以去酪氨酸化的形式存在(25)。体外培养2天的神经元的共聚焦图像(2DIV)证实，血管抑制素表达降低后，天然的去酪氨酸化α-微管蛋白水平降低。其余的去酪氨酸化池则特别集中在轴突中，而神经突中的α-微管蛋白则表现出高度的酪氨酸化。形态测定分析表明，血管抑制素下调导致轴突分化的明显延迟，如在2DIV和3DIV时III期细胞(具有轴突)的比例减少所显示(图3C)。带有轴突的神经元的Tau和锚蛋白染色证实呈正态分布，其中Tau在3DIV的轴突干中高表达，锚蛋白在10DIV的轴突初始节段中高表达。有趣的是，血管抑制素敲减的2DIV神经元产生数量增加的神经突和分支，而轴突长度总体减少了(图3D)。下调SVBP时观察到轴突分化的延迟和类似的形态异常(图5B-C)。因此，与没有反向酶TTL的情况下观察到的过早的轴突分化相反(2)，本文观察到当下调血管抑制素或SVBP时轴突分化明显延迟。
接下来，通过重点研究大脑皮层测试了血管抑制素在体内小鼠脑中的功能重要性，在大脑皮层中去酪氨酸化/酪氨酸化循环对于新皮层的组织至关重要(2)。在皮质发生过程中，神经元迁移部分取决于神经元极化，我们证明了神经元极化高度依赖于血管抑制素和SVBP(图3C)。E14.5胚胎用表达靶向血管抑制素的shRNA和对照shRNA的质粒进行电穿孔，并在四天后分析了径向神经元迁移，使用了可在培养的神经元中抑制约50％的去酪氨酸化的α-微管蛋白池的已验证shRNA。在E18.5，来自对照脑的大多数神经元已到达上层(bin 1)，而在没有血管抑制素的情况下，显著部分的神经元未能到达上层(图4A-B)。因此，这些酶在脑皮层发育期间在神经元迁移中具有关键作用。
总的来说，这些结果表明血管抑制素及其相关伴侣SVBP在神经元和脑中的关键作用，并进一步支持它们是微管蛋白羧肽酶。
在40年中，TCP仍然是α-微管蛋白去酪氨酸化/酪氨酸化循环的关键缺失要素。血管抑制素被鉴定为进行TCP功能的酶蛋白(图7)，它们的相互作用伴侣SBVP对它们的活性至关重要。我们揭示了血管抑制素和SVBP在神经元分化和脑皮质发育中的关键参与作用，并描述了针对该酶家族的新的抑制剂，其可用于血管抑制素的进一步功能研究。先前尝试鉴定TCP的失败很可能是由于对稳定性和活性关键的血管抑制素与SVBP的结合在标准纯化试验中可能缺失。与TCP功能一致，血管抑制素广泛分布在真核生物中，具有广泛的组织表达，并且血管抑制素-1(通常比血管抑制素-2表达更多)在脑、心脏和肾脏中丰富(18、26、27)(参见位于https://www.gtexportal.org/home/的GTEx门户)。
现在，隐蔽的TCP活性的鉴定应该在分子水平上提供了对α-微管蛋白去酪氨酸化和细胞微管稳定性之间关系的理解(28、29)。
有趣的是，血管抑制素被证明对细胞和组织的完整性至关重要，这些蛋白的缺陷与癌症相关(30)，因为预期其为通过去酪氨酸化调节微管稳定性的酶。总体而言，TCP的发现提供了宝贵的信息，揭示了去酪氨酸化/酪氨酸化循环的功能及其对健康和疾病的影响。
实施例2：来自健康和AD患者的人脑中的去酪氨酸化状态
1基本原理。
通过免疫印迹在阿尔茨海默氏病和对照患者的脑中分析了酪氨酸化、去酪氨酸化和Δ2-微管蛋白(另一种形式的去酪氨酸化微管蛋白)的量。在不同的Braak病理期对其进行了分析，并与健康脑的相应对照样品进行了比较。对于每个样品，分析了4个脑区域(内嗅皮层、海马、颞叶和额叶皮层)。
2材料和方法
组织。人组织样品由来自年龄在52至93岁之间的29位男性和女性患者小组的4个脑区域(内嗅皮层、海马、颞叶皮层、外侧前额叶皮层)组成：11个对照，5个Braak I-II期(stadium)，6个Braak III-IV期和7个Braak IV-V期(详细信息参见附件1)。
提取物制备。在Minilys仪器中使用即可使用的Precellys Lysing试剂盒(BertinTechnologies)，在室温下在(10vol/w)含完全抑制剂混合物(Roche)的10mM Tris、0.32M蔗糖，pH＝7.4中将人脑样品匀浆2x30秒。裂解后，收集匀浆，在液氮中冷冻，然后在-80℃下储存直至使用(称为匀浆脑存储液)。需要时，将冷冻的等分试样用RIPA缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、1％NP40、0.5％脱氧胆酸盐、0.1％SDS，pH＝8)进行v/v稀释，在4℃下搅拌30分钟，然后在12000rpm、4℃下离心10分钟。将上清液在液氮中冷冻，然后在-80℃下保存直至使用。
抗体。自制多克隆抗去酪氨酸化的抗体(anti-deTyr)和抗Δ2微管蛋白抗体(Bosson等人,2012；Paturle-Lafanechere等人,1994)。
免疫印迹。
分析29位患者的4个区域的样品(最终为116个样品)。每个样品均进行一式三份的分析。将RIPA上清液(10μl冷冻样品的1/4稀释液)在无染色的4％-15％凝胶(Bio Rad)上进行电泳，然后使用Trans-Blot Turbo转移系统(Bio Rad)快速转移至硝化纤维素膜上。使用1/20000的针对去酪氨酸化和Δ2微管蛋白的特异抗体揭示印迹。多克隆α3A1抗体以1/10000的稀释度用于检测总的α-微管蛋白。适当的过氧化物酶标记的二抗以1/20000使用。使用Pierce ECL蛋白印迹底物(Thermo Scientific)揭示印迹，并使用Image Lab软件通过ChemiDocTMMP成像系统(Bio Rad)进行分析以定量。
3结果
结果显示在图8中。
这些结果清楚地表明，与对照脑(对脑区域没有影响)相比，阿尔茨海默氏症脑的所有区域中都存在去酪氨酸化和Δ2微管蛋白形式的进行性积累。
实施例3：VASH1、VASH2和SVBP对微管去酪氨酸化的体内功能
材料与方法：
用于生化分析的脑组织制备：
使用Precellys匀浆仪，在补充有150mg/mL蛋白酶(P8340，Sigma)和磷酸酶抑制剂混合物(P5726和P0044，Sigma)的裂解缓冲液(不含CaC12和MgC12的磷酸盐缓冲液(PBS)，14190-094Life Technologies)中，使海马匀浆(2x 20s，5000rpm)。然后将裂解物在4℃下以21,000g离心20分钟。收集得到的上清液，并使用二辛可宁酸测定法(Pierce/ThermoFisher Scientific)测定蛋白质浓度。将样品储存在-80℃直至分析。
通过WesTM和Peggy SueTMSimple Western对脑样品进行毛细管蛋白印迹
使用自动Simple Western系统(Protein Simple)在来自SVBP、VASH1和VASH2 KO野生型、杂合型和纯合型小鼠的海马裂解物中评估酪氨酸化、去酪氨酸化、Δ2微管蛋白、总α-微管蛋白和微管蛋白酪氨酸连接酶水平。根据用户手册使用制造商的试剂进行所有程序，表1中描述的一抗除外。将样品以0.125μg/μL的蛋白质浓度上样，与一抗孵育60分钟，与二抗抗小鼠或抗兔IgG孵育30分钟。用Compass软件(Protein Simple)分析数据。将蛋白质水平相对于GAPDH水平归一化。
表1：抗体特征
从心室提取的蛋白质和蛋白印迹：
在存在蛋白酶(Roche；04906837001)和磷酸酶抑制剂(Roche；11836153001)的蛋白质提取缓冲液(Cellsignaling；9803S)中，使用FastPrep匀浆仪在Precellys管(KT03961-1-007.2)中将来自心室的蛋白质(约50mg)匀浆，用于蛋白印迹。在12％Bis TrisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad；3450119)上分离等量的蛋白质(30μg)，并通过TransBlot系统(Bio-Rad；170-4159)转移到硝酸纤维素膜上。用针对GAPDH(1/10000，Millipore；MAB374)、α-微管蛋白(1/5000，Sigma；T 6199-200μE)、酪氨酸化的微管蛋白(1/1000，Abeam；ab6160)、去酪氨酸化的微管蛋白(1/1000，Abeam；ab48389)、Δ2-微管蛋白(1/1000，Abeam；abl06658)的一抗，然后是红外染料偶联的二抗(1/1000至1/10000，Li-Cor)检测蛋白。使用Odyssey扫描仪通过光密度法分析获得蛋白质定量，并相对于Gapdh水平归一化。
小鼠。通过CRISPR/Cas9基因编辑在小鼠中产生SVBP、VASH1和VASH2基因敲除(关于VASH1 KO的产生，参见Teixera等人2018)。对于SVBP，靶向外显子2中的序列，对于VASH1，靶向外显子1中的序列，对于VASH2，靶向外显子2中的序列。通过PCR/Sanger测序对显微注射的胚胎再植入后出生的F0嵌合动物进行基因分型，然后与C57BL/6小鼠交配以提供至少F4/F5小鼠。
结果：
为了确认血管抑制素1、血管抑制素2和SVBP在体内对微管去酪氨酸化的功能，我们检测了血管抑制素l或血管抑制素2或SVBP蛋白敲减的转基因小鼠(野生型、杂合型和纯合型)中酪氨酸化的微管蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白、Δ2微管蛋白、总α-微管蛋白和微管蛋白酪氨酸连接酶水平。这项研究在格勒诺布尔神经科学研究(Grenoble Institute forNeuroscience)生成的小鼠的脑(海马)和心脏(心室)上进行。
在来自VASH1 KO纯合型小鼠的脑样品中，去酪氨酸化微管蛋白和Δ2微管蛋白的水平降低(图9C，D)，而酪氨酸化的微管蛋白水平升高(图9B)。在SVBP KO纯合型小鼠中观察到了相同但更有效的作用(图10B、C、D)。相反，在VASH2 KO纯合型小鼠中未观察到任何作用(图11B、C、D)。
对于VASH1 KO纯合型小鼠(图12C、D)和SVBP KO纯合型小鼠(图13C、D)，在心室样品中去酪氨酸化微管蛋白和Δ2微管蛋白的水平降低，而对于VASH1 KO纯合型小鼠，酪氨酸化微管蛋白的水平增加(图12B)。如同脑样品，在来自VASH2 KO纯合型小鼠的心室样品中未观察到任何作用(图14B、C、D)。
如所预期的，在VASH1和SVBP KO纯合型小鼠中，去酪氨酸化的微管蛋白水平降低，而在脑样品或心脏心室中，酪氨酸化的微管蛋白水平升高。去酪氨酸化微管蛋白的降低是由于在VASH1 KO纯合型小鼠中缺乏VASH1，而在SVBP KO纯合型小鼠中，由于缺乏SVBP(其发挥VASH1和VASH2伴侣蛋白的作用，并稳定这两种蛋白)而使VASH1不再具有活性。在VASH2KO纯合型小鼠中没有统计学差异，可能是由于在脑中VASH2的表达水平低于VASH1的表达水平这一事实。无论哪种蛋白，不论什么蛋白质，KO杂合型小鼠均未观察到统计学差异，可能是由于出生以来逐渐建立的代偿作用和/或剩余蛋白质的活性水平足以进行去酪氨酸化。
去酪氨酸化微管蛋白水平的降低证实了VASH1和SVBP的生理功能，但更重要的是同时增加的酪氨酸化的微管蛋白，这对微管动力学和功能至关重要，有利于TCP抑制剂治疗微管功能改变的神经退行性疾病。
实施例4：AD细胞模型中酪氨酸化微管蛋白水平与树突棘密度(认知标志物)之间 的关系
1基本原理。
我们的假设是，去酪氨酸化微管的积累可能导致微管动力学的丧失，这对于突触可塑性是有害的，并且可能导致表征早期AD的树突棘和突触丧失。
棘形状(粗短、薄、蘑菇状)和数量与突触功效和认知能力密切相关。已知将海马神经元暴露于Aβ低聚物(长期暴露)将导致树突棘密度大大降低(Hsieh等人，2006)。
为了检验我们的假设，我们分析了在有或没有Aβ低聚物的情况下，WT、VASH1、VASH2和SVBP敲除成熟海马神经元中树突棘密度和形态。
在来自野生型(WT)、VASH1和SVBP缺陷型小鼠(杂合型和KO动物)的成熟神经元中分析了不同形式的微管蛋白(酪氨酸化、去酪氨酸化、Δ2-微管蛋白)的量。
2实验策略。
小鼠。通过CRISPR/Cas9基因编辑在小鼠中产生SVBP、VASH1和VASH2基因敲除(关于VASH1 KO的产生，参见Teixera等人2018)。对于SVBP，靶向外显子2中的序列，对于VASH1，靶向外显子1中的序列，对于VASH2，靶向外显子2中的序列。通过PCR/Sanger测序对显微注射的胚胎再植入后出生的F0嵌合动物进行基因分型，然后与C57BL/6小鼠交配以提供至少F4/F5小鼠。
神经元。从WT、SVBP-、VASH1-和VASH2-KO E 17胚胎中切除海马或皮层神经元，并按照先前的描述进行培养(Erck等人2005)。
分析树突棘。用GFP慢病毒(MOI 100)感染一小部分海马神经元(1％)，与未感染的细胞混合，并以高密度(50.000个细胞/cm2)铺在聚赖氨酸包被的培养皿上。然后将神经元在37℃、5％CO2下维持在含有B27的MAC培养基中。体外15天后(15DIV)，将神经元与100nM Aβ低聚物(如Frandemiche等人所述制备)或DMSO(对照)孵育。在17DIV将神经元固定并用抗GFP抗体染色。树突棘被鉴定为GFP标记的树突突起。通过共聚焦显微镜以200nm的Z间隔获取系列图像，并使用NeuronStudio进行树突棘密度和形态分析。
神经元蛋白提取。在17DIV收集皮质神经元的提取物。在37℃下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)介质洗涤后，将细胞直接在Lacmmli缓冲液中裂解。样品保存在-20℃下直至分析。
免疫印迹。对每个神经元提取物进行一式三份的分析。如人样品所述进行神经元提取物(n＝3个胚胎)分析，所不同的是使用了PVDF膜，并且使用的抗体如下：GAPDH抗体(Sigma，1/5000)、YL1/2(1/10000)、抗deTyr(1/10000)、抗Δ2(1/10000)和过氧化物酶标记的二抗(1/10000)。
结果。
结果如图15和16所示。
数据清楚地表明，在SVBP和VASH1敲除细胞中，酪氨酸化的微管蛋白增加，去酪氨酸化和Δ2-微管蛋白减少。来自杂合型的神经元与野生型神经元没有显著差异。
将野生型神经元暴露于毒性Aβ诱导棘密度大大降低(30％)，尤其是成熟形式(蘑菇形式)。当缺失SVBP或VASH1或VASH2时，神经元的棘密度和蘑菇形式含量对Aβ暴露不敏感，这表明去酪氨酸化的降低(酪氨酸化的微管蛋白水平升高)可以防止Aβ毒性。
实施例5：VASH/SVBP复合物在再生过程中的意义
1基本原理：
位于背根神经节(DRG)中的具有细胞体的神经元是假单极神经元，具有可分支为两个轴突的单个轴突，一个是在受到损伤时能够再生的周围轴突，一个是在受到损伤后不能再生的进入中枢神经系统的中枢轴突。研究表明，损伤周围轴突也导致中枢分支的再生过程(分子、细胞)，这意味着如果相应的周围轴突也受到损伤，这些DRG神经元的中枢轴突也能够再生((Richardson and Verge,1987)。该效应称为调节病变效应或预调节。调节病变诱导神经元内在再生能力的增强，从而导致神经生长的增强(Smith和Skene，1997)。
预调节方案后，我们测定了WT或SVBP KO的DRG神经元的生长能力。
2材料与方法
成年(2个月)WT和SVBP KO成年小鼠通过用镊子损伤左侧坐骨神经30秒进行手术调节(预调节条件)。3天后，培养对应于形成坐骨神经的DRG神经元，并与对侧DRG神经元进行比较(对照条件)。
培养程序包括在过量的
3结果
结果如图17所示。
我们的数据表明，通过SVBP缺失引起的去酪氨酸化的减少(和酪氨酸化微管蛋白水平的升高)促进DRG神经元的再生能力。
实施例6：使用ELISA方法和α-微管蛋白C-末端肽分析TCP抑制剂
1基本原理。
TCP或VASH/SVBP复合物是切割微管上α-微管蛋白的C-末端酪氨酸或微管蛋白的游离二聚体的酶(Aillaud等人，2017)。我们测试了它们去酪氨酸化对应于α-微管蛋白的C-末端序列的肽的能力，以及几种潜在抑制剂对该活性的影响。这种测定法可适用于大批药物的筛选。
2材料与方法。
设计了一种基于板的分析技术，用于检测和定量VASH/SVBP复合物的去酪氨酸化活性。简而言之，在96孔Immulon 4HBX板上进行测定，所述96孔Immulon 4HBX板包被含有50μg/ml中性抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲盐介质(PBS)。用含有0.05％Tween的PBS冲洗后，用含有10-8M生物素基-V-15-Y肽(生物素基-Val-Asp-Ser-Val-Glu-Gly-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Glu-Glu-Tyr)的PBS包被板，然后用含有0.05％Tween的PBS冲洗。然后向肽中加入在0℃下与DMSO或不同浓度的抑制剂预孵育2小时的VASH1/SVBP酶(0.2μM)，进行30分钟反应。通过用含有0.05％Tween的PBS冲洗3次终止反应。然后使用抗酪氨酸化的微管蛋白(YL1/2，1/2000)作为一抗、抗大鼠HRP(1/5000)作为二抗进行免疫检测，其中以TMB溶液作为HRP底物在PHERAstar系统(BMG Labtech)上进行ELISA(Sigma)。
Ni-NTA柱(HiTrap 5ml)
VASH1与C-末端具有6个组氨酸标签的SVBP在大肠杆菌中共表达。将该复合物在Ni-NTA柱上随后通过尺寸排阻色谱法纯化。
3结果
结果如图18所示。
数据清楚地表明，生物素基-V-15-Y肽是VASH/SVBP酶复合物的底物，因此可用于筛选活性抑制剂。
实施例7：用于研究TCP抑制剂活性的无细胞测定法
通过/质谱(MS)研究微管蛋白羧肽酶(TCP)或微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)，比其他现有的测定形式具有许多优势。首先，该系统避免了使用放射性底物时的成本和特殊的处理程序。其次，基于
使用两个肽来监测酶活性。第一个肽代表TTL酶的底物或TCP反应的产物：生物素基-V-D-S-V-E-G-E-G-E-E-E-D-E-E。第二个肽代表与TTL反应的产物或TCP的底物：生物素基-V-D-S-V-E-G-E-G-E-E-E-D-E-E-Y，其中酪氨酸(Y)位于生物素化肽的末端。
将TCP或TTL酶与化合物在室温下预孵育15分钟。然后，添加肽底物。将肽在室温下以不同浓度(10-100μM)与最终浓度为55nM的TCP或TTL孵育30分钟，反应体积为50μl(MES50mM；KC100mM；MgC1225mM；DTT 0.001M；ATP 0.0003M和5％DMSO的0.001M的酪氨酸)。30分钟后，通过添加TFA至终浓度1％终止反应。最终体积为约100μl。
使用上述条件，通过/MS分析反应产物。
将365(Agilent Technology)高通量系统(RF)连接到以电喷雾负离子模式运行的G-6460三重四极杆质谱仪(Agilent)。使用C型药筒进行样品捕获和洗脱。方法采用直接与MS检测连接的固相萃取(SPE)样品净化步骤。
抽吸样品600ms，然后加载4000ms，并用流动相A(98％ddH2O+2％ACN+TFA0.01％)以1.5mL/min的流速洗涤。将40μl样品的固定环加载到药筒上。然后用80％CAN+20％ddH20+TFA 0.01％的流动相B以1.25mL/min的流速洗脱样品5000ms，然后用流动相A以0.7mL/min重新平衡药筒500ms。
MS参数：气体温度：200；干燥气体：9；雾化器：40；鞘气温度：400；Seath气流：12；VCap：3500；喷嘴电压：300；ΔEMV：400
微管蛋白肽底物和反应产物的MRM转换分别为m/z 858.3→669.5，m/z 939.8→719.8。每个转换的驻留时间为4ms。积分峰面积，并使用底物和反应产物校准曲线，将曲线下的面积转换为残留底物和形成产物的量(参见图19)。
参考文献：
在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的技术水平。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开中。
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