阅读说明：本技术 靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备 (Preparation of sgRNA and HaCaT cell models of human genome sequences at high-frequency integration sites of targeted high-risk HPV ) 是由 汪辉 马丁 任慈 丁文成 李晓敏 熊劲风 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备。本发明针对HPV16在13q22和HPV18在8q24区域的整合位点分别设计特异性的sgRNA,并得到sgRNA双链DNA,将sgRNA双链引物分别与CRISPR/Cas9载体连接获得sgRNA表达载体,筛选得到sgRNA打靶质粒；运用克隆构建及PCR扩增分别合成含有高危型人乳头状瘤病毒HPV基因的线性Donor片段,与sgRNA打靶质粒共转染HaCaT细胞,获得HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型。本发明运用CRISPR/Cas技术建立的HPV16及HPV18在人基因组高频位点整合的细胞模型,促进了HaCaT细胞的生长增殖,为高危型HPV整合在宫颈癌发病中的机制研究提供新的方法。(The invention relates to preparation of sgRNA and HaCaT cell models of human genome sequences at high-frequency integration sites of targeted high-risk HPV. Specific sgRNA is respectively designed aiming at the integration sites of HPV16 in the region of 13q22 and HPV18 in the region of 8q24, sgRNA double-stranded DNA is obtained, sgRNA double-stranded primers are respectively connected with a CRISPR/Cas9 vector to obtain a sgRNA expression vector, and a sgRNA targeting plasmid is obtained through screening; respectively synthesizing linear Donor segments containing high-risk human papilloma virus HPV genes by cloning construction and PCR amplification, and co-transfecting HaCaT cells with sgRNA targeting plasmids to obtain a HaCaT cell model integrated with HPV genes at fixed points. The invention uses the cell models of HPV16 and HPV18 integrated at the high-frequency locus of the human genome established by the CRISPR/Cas technology to promote the growth and proliferation of HaCaT cells and provide a new method for the mechanism research of the high-risk HPV integration in the onset of cervical cancer.)

靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和 HaCaT细胞模型的制备

技术领域

本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及一种靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备。

背景技术

***是世界女性第三大恶性肿瘤，其发病率高居妇科恶性肿瘤的首位。人***状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染已被证实为***的致病因素，绝大多数***是由高危型HPV持续性感染引起的，HPV16和HPV18是最重要的两种高危型HPV。在HPV感染的早期，病毒基因组作为染色体以外的游离DNA随着宿主基因组的复制而复制。随着癌前病变的进展，病毒的癌基因逐渐发生与宿主基因组的整合，大多数病变在进展至***的阶段都出现了病毒基因的整合，整合的出现与癌前病变到癌的进展过程密切相关，并被作为疾病进展的一个标志。

现有的关于HPV的研究大多关注于E6和E7癌基因的作用，忽略了HPV整合的重要作用。据TCGA数据显示，在HPV16阳性的***中，76％的肿瘤发现了HPV病毒基因的整合，HPV18阳性的***组织中，100％的肿瘤都存在HPV病毒基因的整合。研究显示，体外转染HPV虽然可以促使正常上皮细胞永生化，但是细胞的恶变仍需其他基因异常事件的参与，比如Ras基因的突变或DCC基因的缺失，对HPV转染所致的永生化细胞进行遗传学检测，发现细胞基因组产生了大量不稳定事件，比如双倍体、多倍体、染色体缺失和易位等。HPV基因转染后细胞出现的染色体非整倍体以及突变，提示我们***的发生除了E6/E7的作用以外，还有细胞不稳定性事件的重要参与。

HPV整合是诱导基因组不稳定性的重要原因。大量的研究数据证实：HPV在人类基因组的整合并不是随机发生的，而是存在多个高频整合位点。这些位点多数分布在基因组脆性位点、癌基因或者抑癌基因附近，整合不仅破坏关键基因的结构和功能，还会引起整合位点附近基因组的大量扩增、缺失、重排和易位等，导致基因组强烈不稳定。有研究显示，HeLa细胞中整合在MYC附近的HPV基因发生了将近30个拷贝数的扩增，其中就包括HPV基因的URR区，其富含上皮特异性增强子元件，它的不断扩增诱导基因组强烈不稳定，引起整合位点处基因组DNA多次断裂与修复，导致MYC基因的大量扩增，促使细胞癌变。可见，HPV整合至宿主基因组是宫颈重大疾病发生发展的关键事件。

然而，E6和E7基因只是HPV感染以至整合宿主细胞的表达产物之一，仅凭这些现象还不足以证明E6/E7基因表达与细胞癌变之间的必然关系，癌细胞基因分子异常事件均是细胞经过长期克隆进化后的终产物，我们无法得知HPV整合诱导基因组不稳定性进而促进细胞恶变的生物学过程。由于HPV病毒本身的特点，我们无法在体外培养出完整有生物活性的HPV病毒，HPV基因转染的细胞模型，也不能揭示HPV真正的致病机制。因此，我们需要建立新的细胞模型，还原HPV整合致病的生物学过程，为HPV整合致癌的研究提供新的方法和理论依据。

近年来，CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)技术的兴起，为广大的科研工作者研究分子生物学带来了巨大的便利。在靶向sgRNA的识别下，Cas9核酸酶蛋白可以在基因组特异位点切割DNA双链，一旦产生了DNA双链的断裂，细胞就会自发的启动非同源末端修复机制将断端连接，由于这种修复方式保真性较低，容易引起断裂位点的碱基错配、***、缺失等，造成基因的正常功能减弱甚至丧失，由此达到基因敲除的目的。另一方面，如果在sgRNA作用的同时提供一个含有HPV DNA的同源性修复模板，那么细胞就会启动同源末端修复机制将HPV DNA引入断裂位点，实现HPV基因的定点敲入，这也为我们建立HPV定点整合的细胞模型提供了充分的技术支持。

然而，要想成功建立HPV基因定点整合的细胞模型仍然面临着诸多的困难。首先，细胞在修复DNA断裂时具有偏好性，通常情况下，细胞会优先选择非同源末端修复机制而非同源末端修复机制，极大限制了基因敲入的效率。再者，体外的基因敲入仍有很多不可控制的因素。基因敲入的可行性也会随着敲入片段的长度大大降低，当前的研究大多通过CRISPR和Donor联合的方法实现单基因疾病相关的基因点突变或者特殊位点的小片段tags***，比如纠正镰刀型细胞贫血症的基因突变，以及在AAVS1位点敲入EGFP基因，敲入基因的长度大多不超过1000bp。再者，目前大多数体外细胞实验是以病毒作为载体进行基因敲入，不仅增加了目的基因随机整合的概率，还带来了更多的生物安全性问题。

目前运用CRISPR技术建立基因敲入细胞模型的案例仍属罕见，大多数的研究仍然处于不断的技术探索和方法改进中。有研究发现，线性双链或线性单链形式的供体Donor比环状形式的供体Donor更有利于敲入，也有研究证明供体Donor两端同源臂的长度在一定范围内的增加也会提高基因敲入的效率，而超过1000bp长度的同源臂则会降低基因敲入的效率。更有多个学者发现，很多小分子化合物可以提高基因敲入的可能性，比如细胞周期同步药物以及DNA连接酶抑制剂等。

截至目前为止，仍没有成熟的HPV基因整合的细胞模型，很大程度上归因于体外大片段基因定点敲入的技术难度，因此，有必要建立一套安全有效的基因敲入体系，为HPV基因定点整合的细胞模型提供技术支持。

发明内容

根据大数据分析，整合频率最高的HPV基因片段大概有1600bp左右，包含被称为癌基因的E6和E7基因，以及正向调控E6、E7基因表达的上游调控区(URR)，已经超出了常规的敲入基因长度，还考虑到具体实验操作步骤，通常还需要在整合基因的末端附带一段标签基因，比如荧光蛋白基因以及药物抗性基因，以便于对整合阳性的细胞进行筛选和富集，这无疑在技术层面大大增加了HPV基因敲入的难度。本发明提供了一种靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备，从HPV整合热点的大数据中，分析得到13q22和8q24两个整合频率最高的位点，筛选出靶向高频整合位点的sgRNA打靶质粒，并分别构建合成含有HPV16及HPV18基因的线性Donor片段。同时，挑选了正常的上皮细胞来源的HaCaT细胞作为宿主细胞，此细胞非肿瘤细胞系，不含有HPV，更符合HPV的致病特征。通过在上皮细胞HaCaT中共转染靶向特定位点的sgRNA打靶质粒和含有HPV基因的线性Donor片段，借助细胞对DNA断端的同源重组修复机制，建立HPV基因在细胞基因组特定位点整合的体外细胞模型，并通过特异性的PCR实验和一代测序的方法，验证HPV基因在基因组特定位点的敲入，最终建立了HPV定点整合的细胞模型。

为实现上述目的，本发明所设计一种靶向高危型(人***状瘤病毒)HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA，所述高危型HPV为16型人***瘤病毒，且HPV高频整合位点为13q22位点时，13q22-sgRNA序列为：TACAGCCACTCACAGCCCGC，如SEQ ID No.1所示；

或者，所述高危型HPV为18型人***瘤病毒(HPV18)，且HPV高频整合位点为8q24位点时，8q24-sgRNA序列为ACAAATAACTGTAAAGAGTA，如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种上述sgRNA对应的DNA序列，所述8q24-sgRNA序列对应DNA为：

本发明还提供了一种高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备方法，包括以下步骤：

1)针对高危型(人***状瘤病毒)HPV在人类基因组中高频整合位点并结合碱基配对规律特异性设计sgRNA序列并得到sgRNA序列双链DNA(所述的sgRNA序列为含有20bp高度特异性基因序列，其分别为能够通过碱基配对与8q24位点或13q22位点的靶向序列结合形成复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在靶位点处剪切双链DNA，引入DNA双链断裂)；

2)在上述sgRNA双链DNA序列的正义链左端连接CAACCG，同时在反义链两端连接AAACNNNC，其中，NNN代表sgRNA的反义链序列；将sgRNA双链DNA制备成双链引物，分别将双链引物与pSpCas9(BB)-2A-GFP表达载体通过Bpil限制性核酸酶进行酶切连接，构建得到sgRNA表达质粒；

3)将上述sgRNA表达质粒分别转染靶细胞，通过T7E1实验筛选有效的sgRNA打靶质粒(该sgRNA打靶质粒能特异性的高效识别并靶向切割8q24或13q22位点处的特定基因序列)；

4)运用上述有效的sgRNA打靶质粒与含有高危型人***状瘤病毒HPV基因的线性Donor片段共转染HaCaT细胞，即得到高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型。

进一步地，所述步骤1)中，高危型HPV分别为16型人***瘤病毒(HPV16)或18型人***瘤病毒(HPV18)。

再进一步地，所述高危型HPV为HPV16且HPV基因整合位点为13q22位点时，sgRNA序列为：TACAGCCACTCACAGCCCGC。

或者，高危型HPV为HPV18且HPV基因整合位点为8q24位点时，sgRNA序列为ACAAATAACTGTAAAGAGTA。

再进一步地，所述步骤2)中，HPV基因整合位点为8q24位点时，双链引物为：

再进一步地，所述步骤3)中，HPV基因整合位点为13q22位点时，sgRNA打靶质粒由CRISPR-Cas9载体和靶向13q22位点的sgRNA的双链DNA组成(能特异性的高效识别并靶向切割13q22位点处的特定基因序列)；

或者，HPV基因整合位点为8q24位点时，sgRNA打靶质粒由CRISPR-Cas9载体和靶向8q24位点的sgRNA的双链DNA组成(能特异性的高效识别并靶向切割8q24位点处的特定基因序列)。

再进一步地，所述高危型人***状瘤病毒HPV为HPV16时，含有高危型人***状瘤病毒HPV16基因的线性Donor片段(根据13q22区域sgRNA的靶向位点，选取CRISPR-Cas9切割位点的上下游500bp基因序列分别作为Donor质粒的left arm 2和right arm2，通过无缝克隆的方法将其与HPV16基因片段和标签基因相连，构建出含有HPV16基因的Donor质粒)由Donor骨架质粒线性化而成，Donor骨架质粒的ad元件下游依次无缝连接有left arm2基因(如SEQ ID No.11所示)、HPV16基因片段、标签基因(SEQ ID No.13)以及right arm2基因(如SEQ ID No.12所示)；其中，

所述HPV16基因片段如SEQ ID No.10所示，包含HPV16的URR基因(1……832bp)、E6(833……1309bp)和E7基因(1310……1606bp)；

或者，所述高危型人***状瘤病毒HPV为HPV18时，含有高危型人***状瘤病毒HPV18基因的线性Donor片段(所述left arm1、right arm 1、left arm 2、right arm 2均为同源臂，根据8q24区域sgRNA的靶向位点，选取CRISPR-Cas9切割位点的上下游500bp基因序列分别作为Donor质粒的left arm 1和right arm 1，通过无缝克隆的方法将其与HPV18基因片段和标签基因相连，构建出含有HPV18基因的Donor质粒)由Donor骨架质粒线性化而成，Donor骨架质粒的ad元件下游依次无缝连接有left arm1基因(如SEQ ID No.8所示)、HPV18基因片段、标签基因(如SEQ ID No.13)以及right arm1基因(如SEQ ID No.9所示)，其中，

所述HPV18基因片段如SEQ ID No.7所示，包含HPV18的URR基因(1……828bp)、E6(829……1305bp)和E7基因(1306……1623bp)；

所述标签基因的核苷酸序列具体如SEQ ID No.7所示，由CMV启动子(1……347bp)、绿色荧光蛋白(EGFP)基因(351……956bp)、嘌呤霉素基因(PURO)(1059……1658bp)及SV40 PolyA(1687……1846bp)序列组成，可以在整合阳性的细胞中稳定表达嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因，使细胞表现出对嘌呤霉素药物的抗性和绿色荧光；

所述Donor骨架质粒为pDC515(上述线性Donor片段是由特异性PCR引物扩增而成，线性Donor片段与上述的打靶质粒共转染细胞)；

再进一步地，所述步骤4)中，转染时，线性Donor片段及sgRNA打靶质粒用转染试剂(PEI)进行包裹，线性Donor片段与sgRNA打靶质粒的总质量与转染试剂之间的比例为1:3(μg:μg)，线性Donor片段与sgRNA打靶质粒之间的质量比1:1。

本发明还提供了一种上述的HaCaT细胞模型，所述细胞为HaCaT细胞。

本发明的有益效果：

本发明根据13q22及8q24区域基因序列设计出一系列靶向性sgRNA序列，经过体外活性检测后，筛选出具有高效切割活性的sgRNA，将其配对后构建到CRISPR/Cas9载体得到13q22及8q24位点打靶质粒，该打靶质粒在细胞内具有良好的基因编辑活性。

本发明根据8q24位点打靶质粒靶向的基因位置及HPV18基因序列，设计合成了HPV18 E6、E7、URR基因的DNA片段、left arm1、right arm1以及标签基因构建到Donor骨架质粒，得到HPV18Donor质粒；根据13q22位点打靶质粒靶向的基因位置及HPV16基因序列，设计合成了HPV16 E6、E7、URR基因的DNA片段、left arm2、right arm2以及标签基因构建到Donor骨架质粒，得到HPV16 Donor质粒。

本发明用8q24位点打靶质粒和HPV18线性Donor片段共转染细胞，在Donor两端的同源臂序列只有500bp的条件下，成功将含有HPV18基因的3.5kb长度的外源DNA敲入细胞基因组8q24位点，随后进行单克隆细胞筛选实验，最终获得了HPV18基因在8q24位点敲入的单克隆细胞，成功构建了HPV18基因定点整合的HaCaT细胞模型。本发明用13q22位点打靶质粒和HPV16线性Donor片段共转染细胞，成功将包含HPV16基因的3.5kb长度的外源DNA敲入细胞基因组13q22位点，随后进行单克隆细胞筛选实验，最终获得了HPV16基因在13q22位点敲入的单克隆细胞，成功构建了HPV16基因定点整合的HaCaT细胞模型。

本发明运用HPV定点敲入的方法研究HPV对正常上皮细胞的影响，弥补了现有HPV研究方法的不足。两种不同高危型HPV在基因组不同高频整合位点的定点敲入，为探索高危型HPV整合与***发病关系提供了模型基础。本发明首次将HPV的URR基因作为重要研究对象，有望揭示HPV致病的另外一个关键基因，为HPV整合致癌的分子机制提供新的发现。本发明将HPV阴性的正常上皮细胞作为细胞载体构建HPV基因定点整合的细胞模型，此种细胞模型能够较为近似的模拟正常的上皮细胞内HPV从整合到最终引起细胞恶变的生物学过程，为探索HPV基因定点整合在正常上皮细胞恶性转化中的作用以及HPV整合致癌的发病机制提供了研究平台。

第三方面，本发明要求保护所述细胞模型在如下任一中的应用：

通过所述细胞模型评价待测物(如特定化合物、提取物、小分子、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)对肿瘤生长等疾病进程的影响；

将待测物(如特定化合物、提取物、小分子、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)靶向所述细胞模型从而评价所述待测物的生物安全性及有效性；通过或借助所述细胞模型建立新的细胞或动物模型。

实验证明，使用正常人上皮细胞HaCaT(该细胞为HPV阴性)，通过采用CRISPR/Cas9技术将HPV18基因片段敲入8q24位点，可促进HaCaT细胞的生长增殖能力，同时，通过采用CRISPR/Cas9技术将HPV16基因片段敲入13q22位点，也可以促进HaCaT细胞的生长增殖能力。运用本发明所提供的这种通过CRISPR/Cas9技术将HPV基因片段敲入基因组高频整合位点的方法，有望促使HPV定点整合介导的细胞恶性转化，进一步揭示HPV定点整合与***发病之间的必然关系。

附图说明

图1为运用CRISPR/Cas9技术实现HPV基因定点敲入的模式图；

图2为阳性单克隆细胞筛选流程；

图3为8q24位点3条sgRNA的切割效率验证；

图4为13q22位点3条sgRNA的切割效率验证；

图5为含有HPV18基因的Donor质粒图谱；

图6为含有HPV16基因的Donor质粒图谱；

图7为琼脂糖凝胶电泳结果显示8q24位点HPV敲入不同单克隆的PCR验证结果；

图8为8q24位点HPV敲入阳性单克隆的代表性荧光结果；

图9为8q24位点HPV18基因定点敲入的HaCaT细胞的代表性克隆形成结果；

图10为琼脂糖凝胶电泳结果显示13q22位点HPV敲入不同单克隆的PCR验证结果；

图11为13q22位点HPV敲入阳性单克隆的代表性荧光结果；

图12为13q22位点HPV16基因定点敲入的HaCaT细胞的代表性克隆形成结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

本实施例中，商品和药品来源如下：

1.sgRNA表达载体pSpCas9(BB)-2A-GFP购自Addgene公司(货号：PX458)；

2.sgRNA的序列由在线设计软件(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计完成，如无特殊说明，所使用的引物均由Primer3 Plus在线引物设计工具(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计完成，引物合成以及测序由武汉擎科生物科技有限公司完成；

3.Donor质粒的构建和测序由上海和元生物有限公司完成；

4.构建所使用的Bpil限制性内切酶(货号:FD1014)和T4 DNA连接酶(货号:EL0011)购自美国Thermo Scientific公司；

5.T7 Endonuclease I购自Biolabs公司(货号：0041708)；

6.X-treme GENE HP DNA Trasnfection Reagent(货号：06366236001)购自Roche公司；

7.PCR扩增相关试剂购自南京Vazyme公司(货号：P131-AA)；

8.质粒提取试剂盒(D6926-01)、DNA提取试剂盒(D3396-02)；

9.PCR产物回收试剂盒(D6492-01)和DNA切胶回收试剂盒(D2500-01)购自Omega公司。

实施例1 sgRNA打靶质粒的构建和sgRNA筛选

1.sgRNA表达载体的构建

(1)设计并合成sgRNA引物

选取文献中报道频率最高的HPV整合位点，13q22和8q24。参考人***细胞系HeLa中的HPV18整合位点，在UCSC(http://genome.ucsc.edu/)网站上下载人基因组8q24位点128230508-128230757区域共250bp的序列，运用在线软件(https://zlab.bio/guide-design-resources)设计sgRNA，挑选评分最高的前三条，并得到sgRNA序列双链DNA，如Table 1。

在sgRNA双链DNA序列的正义链左端连接CAACCG，同时在反义链两端连接AAACNNNC(NNN代表sgRNA的反义链序列)，以便与pSpCas9(BB)-2A-GFP表达载体进行Bpil酶切连接，合成相应正向及反向引物，如Table 2。

Table 2

同样，参考HPV16在***细胞系SiHa中的整合位点，在UCSC网站上下载包含整合位点在内的附近250bp序列信息，按照上述方法设计sgRNA，得到sgRNA双链DNA，入Table 3，并合成相应正向及反向引物，如Table 4。

Table 3

Table 4

(2)引物退火形成带粘性末端的双链DNA片段

向合成好的sgRNA上下游引物中加入规定体积的超纯水配制工作液，并分别取相同体积配成10mM的混合液。置于95℃水浴锅中加热5min，然后室温中冷却，产物于-20℃保存。

(3)线性化表达载体的制备

用限制性内切酶Bpil对sgRNA表达载体进行酶切，反应体系如下：

于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并在凝胶成像仪的显像下，切割目的条带，用Omega Agarose Gel DNA Extraction KitVer.3.0试剂盒做胶回收。

(4)sgRNA片段与表达载体的连接

连接反应体系如下：

于16℃反应过夜。

(5)感受态细胞的转化

取出-80℃冰箱中冻存的T1感受态细胞，迅速放冰上使其融化；在通风厨中用枪头吸取50μL T1感受态细胞加入新的EP管中，用小枪头吸取1μL连接后产物，混匀后，冰上静置30min；将上述EP管放于42℃水浴锅中30s；迅速取出，插于冰上，静置2min；在通风橱中添加450μL的LB培养基，并混匀；放于37℃恒温细菌摇床以中250rpm/min的转速摇菌1h；取2μL上述菌液涂于氨苄霉素抗性的LB培养板中，摇匀后倒扣于37℃的细菌培养箱中过夜。

(6)菌落测序鉴定

在通风橱中用灭菌小枪头挑取生长良好的单克隆小菌落，重悬于10μl LB培养液中，交由擎科生物进行测序鉴定，比对分析测序结果，选取正确的克隆菌液摇菌，并用Omega试剂盒提取质粒备用。

2.sgRNA切割效率的验证

(1)细胞培养

取对数期生长的HaCaT细胞，常规0.25％胰酶消化，接种到6孔板中，每孔种植细胞量约5×10⁵个，继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。

(2)质粒转染

6孔板中细胞融合度达80％左右时转染，每孔转染2μgsgRNA质粒，并按照1μL X-treme GENE HP DNA Trasnfection Reagent：1μg质粒的比例进行转染，具体步骤参见说明书。

(3)提取DNA.转染48小时后，常规0.25％的胰酶消化，用DMEM完全培养基终止消化，收集细胞到离心管中，1200rpm离心5分钟，弃除培养基，PBS洗涤一次，再次1200rpm离心5分钟，弃除PBS，获得细胞渣，使用DNA提取试剂盒(OMEGA)提取细胞基因组DNA。

(4)PCR反应

将上述DNA进行基因组13q22位点和8q24位点的PCR反应，反应体系和反应条件参如下：

引物如下：

13q22-F：GGTTTCAAACACTGCCAAAA，

13q22-R：TCACCCTCTCACCCTACACC；

8q24-F：GGCACAAAGATGTTCATTTAAGC，

8q24-R：GGCATGATGCTCTCTTGAAA；

将上述PCR产物运用DNA切胶回收试剂盒进行切胶回收。

(5)T7E1酶切实验

将上述PCR产物进行如下反应：

反应条件：95℃5min变性，95℃-85℃以2℃/sed的速度退火，85℃-25℃以0.1℃/sed的速度退火，4℃forever。

上述反应结束后向以上PCR小管中各加入1μL T7E1酶，轻柔混匀后37℃反应30min。

(6)DNA电泳

准备TBE凝胶，将上述酶切产物分别取等量体积依次点入TBE凝胶的孔道中，放入含有TBE缓冲液的电泳槽中，120V的恒压下电泳30min；取出凝胶，放置于凝胶成像仪中检测目的条带。有效的sgRNA将会切割目的基因片段成为两个大小不一的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳图中显示出多个不同大小的条带。

图3和图4的结果显示：确定8q24位点的sgRNA2和13q22位点的sgRNA3分别为有效的sgRNA：

8q24-sgRNA2：ACAAATAACTGTAAAGAGTA，

13q22-sgRNA3：TACAGCCACTCACAGCCCGC；

并得到其对应的有效的sgRNA打靶质粒，保存，用于制备HaCaT细胞模型。

实施例2.含有HPV基因的线性Donor片段的制备

(1)HPV 18基因的Donor质粒以及HPV16基因的Donor质粒均由上海和元生物技术公司合成构建(如图5～6所示)；其中，含有高危型人***状瘤病毒HPV18基因的Donor质粒(根据8q24区域sgRNA的靶向位点，选取CRISPR-Cas9切割位点的上下游500bp基因序列分别作为Donor质粒的left arm 1和right arm 1，通过无缝克隆的方法将其与HPV18基因片段和标签基因相连，构建出含有HPV18基因的Donor质粒)由left arm1(如SEQ ID No.8所示)、HPV18基因片段、标签基因以及right arm1(如SEQ ID No.9所示)构建到Donor骨架质粒的ad元件下游而成；

所述HPV18基因片段如SEQ ID No.7所示，包含HPV18的URR基因、E6和E7基因；

含有高危型人***状瘤病毒HPV16基因的Donor质粒(根据13q22区域sgRNA的靶向位点，选取CRISPR-Cas9切割位点的上下游500bp基因序列分别作为Donor质粒的left arm2和right arm2，通过无缝克隆的方法将其与HPV16基因片段和标签基因相连，构建出含有HPV16基因的Donor质粒)由left arm2(如SEQ ID No.11所示)、HPV16基因片段、标签基因以及right arm2(如SEQ ID No.12所示)依次构建到Donor骨架质粒的ad元件下游而成；其中，

所述HPV16基因片段如SEQ ID No.10所示，包含HPV16的URR基因、E6和E7基因；

所述标签基因的核苷酸序列具体如SEQ ID No.13所示，由CMV启动子、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、嘌呤霉素基因(PURO)及SV40 PolyA序列组成；

(2)线性化Donor片段的制备

以上述HPV18基因的Donor质粒为模板进行PCR反应，反应体系和反应条件同实施例1，引物如下：

8-F：ATTCAGAAGAAGAAAAAAAGAATC，

8-R：GTGTATATATATATATACACACACACATATATAAAATC；

以上述HPV16基因的Donor质粒为模板进行PCR反应，引物如下：

13-F：CTTACAATTTGTCTTGTTTTTCAAATTC，

13-R：ATCTTTTTTAACTTCTGAATACTATCAG；

(3)将上述PCR产物进行一代测序，验证正确后运用PCR产物回收试剂盒进行纯化回收。

实施例3高危型HPV18基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备

(1)sgRNA质粒与线性Donor片段的共转染

使用实施例获得的8q24-sgRNA2对应的sgRNA打靶质粒以及实施例2获得的线性HPV18基因Donor片段转染细胞，取对数期生长的HaCaT细胞，消化接种于6孔板中，待细胞融合度达80％左右时转染，每孔转染(1μg sgRNA+1μg Donor)，具体步骤参见说明书。

(2)细胞的药筛流式分选

转染后24h，根据标签基因的表达情况，在荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光确定转染效率，然后将细胞培养基更换为含有50μM嘌呤霉素的完全培养基，每1-2天更换一次，维持2周，之后更换为含有25μM嘌呤霉素的完全培养基，每3天更换一次，继续维持2周，在长期的药物压力作用下，对转染的细胞进行筛选，同时富集整合阳性的细胞。

(3)荧光流式分选

用胰酶消化细胞，收集后室温下以800rpm/min的转速离心5min；弃上清，用500μl无菌的细胞用PBS重悬，运用流式上样管过滤细胞悬液，转备上机；由实验室专业技术人员设置分选仪器的参数，将荧光表达阳性的细胞按照单克隆细胞的形式收集到加有嘌呤霉素培养基的96孔板中，连续培养3-4周。

(4)单克隆的PCR鉴定

待上述96孔板中的单克隆细胞扩增到适当密度后，在荧光显微镜下挑选荧光表达阳性的单克隆。将单克隆细胞从96孔板消化接种到12孔板中，等待细胞增殖到一定数量后收集一部分细胞，提取DNA做PCR鉴定。针对人类基因与HPV18基因的融合序列设计特异性引物，以上述DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察有无目的条带，并交由擎科生物进行一代测序验证。

8q24位点的4对引物：

正向引物(F1)：TCCCTGTAGCTGGGGAGAAA，

反向引物(R1)：CACTAGGGCGCAACCACATA；

正向引物(f1)：GCAACCTCCCCTTCTACGAG，

反向引物(r1)：GCCACTTACCAGGTTGGGTA

如图7所示：整合阳性的克隆在相应引物的扩增下电泳显示单一大小的目的条带，而阴性对照组无相应大小目的条带。图8代表8q24位点整合阳性的单克隆细胞荧光图。

实施例4高危型HPV16基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备

此步骤同实施例3，不同之处在于：

使用实施例1获得的13q22-sgRNA3对应的sgRNA打靶质粒以及实施例2获得的线性HPV16基因Donor片段转染细胞。此步骤所用PCR引物如下：

13q22位点的4对引物：

正向引物(F1)：AAATGTGTCTCTTGTGAAGAATGC，

反向引物(R1)：ACAAGCAGAACCGGACAGAG；

正向引物(f1)：TGCCTGATCGATAATCAACCT，

反向引物(r1)：ACAGCTGAGATGAGCCAACC；

如图10所示：整合阳性的克隆在上述引物的扩增下电泳显示单一大小的目的条带，而阴性对照组无相应大小目的条带。图11代表13q22位点整合阳性的单克隆细胞荧光图。

实施例5.HPV定点整合对细胞生长增殖的影响

(1)取对数生长期的HPV定点整合的HaCaT细胞以及未做处理的HaCaT细胞，消化后计数，接种于6孔板，每孔500个细胞，加入完全培养基后轻摇混匀使细胞均匀铺于孔板中；

(2)每3天更换一次培养基，大概培养10-14天；待细胞长处大小均匀、密度适中的克隆后，吸弃培养基，PBS溶液轻柔洗1次；

(3)用4％的多聚甲醛溶液固定细胞：孵育时间为15min；

(4)用PBS溶液清洗3次，每次5min；

(5)用结晶紫染色，时间为15min，后用PBS冲洗3次，去掉未染色的结晶紫；

(6)通风处晾干后，用扫描仪将孔板进行扫描。

如图9所示：HPV18基因在8q24位点整合阳性细胞的克隆形成个数明显多于对照细胞，说明HPV18基因在8q24位点的整合促进了HaCaT细胞的生长增殖能力；

如图12所示：HPV16基因在13q22位点整合阳性细胞的克隆形成个数明显多于对照细胞，说明HPV16基因在13q22位点的整合促进了HaCaT细胞的生长增殖能力。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120> 靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人***瘤病毒16型(Papillomavirus 16)

<400> 1

tacagccact cacagcccgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人***瘤病毒18型(Papillomavirus 18)

<400> 2

acaaataact gtaaagagta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 3

acaaataact gtaaagagta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 4

tactctttac agttatttgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 5

tacagccact cacagcccgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 6

gcgggctgtg agtggctgta 20

<210> 7

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人***瘤病毒18型(Papillomavirus 18)

<400> 7

taatatgtgt gtgtgtatat atatatacat ctattgttgt gtttgtatgt cctgtgtttg 60

tgtttgttgt atgattgcat tgtatggtat gtatggttgt tgttgtatgt tgtatgttac 120

tatatttgtt ggtatgtggc attaaataaa atatgttttg tggttctgtg tgttatgtgg 180

ttgcgcccta gtgagtaaca actgtatttg tgtttgtggt atgggtgttg cttgttgggc 240

tatatattgt cctgtatttc aagttataaa actgcacacc ttacagcatc cattttatcc 300

tacaatcctc cattttgctg tgcaaccgat ttcggttgcc tttggcttat gtctgtggtt 360

ttctgcacaa tacagtacgc tggcactatt gcaaacttta atcttttggg cactgctcct 420

acatattttg aacaattggc gcgcctcttt ggcgcatata aggcgcacct ggtattagtc 480

attttcctgt ccaggtgcgc tacaacaatt gcttgcataa ctatatccac tccctaagta 540

ataaaactgc ttttaggcac atattttagt ttgtttttac ttaagctaat tgcatacttg 600

gcttgtacaa ctactttcat gtccaacatt ctgtctaccc ttaacatgaa ctataatatg 660

actaagctgt gcatacatag tttatgcaac cgaaataggt tgggcagcac atactatact 720

tttcattaat acttttaaca attgtagtat ataaaaaagg gagtaaccga aaacggtcgg 780

gaccgaaaac ggtgtatata aaagatgtga gaaacacacc acaatactat ggcgcgcttt 840

gaggatccaa cacggcgacc ctacaagcta cctgatctgt gcacggaact gaacacttca 900

ctgcaagaca tagaaataac ctgtgtatat tgcaagacag tattggaact tacagaggta 960

tttgaatttg catttaaaga tttatttgtg gtgtatagag acagtatacc ccatgctgca 1020

tgccataaat gtatagattt ttattctaga attagagaat taagacatta ttcagactct 1080

gtgtatggag acacattgga aaaactaact aacactgggt tatacaattt attaataagg 1140

tgcctgcggt gccagaaacc gttgaatcca gcagaaaaac ttagacacct taatgaaaaa 1200

cgacgatttc acaacatagc tgggcactat agaggccagt gccattcgtg ctgcaaccga 1260

gcacgacagg aacgactcca acgacgcaga gaaacacaag tataaatgca tggacctaag 1320

gcaacattgc aagacattgt attgcattta gagccccaaa atgaaattcc ggttgacctt 1380

ctatgtcacg agcaattaag cgactcagag gaagaaaacg atgaaataga tggagttaat 1440

catcaacatt taccagcccg acgagccgaa ccacaacgtc acacaatgtt gtgtatgtgt 1500

tgtaagtgtg aagccagaat tgagctagta gtagaaagct cagcagacga ccttcgagca 1560

ttccagcagc tgtttctgaa caccctgtcc tttgtgtgtc cgtggtgtgc atcccagcag 1620

taa 1623

<210> 8

<211> 500

<212> DNA

<213> 人(homines)

<400> 8

attcagaaga agaaaaaaag aatctaagtt gaatttttaa aacctgatat gtccctgagg 60

actgaatggc acatggtaat aagaataacc ctaatagtaa cttcaattta gctagcagca 120

tacgaggaga caggcccact cattcactcc cagtcagaat gtaaattgtt ataacccctt 180

tggaagacaa tttggcaata tgactgcaga acctcaaaaa tattcatatg ctatgaccca 240

gtcattccaa ttttgggaag ctagcctaag gaaataatcg aaaataggca caaagatgtt 300

catttaagca tgatttataa taatgaaaaa ttggatttat aatggctaca aattgaaaac 360

agtcttaatt actagaaata ggtgaatgtt taactaaatt ataataaatc catatgatgt 420

aacacatagc cattgaaaac aatatttaca gttactgatg atgggggaag aaatttaaga 480

tgcacaaata actgtaaaga 500

<210> 9

<211> 500

<212> DNA

<213> 人(homines)

<400> 9

gtaagggtcc aaaataaata aaaaggataa cccccaaaat gtaagtatac aaagaaacca 60

tgatgtttga aagtatatgt gttaaagtgt taacagaaag taaagatctt taggacatga 120

gatatgagtg ttttaaaaaa atttttttct ttacaattag aaaaggtcat aaaaatatac 180

acaatgaaaa acataaattt tataaccaga caaaaacttt aataatattt gtcaaatgcc 240

aaatcggagt ccaaagccat tgtccatttt aagaaaatca tctgacttaa catcactact 300

gcttttcaag agagcatcat gcccatttca cagaagagaa aatttggcct catactcctc 360

agtctccatg ttttagctta gatattgttt cctccaggcg gccctccttg accttccaat 420

tctggttaaa ttgctctttt tctgagttct cattacttta ctgattttat atatgtgtgt 480

gtgtatatat atatatacac 500

<210> 10

<211> 1606

<212> DNA

<213> 人***瘤病毒16型(Papillomavirus 16)

<400> 10

gtattgtatg tatgttgaat tagtgttgtt tgttgtgtat atgtttgtat gtgcttgtat 60

gtgcttgtaa atattaagtt gtatgtgtgt ttgtatgtat ggtataataa acacgtgtgt 120

atgtgttttt aaatgcttgt gtaactattg tgtcatgcaa cataaataaa cttattgttt 180

caacacctac taattgtgtt gtggttattc attgtatata aactatattt gctacatcct 240

gtttttgttt tatatatact atattttgta gcgccaggcc cattttgtag cttcaaccga 300

attcggttgc atgctttttg gcacaaaatg tgttttttta aatagttcta tgtcagcaac 360

tatggtttaa acttgtacgt ttcctgcttg ccatgcgtgc caaatccctg ttttcctgac 420

ctgcactgct tgccaaccat tccattgttt tttacactgc actatgtgca actactgaat 480

cactatgtac attgtgtcat ataaaataaa tcactatgcg ccaacgcctt acataccgct 540

gttaggcaca tatttttggc ttgttttaac taacctaatt gcatatttgg cataaggttt 600

aaacttctaa ggccaactaa atgtcaccct agttcataca tgaactgtgt aaaggttagt 660

catacattgt tcatttgtaa aactgcacat gggtgtgtgc aaaccgattt tgggttacac 720

atttacaagc aacttatata ataatactaa actacaataa ttcatgtata aaactaaggg 780

cgtaaccgaa atcggttgaa ccgaaaccgg ttagtataaa agcagacatt ttatgcacca 840

aaagagaact gcaatgtttc aggacccaca ggagcgaccc agaaagttac cacagttatg 900

cacagagctg caaacaacta tacatgatat aatattagaa tgtgtgtact gcaagcaaca 960

gttactgcga cgtgaggtat atgactttgc ttttcgggat ttatgcatag tatatagaga 1020

tgggaatcca tatgctgtat gtgataaatg tttaaagttt tattctaaaa ttagtgagta 1080

tagacattat tgttatagtt tgtatggaac aacattagaa cagcaataca acaaaccgtt 1140

gtgtgatttg ttaattaggt gtattaactg tcaaaagcca ctgtgtcctg aagaaaagca 1200

aagacatctg gacaaaaagc aaagattcca taatataagg ggtcggtgga ccggtcgatg 1260

tatgtcttgt tgcagatcat caagaacacg tagagaaacc cagctgtaaa tgcatggaga 1320

tacacctaca ttgcatgaat atatgttaga tttgcaacca gagacaactg atctctactg 1380

ttatgagcaa ttaaatgaca gctcagagga ggaggatgaa atagatggtc cagctggaca 1440

agcagaaccg gacagagccc attacaatat tgtaaccttt tgttgcaagt gtgactctac 1500

gcttcggttg tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt actttggaag acctgttaat 1560

gggcacacta ggaattgtgt gccccatctg ttctcagaaa ccataa 1606

<210> 11

<211> 500

<212> DNA

<213> 人(homines)

<400> 11

cttacaattt gtcttgtttt tcaaattcta ttctgttctt ttaggaataa tattggaaat 60

ttttctttcg tttcagaaga catgatcttt atattttgat aaggtataat atactactgt 120

gttcatgaag ccaaggcaca gtcgtgaatt taacaacaac aacaacaagt atgtaggttt 180

caaacactgc caaaatataa atcatttgtc tgatggctga aagaaatcct aaactctttc 240

ctttatatgg tttttgtctt gcgatatgct tgttaagtca tgaaaacact ataactattt 300

ctcacaaatg gatttaacaa caggtttcct ctcttttctt atttgtttct catttgcacc 360

tttcccaccg tgtctggatg tgtttctggc ttccagtttt ctacagattc tagatggagc 420

gccctctctt tgttccctga cttctccctt acaggtcttc tctcaggtag caacagaggt 480

gtatacagcc actcacagcc 500

<210> 12

<211> 500

<212> DNA

<213> 人(homines)

<400> 12

cgcaggctct agcaactaaa acaaagaaac aattatgctt ttacattaga gatgtttaat 60

aaacaaagaa aaataaagct cagagacttg gatggaggtg tagggtgaga gggtgagatt 120

tttaaagttc acagaacctt tcctaaacaa tcagagagac caatatcact actggctttt 180

gttttgtttt gttttgtttt tttgtttgtt tgtttttgta ttgccccacc tccctgtgct 240

gttggattcc ccatatattt acttggtttt cacatcccat caggtatccc tggtctaaag 300

aattctatgc tgcgacttac tcaagagctg tctggtgatg ttacaacata actcaaattt 360

tccattgctc aatgagaaac attttttaga agtcactgtg agaattgaaa tggaagttgt 420

gggtacacag gagccctagg aagagacttc tttttagata ctctccatat atctgatagt 480

attcagaagt taaaaaagat 500

<210> 13

<211> 1846

<212> DNA

<213> 质粒G5797(G5797)

<400> 13

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagatt gccacctacg 360

gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 420

tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 480

agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 540

tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 600

tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 660

agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg 720

gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 780

accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 840

acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 900

tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagaaaa 960

ttgtcgctcc tgtcaaacaa actcttaact ttgatttact caaactggct ggggatgtag 1020

aaagcaatcc aggtccacta gcgctaccgg acgccaccat gaccgagtac aagcccacgg 1080

tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1140

ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1200

agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1260

acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1320

tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1380

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1440

tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1500

tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1560

tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1620

cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgatc gataatcaac ctctggatta 1680

ctcgacttcg agcaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 1740

cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 1800

catcaatgta tcttatcatg tctggatcgt ctagcatcga agatcc 1846