一种早花高产番茄材料的制备方法

文档序号：1152145 发布日期：2020-09-15 浏览：19次 >En<

阅读说明：本技术 一种早花高产番茄材料的制备方法 (Preparation method of early-flowering high-yield tomato material ) 是由李传友朱强邓磊李常保于 2019-03-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种早花高产番茄材料的制备方法。本发明公开的早花高产番茄材料的制备方法包括：降低受体植物中SlTOE1的活性、降低受体植物中SlTOE1的含量、抑制受体植物中SlTOE1的编码基因的表达或敲除受体植物中SlTOE1的编码基因,得到与受体植物相比开花时间缩短且产量提高的目的植物。本发明可以在1年以内得到一个早花高产植物新品种,而利用传统育种手段需要连续回交、自交,至少需要3-4年时间,本发明的方法操作简单,成本低,大大加快了育种进程,并且克服了早花与高产难以兼备的不足,极大满足了生产需求,具有广泛的应用前景。(The invention discloses a preparation method of a high-yield early-flowering tomato material. The invention discloses a preparation method of a high-yield early-flowering tomato material, which comprises the following steps: the activity of SlTOE1 in a receptor plant is reduced, the content of SlTOE1 in the receptor plant is reduced, the expression of a coding gene of SlTOE1 in the receptor plant is inhibited or the coding gene of SlTOE1 in the receptor plant is knocked out, and a target plant with shortened flowering time and improved yield compared with the receptor plant is obtained. The method can obtain a new early-flowering high-yield plant variety within 1 year, and the traditional breeding means needs continuous backcross and selfing, and at least needs 3-4 years.)

一种早花高产番茄材料的制备方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域中，一种早花高产番茄材料的制备方法。

背景技术

开花时间是影响产量的一个关键因素，一般情况下，晚花会使生育期延长，生物量增加，产量也会随之增加；早花会缩短生育期，但生物量会减少，产量降低。如何实现早花又高产一直是育种上的难题。目前市场上晚花高产的作物品种比较多，早花高产的品种则很少。早花高产相对于晚花高产品种具有在保持高产的前提下缩短生育期，早上市等优势，因此更受农民喜爱，也是育种家追求的目标。

拟南芥TOE1转录因子能够抑制开花，拟南芥TOE1基因功能完全丧失后开花提前，但植株瘦小，种子产量明显降低。

基因组编辑技术(genome editing)是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/Cas9endonuclease)是目前应用最广泛的基因组编辑工具之一。该技术的工作原理是核酸内切酶Cas9蛋白在向导RNA(short guide RNA,sgRNA)的引导下，对目标基因进行切割，导致DNA双链断裂，此时会诱发细胞的DNA修复机制，在修复过程中难免会引入碱基的***、缺失或替换等变异，从而实现目标基因的定点突变。之后将转基因标记去除，得到的品种与传统育种方法培育出的品种完全相同。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物产量并缩短植物开花时间。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质含量和/或活性的物质的下述任一应用：

D1)调控植物开花时间；

D2)制备调控植物开花时间产品；

D3)缩短植物开花时间；

D4)制备缩短植物开花时间产品；

D5)调控植物产量；

D6)制备调控植物产量产品；

D7)提高植物产量；

D8)制备提高植物产量产品；

D9)调控植物开花时间和产量；

D10)制备调控植物开花时间和产量产品；

D11)缩短植物开花时间和提高植物产量；

D12)制备缩短植物开花时间和提高植物产量产品；

D13)植物育种；

所述蛋白质的名称为SlTOE1，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；

A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的SlTOE1蛋白质，为与序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的SlTOE1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的SlTOE1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3所示的SlTOE1蛋白质。

本发明还提供了与SlTOE1相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物开花时间；

D2)制备调控植物开花时间产品；

D3)缩短植物开花时间；

D4)制备缩短植物开花时间产品；

D5)调控植物产量；

D6)制备调控植物产量产品；

D7)提高植物产量；

D8)制备提高植物产量产品；

D9)调控植物开花时间和产量；

D10)制备调控植物开花时间和产量产品；

D11)缩短植物开花时间和提高植物产量；

D12)制备缩短植物开花时间和提高植物产量产品；

D13)植物育种；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码SlTOE1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低SlTOE1含量和/或活性的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b5)中的任一种：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b3)序列表中序列1所示的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SlTOE1的cDNA分子或DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码SlTOE1的cDNA分子或DNA分子；

B8)所述核酸分子为下述c1)-c4)中的任一种：

c1)序列表中序列4所示的RNA分子；

c2)转录序列表中序列4所示RNA的DNA分子；

c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的RNA分子或DNA分子；

c4)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的RNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SLTOE1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SLTOE1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SLTOE1蛋白质且具有SLTOE1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码SLTOE1蛋白质的核酸分子的表达盒(SLTOE1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SLTOE1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动SLTOE1基因转录的启动子，还可包括终止SLTOE1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述SLTOE1基因表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

B9)所述重组载体可为利用crisper/cas9系统制备的可以降低SLTOE1含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。所述sgRNA的靶序列可为序列表中序列序列1的第317-336位。

B9)所述重组载体具体可为利用限制性内切酶BsaI将靶序列的双链DNA***至pTX041载体中得到的能够转录序列表中序列4所示sgRNA的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌LBA4404。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了下述任一方法：

X1)缩短植物开花时间的方法，包括：降低受体植物中SlTOE1的活性、降低受体植物中SlTOE1的含量、抑制受体植物中SlTOE1的编码基因的表达或敲除受体植物中SlTOE1的编码基因，得到与所述受体植物相比开花时间缩短的目的植物；

X2)培育开花时间缩短植物的方法，包括：降低受体植物中SlTOE1的活性、降低受体植物中SlTOE1的含量、抑制受体植物中SlTOE1的编码基因的表达或敲除受体植物中SlTOE1的编码基因，得到与所述受体植物相比开花时间缩短的目的植物；

X3)提高植物产量的方法，包括：降低受体植物中SlTOE1的活性、降低受体植物中SlTOE1的含量、抑制受体植物中SlTOE1的编码基因的表达或敲除受体植物中SlTOE1的编码基因，得到与所述受体植物相比产量提高的目的植物；

X4)培育产量提高植物的方法，包括：降低受体植物中SlTOE1的活性、降低受体植物中SlTOE1的含量、抑制受体植物中SlTOE1的编码基因的表达或敲除受体植物中SlTOE1的编码基因，得到与所述受体植物相比产量提高的目的植物；

X5)缩短植物开花时间和提高植物产量的方法，包括：降低受体植物中SlTOE1的活性、降低受体植物中SlTOE1的含量、抑制受体植物中SlTOE1的编码基因的表达或敲除受体植物中SlTOE1的编码基因，得到与所述受体植物相比开花时间缩短且产量提高的目的植物；

X6)培育开花时间缩短和产量提高植物的方法，包括：降低受体植物中SlTOE1的活性、降低受体植物中SlTOE1的含量、抑制受体植物中SlTOE1的编码基因的表达或敲除受体植物中SlTOE1的编码基因，得到与所述受体植物相比开花时间缩短且产量提高的目的植物。

所述受体植物中含有SlTOE1的编码基因。

上述方法中，敲除受体植物中SlTOE1的编码基因可利用CRISPR/Cas9方法实现。

所述CRISPR/Cas9方法中所用靶序列为序列表中序列1的第317-336位。

所述CRISPR/Cas9方法中所用sgRNA具体可为序列表中序列4所示的RNA。

上述方法中，敲除受体植物中SlTOE1的编码基因具体可通过将所述B9)所述重组载体导入植物中实现。

所述方法还可包括筛选不含有外源DNA序列的目的植物的步骤。

与所述受体植物相比，所述目的植物中SlTOE1的编码基因发生突变，致使SlTOE1的含量下降和/或SlTOE1功能的丧失。所述突变可为一至多个核苷酸的缺失、***和/或改变。

在本发明的一个实施例中，与所述受体植物相比，所述目的植物中SlTOE1编码基因的对应于序列表中序列2的第320-323位核苷酸缺失。

本发明还提供了具有缩短植物开花时间和/或提高植物产量功能的产品，所述产品含有所述生物材料。

所述产品可以所述生物材料为其活性成分，还可将所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

利用所述方法制备的目的植物在植物育种中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明中，所述植物可为c1)-c4)中的任一种：

c1)管状花目植物；

c2)茄科植物；

c3)番茄属植物；

c4)番茄。

所述具体可产量体现在所述植物的果实上。

实验证明，本发明通过利用CRISPR/Cas9方法将植物中TOE1基因敲除后，实现了开花时间的缩短以及产量的提高，成功培育出早花高产植物。本发明可以在1年以内得到一个早花高产植物新品种，而利用传统育种手段需要连续回交、自交，至少需要3-4年时间，本发明的方法操作简单，成本低，大大加快了育种进程，并且克服了早花与高产难以兼备的不足，极大满足了生产需求，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为植株2的序列突变情况。

图2为野生型番茄与植株2开花时间表型，以第一序花前叶片数表示开花时间。野生型是指野生型番茄。

图3为野生型番茄与植株2产量表型，A为表型照片，B为产量统计结果，野生型是指野生型番茄。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

番茄采用番茄常规品种M82(以下也称为野生型番茄)，来源于美国番茄遗传资源中心(TGRC，http://tgrc.ucdavis.edu/)。

实施例1、利用CRISPR/Cas9方法编辑番茄SlTOE1基因获得早花和高产番茄

本实施例利用CRISPR/Cas9方法对番茄的TOE1基因(记为SlTOE1基因)进行基因编辑，得到了开花时间提前并且高产的番茄，在野生型番茄中，SlTOE1基因的序列为序列表中序列1，其CDS序列为序列2，编码序列表中序列3所示的蛋白质(记为SlTOE1蛋白质)。具体步骤如下：

一、重组载体的构建

将序列表中序列1的第317-336位作为靶序列，其序列为5′-ATCGGGTCATTCTCTCCTCC-3′，构建能表达靶向靶序列sgRNA的重组载体。

合成靶序列的双链DNA，利用限制性内切酶BsaI将靶序列的双链DNA***至CRISPR/Cas9载体(即文献“Deng et al.,Efficient generation of pink-fruitedtomatoes using CRISPR/Cas9system,Journal of Genetics and Genomics 45(2018)51-54”中的pTX041)中，得到重组载体。该重组载体能表达序列表中序列4所示的靶向靶序列的sgRNA。

二、转基因番茄的构建与鉴定

转基因番茄的构建：将步骤一得到的重组载体导入农杆菌LBA4404菌株中，利用农杆菌介导的转化方法转化野生型番茄构建得到T0转基因番茄。

转基因番茄的鉴定：利用正向引物(5′-ATGTTGGATCTCAATGTAAGCG-3′)和反向引物(5′-GACCTTGGGCCTCTCCTACTCT-3′)组成的引物对1对上述转基因植株的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，对得到的PCR产物进行测序，鉴定得到1株SlTOE1基因发生纯合突变的植株，命名为植株2，与野生型番茄相比，该植株中缺失了靶序列的第4-7位(图1)，该种缺失导致SlTOE1基因CDS序列从第320位发生移码突变，产生终止密码子，翻译出丧失DNA结合结构域的截短蛋白，以致SlTOE1蛋白质功能的丧失，植株中不含有SlTOE1蛋白质。将植株2种植于温室中，通过自交获得T1代转基因种子。利用PCR方法鉴定出T1代种子中不含有外源序列(即CRISPR/Cas9方法编辑番茄SlTOE1基因过程中所用到的非番茄基因组序列的外源序列)的个体(所用引物对记为引物对2，该引物对序列为：正向引物：5′-TTGACAAGCTGTTCATCCAG-3′；反向引物：5′-CCTTCGTAATCTCGGTGTTC-3′)。从植株2的T1代植株中鉴定出1/4的个体不含外源序列。

通过测序检测鉴定出的不含外源序列的T1代个体的SlTOE1基因是否依然发生纯合突变。利用引物对1PCR扩增SlTOE1基因片段，然后对PCR产物进行测序，将测序结果与野生型番茄SlTOE1基因进行比对，发现在靶序列的位置依然存在纯合突变(即两条染色体中均依然缺失靶序列的第4-7位)，说明CRISPR/Cas9产生的突变能够从T0代稳定遗传到T1代。将这些不含外源序列且SlTOE1基因发生纯合突变的T1代植株即为目的SlTOE1基因编辑植株。

三、开花时间及产量测定

在北京对番茄植株进行开花时间及产量测定，待测植株为步骤二得到的目的SlTOE1基因编辑植株以及野生型番茄(作为对照植株)。

将待测植株在温室中育苗，25℃、16h光照/8h黑暗条件下光照培养20d。各挑选20棵长势一致的幼苗移栽到温室大棚中，株距、行距在60cm以上，两种材料随机分布。正常的水肥管理，保证所有植株水肥条件基本一致。植株不打岔，让其自然生长。开花后统计第一序花前叶片数，第一序花前的叶片数目可以代表开花时间，数目越多表示开花越晚，反之越早；在目的SlTOE1基因编辑植株80％果实变红以后收获目的SlTOE1基因编辑植株及对照植株的所有果实，单株称量果实重量，并拍照记录，结果如表1所示。

表1、各材料的表型

材料	产量(kg/株)	第一花序前叶片数(个)
			目的SlTOE1基因编辑植株	4.56	7.94
野生型番茄	3.01	6.50

结果显示，与野生型番茄相比，目的SlTOE1基因编辑植株的产量显著增加，第一花序前叶片数减少约1.5片，开花时间明显缩短。表明，SlTOE1基因及其编码的蛋白质可以调控番茄的产量和开花时间，SlTOE1基因编辑后可制备番茄的早花高产材料。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所、北京市农林科学院

<120> 一种早花高产番茄材料的制备方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3228

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 1

atgttggatc tcaatgtaag cgtaatctac aataatgacc ttccacaagt ttctctactt 60

gatgaatcag ccacctccaa ttcatcctta cgaaatgcgg aagctacaac cagtgccggt 120

gacgaagatt cgtgcgccgg tgagttgttc gctttcaatt ttggaatcct caaagttgaa 180

ggagctgaga ctagtaggag cagcaacaac gatgatgagg aaggatacgg taagaatcag 240

agagttactc attctcaatt cgtgactagg cagctgtttc ccgttgatga tggtgagttg 300

aaccggaaac aaaccgatcg ggtcattctc tcctccgctc gatccggtac ttctatcggt 360

tttggagatg tgcggataat acaacagcaa caaacggagc aaccgaaaca acaagtgaag 420

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agaactggta gatgggaatc acatatatgg ttagttttct aactgatttt ttttttgttg 540

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ggatgcaggg actgtgggaa acaagtatat ttgggtatgg atattgctat tttaaatata 660

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acagcagcaa ggtaaaataa aagtcatatg agttctcaaa tatacgcgtc atcagatttt 840

tcaaatttat gctatttccc aaatttgatt gtatttgttt tcttctccgt tgtacagagc 900

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tgattacgag gaggatatgc aacaggttag aaatgcaaag atttaatatg cgcaaatatg 1020

ttaaggtcac tgttgagcgc ttctctgggt ttattattgc ttctgtttta attggcatca 1080

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caaactaata tagatacatg caacagtagt atctatatgt ggatctatct catttgtgat 1800

gcctatgatg caggtagcca acatgatctt gatctgaact tggggatatc gaccacttct 1860

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ggataaacct ggttcagtaa tagttggaag ttcacatctc aagggactac caatgtcgtc 2280

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atctctgttt agtcttcttt tcctcactta tcgtcaaatt agcacgtatt cagttgccaa 2460

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aacattttac ctttttactt cttgtgtttt ttggggctga taatcagtga tagtatgccc 2700

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ggggtgcata ttctcatgtg tggtcacagc cagtttttca ctgcaaacag ttgtctaaaa 2880

gtcaatgtct ttgttatgcc cttttgtgcc tcttcttaat tgaatgcatc cttagtataa 2940

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<210> 2

<211> 1425

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 2