阅读说明：本技术 适合加工弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦及其培育方法 (High-protein weak gluten wheat suitable for processing weak gluten food and cultivation method thereof ) 是由 柴建芳 周硕 王海波 赵和 吕孟雨 董福双 刘永伟 杨帆 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种适合加工蛋糕、饼干等弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦,其种子的蛋白质含量虽然高于12%,但湿面筋含量和稳定时间均符合弱筋小麦品种的要求并能加工出优质蛋糕和饼干。本发明还涉及上述小麦的培育方法,为用高蛋白小麦加工弱筋类食品提供了一条新途径。(The invention provides a high protein weak gluten wheat suitable for processing weak gluten foods such as cakes, biscuits and the like, wherein the protein content of seeds is higher than 12%, but the wet gluten content and the stabilization time both meet the requirements of weak gluten wheat varieties and can be used for processing high-quality cakes and biscuits. The invention also relates to a cultivation method of the wheat, and provides a new way for processing weak gluten foods by using high-protein wheat.)

适合加工弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦及其培育方法

技术领域

本发明属于植物选育技术领域，具体涉及一种适合加工弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦及其培育方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，消费需求日趋多元化，对蛋糕、饼干等弱筋食品的需求也逐渐增加，目前国内的弱筋专用小麦尚不能满足国内需求，每年仍需从国外大量进口，因此，急需培育能加工优质弱筋食品的小麦品种。

弱筋小麦品种在我国《主要农作物品种审定标准（国家级）》中要求粗蛋白质含量低（<12%）、湿面筋含量低（<24%）、面筋强度弱（温定时间<3分钟）。弱筋小麦品种由于蛋白质含量较低（其加工得到的低筋面粉粗蛋白小于9.5%）、筋度弱，常用来制作口感柔软、组织疏松的蛋糕、酥性饼干等弱筋类食品。

小麦1B/1R易位系由于具有高产和适应性广等优点，目前在我国的小麦生产中被广泛应用，但这类品种加工品质往往比较差。研究发现，小麦1B/1R易位系1RS染色体臂上的ω-黑麦碱基因被认为是导致面团加工品质差的重要原因，为消除ω-黑麦碱基因的不良影响，在前期工作中我们构建了ω-黑麦碱基因的种子特异性表达载体（启动子来自小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因）并对小麦1B/1R易位系进行了遗传转化，在得到的转基因株系中，部分株系面筋强度明显提高（体现在沉淀值和稳定时间明显提高），但也有部分株系面筋强度明显下降（见专利ZL201710208793.X），这些面筋强度明显降低的株系稳定时间虽然符合弱筋小麦的要求（<3分钟），但由于其蛋白质含量较高（>14%，明显高于弱筋小麦品种对蛋白质含量的要求），按着目前的认知，这类株系并不适合加工蛋糕、饼干等弱筋类食品。

发明内容

本发明的目的是提供一种粗蛋白质含量高且适合加工弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦及其培育方法。

本发明采用如下技术方案：

一种适合加工弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦，其粗蛋白质含量为12%-18%、湿面筋含量为18%-24%、稳定时间小于3分钟。

进一步的，其小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因和ω-醇溶蛋白基因均沉默。

一种上述高蛋白弱筋小麦的培育方法，向受体小麦中转入干扰基因表达盒，沉默小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因和ω-醇溶蛋白基因。

培育方法中，所述干扰基因表达盒由小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子、ω-黑麦碱基因干扰片段和水稻Waxy基因终止子依次连接组成。

培育方法中，所述小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子包括如SEQ ID NO.1所示序列。

培育方法中，所述水稻Waxy基因终止子包括SEQ ID NO.2所示序列。

培育方法中，所述ω-黑麦碱基因干扰片段包括SEQ ID NO.3所述序列。

培育方法中，利用基因枪介导或农杆菌介导的方法向受体小麦中转入干扰基因表达盒。

一种上述适合加工弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦在加工弱筋类食品中的应用。

本发明的有益效果在于：用本发明的方法对1B/1R易位系小麦进行了品质改良，在得到的多个ω-醇溶蛋白基因与ω-黑麦碱基因均高度沉默的转基因株系中，小麦高分子量麦谷蛋白7亚基在转基因株系中也被高度沉默。在对株系进行进一步的实验过程中，意外的发现，小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因和ω-醇溶蛋白基因均沉默的转基因株系虽然蛋白质含量均高于14%（达到强筋小麦的标准），但其湿面筋含量和稳定时间均显著降低，湿面筋含量由对照的32.2%降到了22%以下，稳定时间由对照的3.4分钟降到了2.5分钟以下，特别是用其做蛋糕和饼干加工试验，蛋糕评分由对照的75分提高到87分以上，饼干评分由对照的76.7分提高到86分以上，克服了本领域一般认知的只有低蛋白小麦才可以加工优质弱筋食品的技术偏见，用高蛋白（>14%）小麦也加工出了优质的蛋糕和饼干（评分在80分以上为合格）。

附图说明

图1是用SDS-PAGE对5个纯合转基因株系进行的麦谷蛋白表达情况检测结果。

图1中KN199为受体品种科农199，#8-2、#8-6、#13-3、#13-5和#13-7为5个纯合转基因株系，Ax1、Bx7、By9、Dx2和Dy12为不同的高分子量麦谷蛋白亚基。

具体实施方式

实施例1 小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子和水稻Waxy基因终止子的克隆

根据NCBI数据库中小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子的序列（序列号DQ119142.1）设计PCR扩增引物对，Bx7-f1：acgtaagctttggaggccagggaaagacaatg（划线部分为添加的Hind III酶切位点, Bx7-r1：actccccgggctgtcagtgaattgatctgtag（划线部分为添加的Sma I酶切位点），扩增区段为翻译起始密码子ATP上游-10bp至-970bp，长度为961bp。以小麦品种藁城8901的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增选用保真性好的PfuTaq酶，扩增参数为：94℃5min分钟，94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环，72℃7min；根据NCBI数据库中水稻Waxy基因终止子的序列（序列号X53694.1）设计PCR扩增引物对，WxT-f1：tgaagagctcgagatctacatatggagtgat（划线部分为添加的Sac I酶切位点,WxT-r1：tagtgaa ttcgtatccactccctccgtcacat（划线部分为添加的EcoR I酶切位点）,扩增区段为终止密码子TGA下游8-798bp，长度791bp，以水稻品种中花3号的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的退火温度为56℃，其它扩增参数与扩增小麦启动子相同。2种PCR产物纯化后进行克隆测序，从中各选出1个分别与NCBI数据库中序列号为DQ119142.1和X53694.1序列一致的克隆用于下一步的载体构建。

实施例2 种子特异型ω-黑麦碱基因沉默表达载体的构建

在我们以前的专利中已构建了由组成型Ubi启动子驱动的ω-黑麦碱基因沉默表达载体pAHC25-Sec（ZL201010532880.9），其中的黑麦碱基因RNA干扰片段“正向黑麦碱片段-内含子片段-反向黑麦碱片段”（936bp）两端的酶切位点分别为Sma I和Sac I。为构建种子特异型黑麦碱基因沉默表达载体，首先以pAHC15（Christensen AH和Quail PH,TransgenicResearch, 1996, 5:213-218）做基础表达载体，依次通过Hind III/Sma I、Sma I/Sac I和Sac I/EcoR I双酶切，分别把pAHC15中的Ubi启动子、Gus基因和Nos终止子换成小麦的Bx7启动子、黑麦碱基因RNA干扰片段和水稻的Wax终止子，得到过渡性种子特异型ω-黑麦碱基因沉默表达载体pAHC15-Bx7-Sec-Wx。该表达载体用Hind III/EcoR I双酶切后得到的沉默黑麦碱基因的线性表达盒片段Bx7-Sec-Wx与剩下的载体片段大小相近，均为3kb左右，进一步用Hind III/EcoR I双酶切上述过渡性载体，酶切片段纯合后用PCR在72℃延伸10 min的方法补平粘性末端，之后将其克隆到pEASY-T5 Zero载体上（载体大小约4kb，由北京全式金生物技术有限公司提供），得到新的的沉默表达载体pEASY-Bx7-Sec-Wx。

实施例3 基因枪共转化

为避免转基因小麦中带有表达载体骨架中的抗生素基因，目标基因和植物抗性筛选基因均用线性表达盒片段进行基因枪共转化，目标基因线性表达盒片段用Hind III/EcoR I双酶切表达载体pEASY-Bx7-Sec-Wx，回收约3kb线性片段Bx7-Sec-Wx；植物抗性筛选基因Bar基因的线性表达盒用PCR扩增的方法获得，所用Taq酶为保真性好的PrimeSTAR HS DNAPolymerase（宝生物工程（大连）有限公司），模板DNA为pAct+Bar+Nos质粒（质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供），引物组合为T7/SP6，扩增程序：95℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。目标基因的线性表达盒与抗性筛选基因的线性表达盒经浓缩纯合后使其浓度达到1 ug/uL，然后进行基因枪共转化。

实施例4 抗性再生植株的分子检测以及纯合转基因株系中ω-黑麦碱基因的沉默情况检测

当T₀代转基因小麦植株生长至４~５片叶时，用CTAB法提取小麦叶片的基因组DNA，进行转化植株的PCR检测。检测引物为WxT/f2：GTTGTACTCTTCTGGGTGTGC和WxT/r2：GTCAAACTACTGCTCCTTCAAAC，检测引物的扩增区域为表达盒的终止子区域，扩增片段大小为423 bp；PCR扩增程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃10 min。阳性转基因植株进一步扩繁和分子检测，从中筛选纯合转基因株系并对其中的ω-黑麦碱基因沉默情况进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

在10个纯合转基因株系中，有7个ω-黑麦碱基因和ω-醇溶蛋白基因均高度沉默（见专利ZL201710208793.X中的附图），其中2个转基因株系#8-2和#8-6高分子量麦谷蛋白7亚基也被高度沉默（见图1）。

实施例5 纯合转基因株系的品质测定

对ω-黑麦碱基因、ω-醇溶蛋白基因和高分子量麦谷蛋白7亚基基因均高度沉默的2个转基因株系在河北省农作物品种品质测试中心进行了加工品质参数测定，与受体品种科农199相比，2个转基因株系的蛋白质含量与对照科农199相当，但其湿面筋含量和稳定时间均显著降低，其蛋糕评分由对照的75分提高到了87分以上，饼干评分由对照的76.7分提高到了86分以上（结果见表1），这突破了本领域对于弱筋食品加工的一般认识，说明这类转基因株系虽然蛋白质含量较高（达到强筋小麦的指标），其同样能够加工出优质的蛋糕和饼干，这为高蛋白小麦（>14%）加工优质弱筋食品开辟了一条新途径。

除了用科农199做转化受体以外，我们还利用上述培育方法对扬97-65做了转化，也得到了小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因与ω-醇溶蛋白基因高度沉默的转基因株系，在春播条件下其蛋白质含量高达17%以上，但其湿面筋含量和稳定时间均符合弱筋小麦品种的要求，用该株系小麦种子制作蛋糕和饼干，评分均不低于80分，说明该方法具有普遍适用性。

表1 部分转基因株系加工品质参数测定

。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省农林科学院遗传生理研究所（河北省农林科学院农产品质量安全研究中心）

<120> 适合加工弱筋类食品的高蛋白弱筋小麦及其培育方法

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgtaagctt tggaggccag ggaaagacaa tg 32

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgaagagctc gagatctaca tatggagtga t 31

<210> 3

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccttcctcat ctttgtcctc gccatgacga tgagcatcat cactaccgct aggcagctaa 60

accctagcga acaagagttg caatcaccac aacaaccagt tccaaaagaa caatcatatc 120

cgcagcaacc atatccctca caccaaccat ttcccacacc gcaacaatat tccccctatc 180

aaccacagca accatttccc caaccccaac aaccaacccc catacaacca caacaaccat 240

tcccccagca accccaacaa cctttccccc agccccaaca acaattaccc ttgaaaccac 300

aacaaccatt tccccagccc caacagccaa ttccccagca acaacaacaa tcgttcccgc 360

aacaacccca gagaccagag cggatccggc ggcctcggcg acgtcctcgg gggcctcccc 420

ccagccatgg ccgtaagcta gctagctagc accactgtct tctgataatg tttcttcttg 480

cagccagcca tgcctgccat tacaagttta caactgatgc tgtgtctgca ggccaacggt 540

caccgggttc tagaagctct ggtctctggg gttgttgcgg gaacgattgt tgttgttgct 600

ggggaattgg ctgttggggc tggggaaatg gttgttgtgg tttcaagggt aattgttgtt 660

ggggctgggg gaaaggttgt tggggttgct gggggaatgg ttgttgtggt tgtatggggg 720

ttggttgttg gggttgggga aatggttgct gtggttgata gggggaatat tgttgcggtg 780

tgggaaatgg ttggtgtgag ggatatggtt gctgcggata tgattgttct tttggaactg 840

gttgttgtgg tgattgcaac tcttgttcgc tagggtttag ctgcctagcg gtagtgatga 900

tgctcatcgt catggcgagg acaaagatga ggaagg 936