阅读说明：本技术 具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法及其应用 (Preparation method and application of tuberculate speranskia herb lignan with nerve cell protection activity ) 是由 刘学贵 张立新 高品一 李丹琦 岳丹丹 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法及其应用,涉及一种天然药物制备方法及其应用,本发明透骨草木脂素的提取、分离和纯化等工艺的简要过程：首先从干燥的透骨草全草中得到醇提浸膏,经水分散后,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,萃取液经减压浓缩后得到石油醚萃取物,乙酸乙酯萃取物,水层萃取物。取乙酸乙酯萃取物,经硅胶柱色谱、MCI柱色谱、开放ODS柱色谱、凝胶柱色谱以及高效液相色谱分离纯化后,收集得到4个木脂素化合物1-4。上述木脂素均具神经细胞保护活性,其中化合物2和4相比较阳性对照药维生素E具有显著的神经细胞保护活性。本发明为透骨草木脂素治疗神经退行性疾病的药品开发奠定了基础。(The invention discloses a preparation method and application of tuberculate speranskia herb lignan with nerve cell protection activity, and relates to a preparation method and application of a natural medicine, wherein the simple processes of extraction, separation, purification and other processes of the tuberculate speranskia herb lignan comprise the following steps: firstly, an alcohol extract is obtained from dried garden balsam stem whole grass, after water dispersion, petroleum ether and ethyl acetate are used for extraction in sequence, and after the extract liquid is decompressed and concentrated, a petroleum ether extract, an ethyl acetate extract and a water layer extract are obtained. Separating and purifying the ethyl acetate extract by silica gel column chromatography, MCI column chromatography, open ODS column chromatography, gel column chromatography and high performance liquid chromatography, and collecting to obtain 1-4 lignan compounds. The lignans all have nerve cell protective activity, wherein the compounds 2 and 4 have obvious nerve cell protective activity compared with the positive control medicament vitamin E. The invention lays a foundation for the development of the medicine for treating neurodegenerative diseases by using the speranskia tuberculata lignan.)

具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种天然药物制备方法及其应用，特别是涉及一种具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法及其应用。

背景技术

透骨草（Phryma leptostachya L.）也被称为药曲草，蝇毒草，为透骨草科透骨草属多年生草本植物。透骨草味道苦涩，喜阴，适应性较强，移植易成活，生长迅速，广泛种植在我国东北、华北及长江流域各地。透骨草各个部位皆可入药，可以杀死菜青虫，有抗炎，杀菌作用，适用一般疮癣肿毒。透骨草也可以治疗风湿疼痛，肿毒初起，风湿性关节炎等症状。

透骨草木脂素是从透骨草全草中提取得到的木脂素，已经被证明具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎的作用，而且对机体的不良反应非常小。因此，深度开发透骨草中木脂素资源，并系统研究其结构和药理活性，对于透骨草的深加工及其在医药等领域的广泛应用，具有重大的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法及其应用，本发明采用色谱分离法对透骨草全草分离得到透骨草木脂素，并对其神经细胞保护活性进行研究，结果表明透骨草木脂素具有一定的神经细胞保护活性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法，所述方法包括以下制备过程：

取干燥的透骨草全草，用乙醇-水溶液回流提取2～6次，每次4～10 h，合并提取液减压浓缩后得到总浸膏。所得浸膏经水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液经减压浓缩后得到石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，水层萃取物。取乙酸乙酯萃取物，经硅胶柱色谱、MCI柱色谱、开放ODS柱色谱、凝胶柱色谱以及高效液相色谱分离纯化后，得到4个木脂素化合物1-4。

所述的具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法，所述取乙酸乙酯萃取物，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（100:1 - 0:1）系统梯度洗脱，得到6个流分（Fr.1- Fr.6）。

所述的具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法，所述其中Fr.4馏分经过硅胶减压柱色谱、MCI柱色谱、开放ODS柱色谱、凝胶柱色谱以及高效液相色谱分离和纯化得到化合物1、化合物2、化合物3、化合物4。

具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素应用，所述透骨草木脂素，使用H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞作为生物活性测定的模型，并使用MTT测定方法评估透骨草木脂素的神经细胞保护活性；透骨草木脂素适宜于治疗神经退行性疾病的药品开发。

所述的具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素应用，所述神经细胞保护活性比较表明，与对照药维生素E相比，化合物2和4具有显著的神经细胞保护活性。

所述的具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素应用，所述当化合物2和化合物4的浓度达到50 μmol/L时，SH-SY5Y细胞的存活率分别为81.68%和93.19%。

本发明的优点与效果是：

本发明采用色谱分离法对透骨草全草分离得到透骨草木脂素，并对其神经细胞保护活性进行分析，结果表明透骨草木脂素具有神经细胞保护活性。本发明为透骨草木脂素治疗神经退行性疾病的药品开发奠定了基础。

附图说明

图1是化合物1的¹H-NMR图谱；

图2是化合物1的¹³C-NMR图谱；

图3是化合物2的¹H-NMR图谱；

图4是化合物2的¹³C-NMR图谱；

图5是化合物3的¹H-NMR图谱；

图6是化合物3的¹³C-NMR图谱；

图7是化合物4的¹H-NMR图谱；

图8是化合物4的¹³C-NMR图谱；

图9是透骨草木脂素化合物1-4对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞神经保护活性。

具体实施方式

下面结合附图所示实施例对本发明进行详细说明。

下面通过具体实施例对本发明进行说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 透骨草木脂素的提取分离

透骨草全草10 kg用体积分数为50～80 %的乙醇溶液回流提取2～6次，每次3～10 h，合并提取液减压浓缩后得到总浸膏2.3 kg。所得浸膏经水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液经减压浓缩后得到石油醚萃取物48.3 g，乙酸乙酯萃取物350.6 g，水层萃取物1.1 kg。取乙酸乙酯萃取物350.6 g，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（100:1 - 0:1）系统梯度洗脱，得到6个流分（Fr.1 - Fr.6）。其中Fr.4馏分经过硅胶减压柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（100:1 - 0:1）系统梯度洗脱，得到3个流分（Fr.4A - Fr.4C）。其中流分Fr.4A和Fr.4B经MCI柱色谱、开放ODS柱色谱、凝胶柱色谱以及高效液相色谱分离和纯化得到化合物1（8.0 mg）、化合物2（10.4 mg）、化合物3（8.2 mg）和化合物4（25.6 mg）。

实施例2 透骨草木脂素对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞神经保护活性

SH-SY5Y细胞传代的常规培养以后，96孔板上接种，在37 ^oC下、用5% CO₂在培养箱中静置培养24 h，直至细胞贴到壁上。将浓度为25，50，100 μmol/L 的样品分别加入96孔板，放置在培养箱中培养1 h，再加入850 μmol/L的H₂O₂作用4 h，然后加入MTT培养3.5 h，加入DMSO培养3.5 h，最后用酶标仪在490 nm波长下测各孔的吸光度。阴性对照组：细胞在传代进行常规培养，在96孔板接种之后，不用H₂O₂及药物处理，其它的实验步骤和给药组是完全相同的。阳性对照组：用维生素E(Trolox)为阳性对照药来替换给药组中的药物，其它的实验步骤和给药组完全相同。空白对照组：96孔内不接种细胞，不用H₂O₂及药物处理，其它的实验步骤和给药组完全相同。

存活率(%)=[A₄₅₀(给药组)-A₄₅₀(空白对照)]/[A₄₅₀(阴性对照)-A₄₅₀(空白对照)]×100%；

由图9可知，H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞的存活率为61 %。相比于阳性对照药维生素E的细胞存活率(76.55%, 50 μM)，化合物2和化合物4的浓度达到50 μmol/L时，SH-SY5Y细胞的存活率分别为81.68%和93.19%。