ABC转运蛋白在农业害螨防治及Bt抗性治理上的应用
阅读说明：本技术 ABC转运蛋白在农业害螨防治及Bt抗性治理上的应用 (Application of ABC transporter in agricultural pest mite control and Bt resistance treatment ) 是由 赵伊英 刘峰 包建红 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了ABC转运蛋白在农业害螨防治及Bt抗性治理上的应用。属于生物技术领域。与现有技术相比,本发明取得的有益效果为：(1)特异性干扰农业害螨专一基因,对高等动物和人类安全；(2)杀螨具有专一性,对非靶标生物安全；(3)对环境无毒无害。(The invention discloses application of ABC transporter in agricultural pest mite control and Bt resistance treatment. Belongs to the field of biotechnology. Compared with the prior art, the invention has the following beneficial effects: (1) the special gene of the agricultural pest mites is specifically interfered, and the agricultural pest mites are safe to higher animals and human beings; (2) the acaricide has specificity and is safe to non-target organisms; (3) is non-toxic and harmless to the environment.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及ABC转运蛋白在农业害螨防治及Bt抗性治理上的应用。
背景技术
农业害螨属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨亚纲，真螨目的小型及微型动物，广泛分布于各种农林作物上，是当今世界农林作物上的主要害虫，其危害主要表现在对棉花、林果、玉米等农作物的危害上。近些年棉田生态环境和农田生态环境也逐步发生了改变，致使害螨连年爆发，成为限制农作物高产优质的关键因子。
多年以来，我国对农业害螨的防治一向以化学防治为主。由于化学杀虫剂的频繁使用，一方面大量误伤天敌，使次要害虫攀升为主要害虫或某些害虫的再度大爆发，另一方面致使害螨的抗药性逐渐增强，迫使增加农药剂量或采用剧毒杀虫剂，严重破坏自然环境，最终招致恶性循环。通常昆虫对某种农药产生抗药性约3-4年，而相比螨类生活周期短，其繁殖能力强、虫口密度高，对某种农药抗药性的产生仅需1-2年，并且可能产生交叉抗性。所以，迫切需要发展新型、安全、高效的方法来控制害螨的危害。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指通过内源性或外源性双链RNA(doublestrand RNA,dsRNA)的介导，能特异性降解相应序列的mRNA，导致靶标基因表达的沉默，产生相应的功能缺失现象。然而，尽管基于RNA干扰的害虫防治新方法具有很大优势，实现基于RNA干扰的害虫有效治理的关键是筛选出合适的对害虫高效致死的靶点。然而，筛选靶标基因合成dsRNA后，可能存在脱靶效应，即沉默了非目标基因；可能为部分沉默；也可能在应用不同方式导入害虫体内后，无沉默效应。可见，筛选出对害虫高效致死的靶点存在一定的难度。
综上，如何提供一种基于RNAi的靶点来实现对农业害螨的防治及Bt抗性治理的是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了ABC转运蛋白作在农业害螨防治及Bt抗性治理上的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
ABC转运蛋白在农业害螨防治及Bt抗性治理上的应用，作用机理为ABC转运蛋白作为RNAi靶点。
优选的，所述RNAi靶点为ABCA1、ABCA2、ABCA7、ABCC16、ABCC17、ABCC18或ABCC22，其编码的蛋白质的氨基酸序列如下：
ABCA1编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
ABCA2编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
ABCA7编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
ABCC16编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
ABCC17编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
ABCC18编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
ABCC22编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述农业害螨为土耳其斯坦叶螨。
优选的，ABC转运蛋白作为RNAi靶点可以降低农业害螨对Cry1Ac活化毒素和Cry2Ab活化毒素的敏感性。
优选的，ABC转运蛋白作为RNAi靶点可以延长农业害螨的发育历期，并降低各发育历期的存活率
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)特异性干扰农业害螨专一基因，对高等动物和人类安全；(2)杀螨具有专一性，对非靶标生物安全；(3)对环境无毒无害。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1步骤(3)合成产物凝胶电泳检测结果图，其中，M为DNAMarker 2000；dsA1、dsA2、dsA7、dsC16、dsC17、dsC18和dsC22分别为土耳其斯坦叶螨dsABCA1、dsABCA2、dsABCA7、dsABCC16、dsABCC17、dsABCC18和dsABCC22；
图2附图为本发明实施例2敏感品系土耳其斯坦叶螨dABCA基因沉默后对Bt活化毒素敏感性测定结果，其中同一毒素处理数据后的不同字母表示差异是否显著(p＜0.05)；
图3附图为本发明实施例2抗性品系土耳其斯坦叶螨dABCA基因沉默后对Bt活化毒素敏感性测定结果，其中同一毒素处理数据后的不同字母表示差异是否显著(p＜0.05)；
图4附图为本发明实施例2敏感品系土耳其斯坦叶螨dABCC基因沉默后对Bt活化毒素敏感性测定结果，其中同一毒素处理数据后的不同字母表示差异是否显著(p＜0.05)；
图5附图为本发明实施例2抗性品系土耳其斯坦叶螨dABCC基因沉默后对Bt活化毒素敏感性测定结果，其中同一毒素处理数据后的不同字母表示差异是否显著(p＜0.05)；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
dsRNA合成试剂盒是HiScribeTM T7 in vitro Transcription Kit(购自Biolabs公司)；未提及的实验方法和试剂为常规实验方法和试剂，在此不再一一赘述。
实施例1土耳其斯坦叶螨dsRNA-ABC的体外合成
(1)土耳其斯坦叶螨ABC基因dsRNA的引物设计
使用Primer5.0分别设计ABCA1、ABCA2、ABCA7、ABCC16、ABCC17、ABCC18和ABCC22基因的dsRNA合成引物，在所设计的dsRNA合成引物前面加T7启动子，并在其后加GG(GG可以增加dsRNA合成量)。具体见表1。
表1土耳其斯坦叶螨ABC基因的dsRNA合成引物
注：引物序列中斜体字母表示T7启动子序列。
(2)土耳其斯坦叶螨dsRNA-ABC模板合成
以ABC基因为模板，用步骤(1)dsRNA合成引物进行PCR扩增。PCR反应体系如表2。
表2 PCR反应体系
试剂
量
10x PCR Buffer(2.5mM)
2.5μL
dNTP Mixture(Mg<sup>2+</sup>Plus)
2.0μL
dsRNA-上游引物(10mM)
1.0μL
dsRNA-下游引物(10mM)
1.0μL
DNA模板
2.0μL
Taq DNA聚合酶(250U)
0.5μL
ddH<sub>2</sub>0
16μL
Total
25μL
扩增条件：94℃预变性1min；94℃30s，65℃30s，72℃40s，5次循环；94℃30s，68℃30s，72℃40s，30次循环，共35次循环；72℃延伸l0min；4℃保存。
(3)土耳其斯坦叶螨dsRNA-ABC的体外合成
以步骤(2)合成的土耳其斯坦叶螨dsRNA-ABC为模板，按照体外dsRNA合成试剂盒(HiScribeTM T7 in vitro Transcription Kit试剂盒)说明书，建立下列反应体系，具体见表3。
表3体外合成反应体系
试剂
量
Nuclease-free water
6μL
NTP Buffer Mix
10μL
Temeplate
2μL
T7 RNA Polymerase Mix
2μL
Total
20μL
取体外合成产物进行凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。
实施例2土耳其斯坦叶螨ABC基因沉默后对Bt活化毒素敏感性分析
(1)实验对象：敏感品系土耳其斯坦叶螨、抗Cry1Ac活化毒素品系土耳其斯坦叶螨和抗Cry2Ab活化毒素品系土耳其斯坦叶螨；
敏感品系土耳其斯坦叶螨，为2010年以来从未喷洒任何农药的继代品系，在盆栽豇豆苗上饲养160代；
抗Cry1Ac活化毒素品系土耳其斯坦叶螨和抗Cry2Ab活化毒素品系土耳其斯坦叶螨是由敏感品系土耳其斯坦叶螨分别经Cry1Ac活化毒素和Cry2Ab活化毒素逐代筛选而来，筛选至18代，抗性指数分别为9.18和20.64。
(2)检测项目：土耳其斯坦叶螨ABCA1、ABCA2、ABCA7、ABCC16、ABCC17、ABCC18、ABCC22基因沉默后对Cry1Ac活化毒素或Cry2Ab活化毒素的敏感性；
(3)实验方法：
(31)将厚度为0.8cm、直径9cm的海绵浸湿置于直径12cm的培养皿中，并在海绵上平铺一张滤纸以便保湿，将新鲜豇豆叶片背面向上平铺于滤纸上，在叶片周围放置浸湿的棉条，并在叶片中间放置两根浸湿棉条(横竖各一根棉条)将叶盘分成四格，制成叶碟；
(32)向叶碟的每格分别挑入4头5-7日龄健康的土耳其斯坦叶螨，首先用微量移液器向5-7日龄土耳其斯坦叶螨分别点滴0.2μL实施例1合成的dsABCA1、dsABCA2、dsABCA7、dsABCC16、dsABCC17、dsABCC18和dsABCC22，CK对照组点滴0.2μL ddH2O。在24h后分别用Cry1Ac活化毒素或Cry2Ab活化毒素LC95致死量点滴虫体，24h后观察虫体死亡情况并统计死亡率，统计72h。每个处理3个生物学重复，每个重复30头土耳其斯坦叶螨，共90头。
(4)实验结果：如图2-5所示。
由图2可知，3条dsABCA沉默ABCA基因都可以降低敏感品系土耳其斯坦叶螨对Cry2Ab活化毒素的敏感性，其中dsABCA1和dsABCA2的作用显著(p<0.05)；而ABCA基因沉默后敏感品系土耳其斯坦叶螨对Cry1Ac的敏感性却无明显变化。总体而言，dsABCA处理后敏感品系土耳其斯坦叶螨后，降低对Cry2Ab的敏感性，其死亡率下降。
由图3可知，dsABCA沉默抗Cry1Ac品系土耳其斯坦叶螨后，其对Cry1Ac的敏感性较对照组无明显变化；而在沉默抗Cry2Ab品系土耳其斯坦叶螨后，能明显降低其对Cry2Ab的敏感性(p<0.05)，导致其死亡率下降。
总体而言，dsRNA-ABCA处理土耳其斯坦叶螨后，都能降低其对Cry2Ab的敏感性，而对Cry1Ac的敏感性无明显变化，说明在dsRNA-ABCA介导的RNA干扰作用可能导致土耳其斯坦叶螨ABCA基因表达不完整或功能缺失，尤其是在与Cry2Ab相关联的解毒代谢方面的功能缺失。
由图4可知，dsABCC处理能降低敏感品系土耳其斯坦叶螨对Cry1Ac的敏感性，其中dsABCC17、dsABCC18和dsABCC22处理后能显著的降低其敏感性(p<0.05)且dsABCC22处理后对敏感性的影响最大。而dsABCC沉默敏感品系土耳其斯坦叶螨后对Cry2Ab的敏感性无明显影响。
由图5可知，dsABCC处理能显著降低抗Cry1Ac品系土耳其斯坦叶螨对Cry1Ac的敏感性，其中dsABCC22处理后对敏感性的影响最大。而dsABCC沉默抗Cry2Ab品系土耳其斯坦叶螨后，其对Cry2Ab的敏感性无明显影响。
总体而言，dsABCC处理后，土耳其斯坦叶螨对Cry1Ac毒素敏感性都表现出显著的降低，其中dsABCC22处理后对毒素敏感性降低的作用最显著，而对Cry2Ab的敏感性却无明显影响。说明在dsRNA-ABCC介导的RNA干扰作用可能导致土耳其斯坦叶螨ABCC基因表达不完整或功能缺失，尤其是在与Cry1Ac相关联的解毒代谢方面的功能缺失。
实施例3 dsRNA-ABC对土耳其斯坦叶螨卵孵化率的影响
(1)实验方法：
挑取20只健康的土耳其斯坦叶螨雌成螨，放进叶碟(制备方法同实施例步骤(31))，每格放1头，任其产卵24h后剔除雌成螨及多余的卵，共留存60粒卵。用微量移液器向每一粒卵滴加0.2μL实施例1合成的dsABCA1、dsABCA2、dsABCA7、dsABCC16、dsABCC17、dsABCC18或dsABCC22。CK对照组滴加ddH2O，置于生化培养箱中培养，观察并统计卵的孵化率及孵化72h后幼螨的存活率。每个处理3个生物学重复，每个重复60粒土耳其斯坦叶螨卵，共180粒。
(2)实验结果：如表4所示。
表4 dsRNA-ABC对土耳其斯坦叶螨卵孵化率的影响
由表4可以看出：不同dsRNA-ABC片段对卵孵化的影响较小，点滴dsRNA-ABC后的孵化率都高于92.22％，虽低于对照组孵化率(95.56％)，但差异不显著。此外，孵化72h后的存活率表明，卵期点滴dsRNA-ABC对土耳其斯坦叶螨幼螨的存活率都高于92.00％，虽对存活有不良影响，但作用不明显。
实施例4 ABC基因沉默后对土耳其斯坦叶螨适合度的影响
(1)实验方法：
向叶碟(制备方法同实施例步骤(31))的每一格挑取1只生长状态相近的健康的5日龄的土耳其斯坦叶螨雌螨，用微量移液器向虫体背部滴加0.2μL实施例1合成的dsABCA1、dsABCA2、dsABCA7、dsABCC16、dsABCC17、dsABCC18或dsABCC22，CK对照组滴加ddH2O，每个处理做3个重复组，每组30头雌成螨。随后将叶盘置于人工气候箱中培养，观察该雌成螨的产卵情况，记录日产卵量和总的产卵量，并将第2-6天的卵轻轻的转移至另一个新的叶碟中作为F1代继续培养。统计F1代卵的孵化数，孵化历期，并将孵化的土耳其斯坦叶螨继续在同样的条件下培养，对其后代的发育历期和寿命进行统计。
(2)实验结果：结果如表5-7所示。
表5对繁殖力的影响
处理
单雌产卵量
雌螨存活时间
日均产卵
CK
248.51±2.20a
28.3±1.20a
8.78±0.05a
dsABCA1
181.75±0.31b
25.42±2.36ab
7.15±0.11bc
dsABCA2
187.99±2.20b
26.33±3.02a
7.14±0.06bc
dsABCA7
194.77±1.30b
24.50±1.50b
7.95±0.15b
dsABCC16
171.12±0.26b
24.17±1.01b
7.08±0.21bc
dsABCC17
199.23±0.06b
26.34±0.69a
7.56±0.22b
dsABCC18
185.55±0.26b
26.17±1.01a
7.09±0.32bc
dsABCC22
154.94±0.26bc
21.43±1.01b
7.23±0.16b
由表5可以看出，不同dsRNA-ABC沉默土耳其斯坦叶螨ABC基因后，都能显著降低其产卵量(p<0.05)，包括日均产卵量和单雌产卵量；此外，dsABCA7、dsABCC16和ABCC22还能降低雌螨存活时间(p<0.05)。
表6对其后代发育历期的影响
由表6可以看出，就不同螨态发育历期而言，dsRNA-ABC处理后能延长其F1代的卵期和若Ⅱ期，却缩短了幼螨期和若Ⅰ期的发育历期(除dsRNA-ABCA2)，但差异都不显著(p<0.05)；就整体而言，dsRNA-ABC延长了自卵至成螨的发育历期，尤其是dsRNA-ABCA2(p<0.05)。
表7对后代存活的影响
处理
卵
幼螨-若螨
若螨-若螨
若螨-成螨
幼螨-成螨
CK
99.89±0.10a
98.98±0.10a
97.78±0.28a
99.00±1.00a
94.67±1.50a
dsABCA1
99.67±0.58a
97.67±0.58a
97.67±1.15a
96.67±1.53a
88.00±1.00b
dsABCA2
96.33±1.15a
96.33±1.15a
96.67±2.08a
96.33±1.08a
84.33±1.03bc
dsABCA7
98.67±1.31a
98.67±0.31a
97.00±1.02a
97.00±2.52a
88.33±1.23b
dsABCC16
98.00±0.10a
97.46±0.10a
96.45±0.21a
96.80±1.01a
86.57±1.50b
dsABCC17
96.67±0.38a
96.64±0.18a
95.87±1.25ab
97.53±0.43a
86.00±0.54b
dsABCC18
97.33±0.15a
98.33±1.05a
96.46±1.08ab
96.33±2.08a
87.33±0.62b
dsABCC22
98.67±0.31a
97.52±2.31a
97.00±1.00a
98.00±0.52a
83.33±0.89bc
由表7可以看出，不同dsRNA-ABC处理后对其F1代卵的孵化表现有不良影响(p<0.05)，降低了F1代卵的孵化率；同时也能降低F1幼螨在各发育历期内的存活率，显著降低整个发育期的存活率(p<0.05)。说明dsRNA-ABC在处理雌成螨时导致的ABC基因沉默现象也会对F1代的生长发育有不良影响,从而导致适合度的补偿代价。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 石河子大学
<120> ABC转运蛋白在农业害螨防治及Bt抗性治理上的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Arg Lys Gln Leu Ile Pro Leu Asn Ile Gly Arg Val Asn Leu Thr
1 5 10 15
Asp Lys Thr Asn Thr Leu Ala Cys Asn Leu Ser Gly Gly Met Arg Arg
20 25 30
Arg Leu Gln Leu Ala Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Glu Thr Leu Ile
35 40 45
Leu Asp Glu Pro Thr Ser Gly Leu Asp Pro Glu Ser Arg Arg Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Leu Leu Leu Glu Leu Arg Lys Asp Leu Ser Ile Leu Leu Thr
65 70 75 80
Thr His Phe Met Glu Glu Ala Asp Ala Leu Gly Asp Arg Ile Val Ile
85 90 95
Met Ala Ser Gly Lys Ile Lys Cys Ser Gly Ser Pro Met Phe Leu Lys
100 105 110
His Arg Phe Gly Ala Gly Asn Ser Ile Arg Ile Ala Lys Asn Gly Ala
115 120 125
Lys Phe Asp Asn Ala His Leu Leu Glu Leu Met Lys Ala His Phe Pro
130 135 140
Ser Ala Val Ala Ile Asn Glu Thr Asp Glu Glu Ile Ile Tyr Gln Ile
145 150 155 160
Ser Ala Gly Ile Asn Ser Lys Ala Asp Val Pro Thr Ala Thr Leu Ala
165 170 175
Gln Leu Cys Asp Ser Leu Asp Lys Asn Ser Asn Ala Leu Gly Ile Thr
180 185 190
<210> 2
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Leu Leu Gly Glu Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Met Ser Ile
1 5 10 15
Ile Ile Gly Leu Ile Pro Pro Thr Ser Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly
20 25 30
His Asp Ile Leu Glu Glu Thr Ala Asp Ala Arg Arg Asn Leu Ser Phe
35 40 45
Cys Pro Gln Ala Asn Val Leu Gln Pro Glu Leu Ser Val Glu Asn His
50 55 60
Leu Met Leu Tyr Gly Ala Ile Lys Gly Val Pro Met Ser Lys Leu Ser
65 70 75 80
Asp Glu Val Thr Arg Ile Val Glu Asp Ile Lys Leu Asn Asn Phe Arg
85 90 95
His Leu Lys Pro Asn Ser Leu Ser Gly Gly Met Arg Arg Arg Leu Asn
100 105 110
Leu Gly Ile Ala Leu Ile Gly Asp Ser Glu Ile Ile Ile Leu Asp Glu
115 120 125
Pro Thr Ala Gly Leu Asp Pro Gly Ser Arg Arg Asp Val Trp Asn
130 135 140
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Leu His Ser Thr Gly Leu Trp Asn Met Gln His Glu Leu Ala Arg
1 5 10 15
Asn Leu Ser Gly Gly Leu Ala Arg Arg Leu Cys Val Ala Leu Ala Phe
20 25 30
Val Gly Gly Ser Lys Leu Ile Ile Leu Asp Glu Pro Thr Ser Ser Val
35 40 45
Asp Pro Val Ala Arg Arg Ser Ile Trp Asp Leu Ile Val Lys His Lys
50 55 60
Ala Ser Arg Thr Val Leu Leu Thr Thr His His Leu Asp Glu Ala Asp
65 70 75 80
Ile Leu Ser Asp Gln Val Ser Val Ile His Arg Gly Lys Leu Leu Cys
85 90 95
Ser Gly Ser Pro Leu Leu Leu Arg Ser Lys Tyr Gly Cys Gly Tyr Gln
100 105 110
Leu Thr Val Ser Arg Gln Cys Val Arg Ser Asp Glu Lys Glu Phe Lys
115 120 125
Asp Glu Asp Ser Gly Arg Ala Ser Cys Glu Pro Pro His Gly His Asp
130 135 140
Met Leu Thr Ser Asp Ser Asp Arg Leu Ile Ala Phe Ile Lys Cys Leu
145 150 155 160
Ile Pro Asn Ala Thr Leu Val Glu Asp His Ser Ala Asn Glu Val Ile
165 170 175
Leu Ala Leu Pro Arg Thr Gly Pro Asp Gly Ser Val His Asp Tyr Ala
180 185 190
Thr Phe Phe Arg Cys Leu Asp Ala Asn Ile His Thr Leu Gly Phe Gly
195 200 205
Ser Tyr Gly Leu Ser Ser Thr Thr Leu Glu Glu Val Phe Leu Thr Leu
210 215 220
Cys Asn Ser Glu Glu Ser Gly Ile
225 230
<210> 4
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Val Phe Ser Trp Tyr Asp Ser Met Ala Tyr Leu Gly Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Glu Asp Val Trp His Leu Pro Glu Asp Asn Arg Ser
20 25 30
Arg Asn Val Phe Ile Arg Phe Arg Gln Tyr Leu Asn Ser Ser Lys Asp
35 40 45
Cys Val Pro Ile Lys Glu Asn Pro Glu Lys Arg Gly Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Thr Asn Tyr Ser Ile Leu Tyr Asn Pro Lys Phe Asp Ile Leu Lys Thr
65 70 75 80
Leu Ile Arg Gly Phe Trp Val Asn Leu Leu Ala Cys Ser Thr Leu Lys
85 90 95
Phe Ile Ser Ser Phe Leu Thr Phe Ala Asn Pro Ser Leu Leu Asp Lys
100 105 110
Leu Leu Ser Phe Val Lys Ser Ser Asp Pro Gln Trp Gln Gly Tyr Met
115 120 125
Ile Ala Leu Ala Met Leu Ala Phe Ser Leu Leu Gln Ser Leu Ile Asp
130 135 140
Gly Gln Tyr Glu Phe Trp Ile Ser Val Leu Gly Leu Arg Met Lys Ser
145 150 155 160
Ala Met Val Gly Thr Ile Tyr Gln Lys Ser Leu Lys Leu Ser Ser Glu
165 170 175
Gly Arg Lys Ala Phe Thr Thr Gly Glu Ile Val Asn Leu Met Gly Val
180 185 190
Asp Thr Asn Arg Val Phe Met Phe Ile Asn Gln Tyr Asn Phe Leu Leu
195 200 205
Ser Phe Pro Ile Gln Leu Gly Met Ser Leu Lys Leu Leu Trp Asp Gln
210 215 220
Ile Gly Val Ser Ser Val Gly Gly Leu Ile Phe Met Leu Leu Leu Ile
225 230 235 240
Pro Phe Asn Gly Trp Val Ala Val Lys Met Lys Asn Ile Gln Arg Asn
245 250 255
Val Met Lys Gln Lys Asp Arg Arg Thr Lys Thr Met Asn Glu Ile Leu
260 265 270
Asn Gly Met Lys Val Leu Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Leu Ala Phe Gly
275 280 285
Asp Leu Ile Lys Asp Ala Arg Ala Ala Glu Ile Lys Ala Leu Lys Thr
290 295 300
Gln Ala Ile Phe Gly Ala Cys Thr Ser Phe Leu Phe Phe Ser Ala Pro
305 310 315 320
Phe Phe Val Ala Leu Ile Ser Phe Ala Thr Phe Val Leu Ser Asp Pro
325 330 335
Ala Asn Val Leu Asp Ala Asn Lys Ala Phe Val Ser Leu Thr Leu Phe
340 345 350
Asn Ile Leu Ser Gln Ser Leu Thr Met Leu Pro Arg Val Leu Thr Thr
355 360 365
Gly Ala Asn Cys Trp Val Ser Ile Lys Arg Ile Asn Lys Tyr Leu Arg
370 375 380
Gly Glu Glu Ile Asp Leu Ser Leu Val Gly His Asp His Asp Lys Asp
385 390 395 400
Thr Pro Ile Ser Ile Lys
405
<210> 5
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Thr Asn Ile Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Thr Ile Ala Leu Thr Ile
1 5 10 15
Trp Cys Leu Thr Arg Asn Ile Ala Phe Phe Ala Ala Cys Met Lys Ala
20 25 30
Ser Ile Lys Leu His Asp Asn Leu Phe Lys Ala Val Val Arg Ala Pro
35 40 45
Ile Ser Phe Phe Asp Asn Asn Pro Pro Gly Ile Ile Leu Asn Arg Val
50 55 60
Ser Arg Asp Met Gly Met Val Asp Asp Phe Leu Pro Ala Thr Met Phe
65 70 75 80
Asp Thr Leu Phe Cys Leu Ser Thr Cys Ala Gly Gln Ile Ile Leu Met
85 90 95
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