阅读说明：本技术 一种敲除诱导多能干细胞nans基因的方法和应用 (Method for knocking out NANS gene of induced pluripotent stem cell and application ) 是由 卜迁 岑小波 张华琴 代艳萍 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用,属于细胞模型构建领域。本发明采用电穿孔法将CRIPSR-Cas9基因编辑系统转入iPSC；将含有Puromycin抗性基因和GFP基因的Donor DNA插入NANS外显子,通过Puromycin对基因编辑后干细胞进行筛选；转染后加入CloneR<Sup>TM</Sup>培养细胞,该体系可以大大提高CRISPR-Cas9基因组编辑技术在干细胞中的基因编辑效率。本发明将有助于构建NANS缺陷型的3D大脑类器官模型,可应用于基于NANS突变引起的智力发育障碍发病机制的体外研究和药物研发。(The invention discloses a method for knocking out an induced pluripotent stem cell NANS gene and application thereof, belonging to the field of cell model construction. The CRIPSR-Cas9 gene editing system is transferred into iPSC by an electroporation method; inserting Donor DNA containing Puromycin resistance gene and GFP gene into NANS exon, and screening the gene edited stem cell by Puromycin; after transfection CloneR was added TM When the cell is cultured, the system can greatly improve the gene editing efficiency of the CRISPR-Cas9 genome editing technology in the stem cell. The invention will help to construct NANS-deficient 3D brain organoid models,can be applied to in vitro research and drug research and development of intellectual development disorder pathogenesis caused by NANS mutation.)

一种敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞模型构建领域，具体涉及一种基于CRISPR-CAS9基因编辑技术敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用。

背景技术

智力发育障碍(Intellectual developmental disorders，IDD)，又称为智力低下、精神发育迟滞C Mental Retardation,MR)，是一组以18周岁前起病，认知功能障碍(IQ值<70分)，社会适应能力缺陷为特征的疾病。在学龄前(5岁以下)则表现为语言能力及运动发育迟缓等，又被称为精神发育迟缓(Developmental Delay,DD)。综合征型的智力障碍通常还伴有先天多发畸形(Multiple congenital anomalities,MCA)、特殊面容等。ID/DD的病因复杂，包括环境因素，围产期缺氧及遗传因素，其中遗传性因素占2/3。目前，由于对IDD的发病机制知之甚少，IDD的治疗还十分困难，因此，建立IDD研究和药物评价模型对推动IDD的治疗进展至关重要。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用该平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。大脑类器官是细胞定向诱导分化形成的大脑皮质结构，可一定程度上在体外模拟人类胚胎早期大脑的发育过程和结构特点，并能较好地保持人体特异性基因型和蛋白表达水平，在研究精神疾病的起源和病理学、药物筛选和基因改造方面具有很大潜力。与传统动物研究模型相比，人大脑类器官的出现，缩小了动物大脑与人类大脑物种差距，并为精神疾病的体外研究提供了新的工具。

NANS，也称为唾液酸(磷酸)合酶(SAS)，负责编码N-乙酰神经氨酸9-磷酸合酶(NeuNAc-9-P合酶)，该酶在最常见的唾液酸——N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的初级合成中起关键作用。此外，作为主要唾液酸化底物CMP-Neu5Ac产生途径的关键步骤，NANS还可以影响聚糖的唾液酸化，该修饰可以介导或调节多种生理和病理过程，例如脊椎动物胚胎神经系统的正确建立，炎症和免疫反应途径，某些癌症中的肿瘤发生和转移。最近，有临床研究表明NANS中的双等位基因突变与智力发育障碍(IDD)有关，但机制尚不清楚。通过CRISPR-CAS9技术建立NANS缺陷细胞系，并将该细胞系分化成为大脑类器官，有望建立基于NANS突变引起的智力发育障碍体外疾病模型，以便深入探究基于NANS突变引发智力发育障碍的发病机制，并为携带NANS基因突变的智力发育障碍的患者提供药物筛选工具。

目前尚未见构建基于NANS缺陷大脑类器官的智力发育障碍模型的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是：一种基于CRISPR-CAS9基因编辑技术敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用。

本发明的技术方案如下：

一种sgRNA，其识别序列为TCTCGGCAATGATGAAGCAC。

一种利用CRISPR-CAS9技术敲除iPSC细胞中NANS基因的方法，其特征在于：sgRNA识别序列为TCTCGGCAATGATGAAGCAC。

术语“sgRNA识别序列”指：sgRNA所识别的基因组片段的序列。

如前述的方法，所述方法包括如下步骤：

1)将sgRNA-cas9质粒和线性Donor DNA转染iPSC，培养，筛选成功转染的阳性iPSC；

2)挑取阳性iPSC克隆，通过PCR、测序或蛋白检测进行验证；

步骤1)所述sgRNA-cas9质粒携带sgRNA和Cas9基因；

步骤1)所述Donor DNA的序列为如SEQ ID NO.2所示。

如前述的方法，步骤1)所述转染为电转，电转的条件为：

电压1100V，脉冲宽度30ms，脉冲次数1次。

如前述的方法，使用转染系统，电转缓冲液为E buffer。

如前述的方法，步骤1)电转结束后，将细胞加入到含10％CloneR^TM的mTeSR^TM1培养基中进行培养。

如前述的方法，步骤2)中PCR的引物序列如SEQ ID NO:9～12所示，其中SEQ IDNO:9～10为鉴定野生型的引物；SEQ ID NO:11～12为鉴定突变型的引物。

前述方法制备得到的细胞。

一种制备NANS敲除的大脑类器官的方法，其特征在于：它是用前述的细胞诱导分化出大脑类器官。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明利用CRISPR/Cas9系统从iPSC细胞中敲除NANS基因，操作简便，效果完整而彻底。通过改造和优化CRISPR/Cas9基因组编辑技术，将抗性基因Puromycin N-acetyl-transferase和GFP蛋白共同表达在载体上，通过Puromycin对基因编辑后干细胞进行筛选，可以大大提高CRISPR/Cas9基因组编辑技术在干细胞中的基因编辑效率，并且可以通过GFP直接判断NANS敲除的情况。相比化学或者病毒介导的转染方式，本发明采用电穿孔方式进行转染大大提高了转染效率。在转染后使用CloneR^TM进行保护，提高了干细胞的存活能力和克隆形成能力。优化后的CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作简便、时间缩短、效率提高，为未来干细胞基因组编辑提供了有力工具。

(2)本发明中基于CRISPR/Cas9系统敲除NANS基因的方法，与沉默、敲低、干扰等方法相比，敲除效果更加彻底。

(3)本发明从基因和蛋白水平的检测都证实，NANS已被成功敲除，说明该蛋白已被彻底改变，可能造成NANS功能的彻底丧失，该细胞系已验证可分化成大脑类器官，可用于研究NANS突变对大脑发育的影响，并用于基于NANS突变引起的智力发育障碍药物研发。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为经嘌呤霉素筛选后，表达GFP的阳性细胞的显微观察。

图2为被转染CRISPR打靶载体的突变型细胞基因型鉴定图。

图3为NANS敲除策略以及突变细胞测序结果图。

图4为蛋白免疫印迹检测敲除型细胞株和野生型细胞株的NANS蛋白表达含量差异图。

图5为NANS敲除细胞系分化成大脑类器官。

图6为NANS敲除大脑类器官Vz区结构。

具体实施方式

实施例1:利用CRISPR-CAS9技术敲除iPSC细胞NANS基因的方法

1、sg RNA设计

“sgRNA”，即Single guide RNA,单导向RNA，可在CRISPR-Cas9基因编辑(包括基因敲除敲除)时识别特异性的基因组片段。sgRNA主要可分为2部分，第一部分是与基因编辑靶点附近DNA序列反向互补的序列(所述DNA序列简称“识别序列”)，因靶点不同而不同；第二部分是结合Cas 9酶的序列，为保守序列。在实际应用中，第二部分内置到sgRNA表达载体(本实施例中为商品pCas-Guide载体)中，使用时将第一部分序列的双链形式***到sgRNA表达载体，即可形成完整的可表达sgRNA的基因。

根据Gene Bank中给出的人NANS基因序列(Sequence ID:NM_018946.4)在网站http://crispor.tefor.net/设计7条sg RNA(对应的sgRNA的识别序列分别如SEQ IDNO.1-7所示)。

SEQ ID NO:1为TCTCGGCAATGATGAAGCAC；

SEQ ID NO:2为CCAGCGGCATTGCAGCGGCT；

SEQ ID NO:3为AGCCAAGCGCATGATCCGCA；

SEQ ID NO:4为ATCTCGGCAATGATGAAGCA；

SEQ ID NO:5为AGATCGGCCAGAACCACCAG；

SEQ ID NO:6为GAGATCGGCCAGAACCACCA；

SEQ ID NO:7为CGAGATCGGCCAGAACCACC。

通过筛选最终得到一条有效的sg RNA靶定在NANS的外显子区域上，在NCBI中用blast进行比对，确保其靶序列的唯一性。最终确定的sgRNA的识别序列(SEQ ID NO:1)为：TCTCGGCAATGATGAAGCAC

2、载体构建

本发明提供了所用线性Donor DNA(Origene)，序列为LoxP-EF1A-tGFP-P2A-Puro-LoxP(SEQ ID NO:8)。其中，EF1A是启动子，tGFP是GFP荧光蛋白基因，Puro是Puromycin N-acetyl-transferase基因，P2A是自剪切序列。通过在Cas9位点***Donor DNA可实现NANS敲除，被编辑的细胞可同时表达抗性基因Puromycin N-acetyl-transferase和GFP荧光蛋白，可采用Puromycin对基因编辑后干细胞进行筛选，并且可以通过GFP直接判断NANS敲除的情况。

SEQ ID NO:8

ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAATGGAGAGCGACGAGAGCGGCCTGCCCGCCATGGAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAGTTCGAGCTGGTGGGCGGCGGAGAGGGCACCCCCGAGCAGGGCCGCATGACCAACAAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCACGTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACCCCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACACCAACACCCGCATCGAGAAGTACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCCGCGTGATCGGCGACTTCAAGGTGATGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGATCTTCACCGACAAGATCATCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGCACCCCATGGGCGATAACGATCTGGATGGCAGCTTCACCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGGCGGCTACTACAGCTCCGTGGTGGACAGCCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCACCCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAGGATCACAGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACCCCGGATGCAGATGCCGGTGAAGAAAGAGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT。

pCas-Guide-NANS构建方法如下：

NANS基因1号外显子靶序列(sgRNA的识别序列)的5’端加上BamH I酶切后的碱基G，3’端加上GATCC，再根据碱基互补配对原则，人工合成双链靶序列DNA(包含酶切位点)，与经过BamH I酶切的线性pCas-Guide载体(Addgene)连接，转化后挑取克隆测序分析，从而获得sgRNA表达载体pCas-Guide-NANS。

3、NANS基因敲除细胞系的构建

(1)接种iPSC细胞至70～90％汇合度时准备转染，细胞转染步骤如下：

1)收集对数生长期的iPSC细胞，细胞密度在80％(分化小于10％)。

2)吸弃培养基(6孔板)，用PBS洗两遍，加入1mL TrypLE^TM(Gibco)。37℃孵育约4分钟。

3)吹打混匀后转移至15mL离心管中，每孔再加入1mL的mTeSR^TM1培养基(Stem celltechnologies)收集剩余细胞。

4)300g，20℃离心5分钟。

5)吸弃上清，注意不要碰到细胞沉淀。

6)用PBS洗一遍，1ml PBS重悬细胞。

7)使用自动细胞计数仪进行细胞计数。

8)使用转染系统(ThermoFisher)进行电转，设置电转条件(电压1100V，脉冲宽度30ms,脉冲次数1次)

9)加入3mL电转缓冲液E buffer(ThermoFisher)于反应管中，放置于移液器架上。

10)选择10uL(1×10⁵个)电转体系，R buffer(ThermoFisher)重悬细胞，将细胞密度调整为1×10⁷个/mL，加入不超过1uL(≤10％),浓度约1ug/uL的DNA(载体+donor)，混匀。

11)为移液器插上吸头，吸入10uL重悬细胞(避免气泡)，并将移液器***移液器架。

12)点击开始按钮，完成后将移液器从移液器架上取下来并将细胞打入(悬空，枪尖切勿接触液面)预热的24孔板中，每孔添加有0.5ml含10％CloneR^TM(Stem celltechnologies)的mTeSR^TM1培养基。

13)将培养板置于37℃和5％CO₂的培养箱中。

14)由于刚电转的细胞活力较弱，所以培养一周后再使用嘌呤霉素进行筛选，筛选过程中可在荧光显微镜下观察细胞所带GFP情况来判断阳性细胞比例(图1)，以备挑选单克隆。

(2)单克隆挑选：

1)经嘌呤霉素筛选后的细胞长到70-80％的汇合度，用TyrpLE^TM消化成单细胞，以每孔500个接种于6孔板中，6孔板需提前包被Matrigel(Corning)。

2)细胞接种第一天，采用10％CloneR^TM的mTeSR^TM1培养基进行培养，以增加单个细胞存活能力和克隆形成率，后面每天采用不含CloneR^TM的mTeSR^TM1培养基进行换液，细胞培养一周后可进行单克隆挑选。

3)挑选克隆前，首先用Matrigel包被24孔板，每孔添加0.5ml mTeSR^TM1培养基。

4)在超净台中，于显微镜下，使用20ul移液枪进行克隆刮取，克隆一半用于基因型鉴定，另外一半用于培养。

5)鉴定后，将阳性克隆进行扩大培养。

(3)细胞基因组提取：将贴壁细胞处理为细胞悬液，以300g离心5分钟，弃尽上清，使用QuickExtract^TM DNA Extraction基因组提取试剂盒(epicentre)，按照试剂盒说明书操作步骤将细胞基因组提取出来。

(4)PCR鉴定：在NANS基因上，设计引物NANS-3F和NANS-3R、NANS-5F和NANS-5R序列如下。PCR产物5F5R用于鉴定突变型，5F3R用于鉴定野生型。

NANS-3F：5’-TGTAATCTTCTACCCTATCCA-3’(SEQ ID NO:9)

NANS-3R：5’-AAGAGGAGGACTCAACCA-3’(SEQ ID NO:10)

NANS-5F：5’-TGTCGGTTCAGAGGGTTTG-3’(SEQ ID NO:11)

NANS-5R：5’-CCACAGGCTTTCAGATGC-3’(SEQ ID NO:12)

使用-T PCR SuperMix(Transgen)，将100ng基因组DNA添加到20μl体系中进行PCR反应。

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；35个循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒；最后72℃终延伸10分钟。

将其中扩增片段大小符合预期的PCR产物回收纯化并进行测序。结果如图2。

(5)基因水平验证：将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定iPSC-2-6为突变体，结果见图3。

(6)蛋白水平验证：在基因水平验证突变细胞株后，用蛋白质免疫印迹进一步验证iPSC-2-6是NANS缺陷型，结果见图4，未检测到NANS蛋白。

通过以上DNA水平以及蛋白水平的验证，证明NANS基因敲除的iPSC细胞构建成功，然后使用iPSC-2-6表示1号外显子突变产生的敲除系。

实施例2:NANS敲除的大脑类器官的构建方法及其应用

使用实施例1中NANS敲除的iPSC细胞，借助STEMdiff^TM((Stem celltechnologies)大脑类器官试剂盒培养大脑类器官，操作如下：

(1)Day 0，当细胞汇合度80％左右，分化比率小于10％时，将在mTeSRTM1中维持培养的人多能干细胞使用TrypLE解离为单细胞悬液，以密度为8000～10000个细胞/孔接种至96孔超低粘附培养板，使用类胚体(EB)形成培养基(EB Seeding Medium)+10μM Rho-kinase抑制剂(ROCKi)培养，每孔100μL培养基。

(2)细胞在EB形成培养基中培养5天，每2天(Day2，Day4)更换为不含ROCKi的EB形成培养基。

(3)5天之后(Day5)，剪掉准备枪尖的枪头，将EBs转移到每孔含有3mL诱导培养基(Induction Medium)的6孔超低粘附培养板中，每孔8-12个EBs。37℃培养2天。

(4)Day7准备剪掉枪尖的枪头，Matrigel提前在2-8℃化冻1-2h,准备包被EB的封口膜，用剪掉枪尖的枪头吸20μL培养基+EB到封口膜上，大概一张封口膜收集12-16个EB。小心吸掉多余培养基，在每个EB上加15μL Matrigel，37℃孵育20-30分钟，用扩张培养基(Expansion Medium)小心将EB吹入低吸附6孔板中，每张膜上的EB放入一个孔，每孔3mL扩张培养基，37℃培养3天。

(5)Day10，扩张培养基被替换为成熟培养基(Maturation Medium)，每孔3mL，并将培养板置于50转/分钟的摇床上，培养在CO2含量5％的37℃恒温培养箱中，培养多于25天。每三天后更换为新鲜成熟培养基。

(6)在分化的第15天采用免疫荧光检测大脑类器官神经前体细胞标志物Sox2的表达，使用共聚焦采集图片。

结果见图5和图6，与对照组相比，NANS敲除的大脑类器官在体积上小于对照组类器官(图5)，并且，通过观察大脑特征结构(Vz区结构，图6标示部分)可以发现，NANS敲除后，Vz区结构发生显著异常(体积变小，形态异常)。表明NANS可以显著影响大脑的发育，该大脑类器官模型可以作为NANS突变引起智力发育障碍的体外研究模型，并且可基于该模型进行药物开发。

综上，本发明使用CRISPR-Cas9技术敲除iPSC细胞中的NANS基因，敲除效果彻底。将本发明的NANS敲除的iPSC细胞分化大脑类器官，可得到智力发育障碍等疾病模型，从而进行此类疾病的药物开发，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都华西海圻医药科技有限公司

四川大学

<120> 一种敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用

<130> GY159-2020P0110175CC

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ccagcggcat tgcagcggct 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

agccaagcgc atgatccgca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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atctcggcaa tgatgaagca 20

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<212> DNA

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agatcggcca gaaccaccag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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gagatcggcc agaaccacca 20

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<212> DNA

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cgagatcggc cagaaccacc 20

<210> 8

<211> 2739

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 60

gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 120

ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 180

ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 240

tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 300

ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac 360

gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct 420

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gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt 540

taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg 600

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agcccctacc tgctgagcca cgtgatgggc tacggcttct accacttcgg cacctacccc 1440

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atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg cacgtgagct tcagctaccg ctacgaggcc 1560

ggccgcgtga tcggcgactt caaggtgatg ggcaccggct tccccgagga cagcgtgatc 1620

ttcaccgaca agatcatccg cagcaacgcc accgtggagc acctgcaccc catgggcgat 1680

aacgatctgg atggcagctt cacccgcacc ttcagcctgc gcgacggcgg ctactacagc 1740

tccgtggtgg acagccacat gcacttcaag agcgccatcc accccagcat cctgcagaac 1800

gggggcccca tgttcgcctt ccgccgcgtg gaggaggatc acagcaacac cgagctgggc 1860

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agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga 1980

cctatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc 2040

gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg 2100

gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc 2160

gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg 2220

gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc 2280

ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag 2340

gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg 2400

ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc 2460

ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc 2520

gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc 2580

tgaaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 2640

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 2700

tcttaataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttat 2739

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

tgtaatcttc taccctatcc a 21

<210> 10

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

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